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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ein Protokoll für die räumliche Heterogenitäten der Ionensignale in der MALDI-Massenspektrometrie Reduzierung von Substrattemperatur während der Probentrocknungsprozesse regulieren demonstriert.

Zusammenfassung

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. The heterogeneity of ion signals is a severe problem in MALDI, which results in poor data reproducibility and makes MALDI unsuitable for quantitative analysis. By regulating sample plate temperature during sample preparation, thermal-induced hydrodynamic flows inside droplets of sample solution are able to reduce the heterogeneity problem. A room-temperature sample preparation chamber equipped with a temperature-regulated copper base block that holds MALDI sample plates facilitates precise control of the sample drying condition. After drying of sample droplets, the temperature of sample plates is returned to room temperature and removed from the chamber for subsequent mass spectrometric analysis. The areas of samples are examined with MALDI-imaging mass spectrometry to obtain the spatial distribution of all components in the sample. In comparison with the conventional dried-droplet method that prepares samples under ambient conditions without temperature control, the samples prepared with the method demonstrated herein show significantly better spatial distribution and signal intensity. According to observations using carbohydrate and peptide samples, decreasing substrate temperature while maintaining the surroundings at ambient temperature during the drying process can effectively reduce the heterogeneity of ion signals. This method is generally applicable to various combinations of samples and matrices.

Einleitung

Mass spectrometry (MS) is one of the most important analytical techniques for analyzing the molecular compositions of complex samples. Among all the ionization methods used in MS, matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) is the most sensitive and widely used method in bioanalytical applications.1 In comparison to other ionization techniques, MALDI has the highest sensitivity and high tolerance to salt contaminants. Such analytical properties make MALDI the first choice for carbohydrate analysis and many proteomics applications. However, sample preparation is a crucial step for obtaining high quality data in MALDI-MS.

The most commonly used sample preparation method for MALDI-MS is the dried-droplet method, in which sample droplets are deposited on a surface and dried under ambient conditions. This drying method is simple and generally effective.2-5 However, a common problem in the dried-droplet method is that the resultant analyte/matrix crystals normally distribute irregularly. In many cases, the crystals aggregate at the periphery of sample areas, resulting in the so-called ring-stain formation.6-8 The heterogeneous crystal morphologies affect the spatial distribution of analyte molecules, which results in severe fluctuation in ion signal over sample areas. Such severe signal fluctuations and poor data reproducibility are known as the "sweet spot" problem in MALDI-MS.9 Thus, there is a great need for reducing spatial heterogeneities in MALDI-MS dried droplet applications.

Hydrodynamic flows in the sample droplet play an important role in determining the spatial distribution of samples prepared with the dried-droplet method.10-12 It was found that the evaporation of solvent induces outward capillary flows within droplets, which are responsible for the ring-stain formation.7,10 In contrast, recirculation flows induced by tangential surface-tension gradients may counterbalance the outward capillary flows.13 If the recirculation flow speeds are higher than that of the outward capillary flows, the samples can be efficiently redistributed to reduce the heterogeneity problem.14

In this work, we demonstrate a detailed protocol for preparing samples with a simple drying chamber to induce efficient recirculation flows during droplet drying processes. Droplet drying conditions are precisely controlled, including the temperatures of the sample plate and its surroundings, and the relative humidity within the chamber. The model analytes include maltotriose and bradykinin chain (1-7). The matrix used for the demonstration is 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP). The samples are examined with time-of-flight (TOF) MS, and the data are analyzed quantitatively to show the reduction of heterogeneity.

Protokoll

Hinweis: Dieses Protokoll zur Reduzierung der räumlichen Heterogenität Maltotriose und Bradykinin-Fragment (1-7) hergestellt, mit dem getrockneten Tröpfchen Verfahren entwickelt wird. Das Protokoll besteht aus drei Hauptschritte, einschließlich der Vorbereitung und Präkonditionierung, Probenablage und Trocknung und Massenspektrometrie Datenanalyse. Die Verfahren werden beschrieben und im Folgenden näher beschrieben:

1. Vorbereitung und Präkonditionierung

  1. Reinigen der Probenplatte
    1. Tragen Sie Handschuhe aus Nitril und Hand waschen Sie die Probenplatte vorsichtig mit Reinigungsmittel und destilliertem entionisiertem Wasser (DDW).
    2. Spülen Sie die Probenplatte mit Methanol (MeOH) und DDW.
    3. Legen Sie die Probenplatte in einem 600-ml-Becher und füllen mit DDW.
    4. Beschallen die Probenplatte in DDW für 15 min in einem Ultraschallbad (200 W, 40 kHz).
    5. Entfernen DDW aus dem Becher und füllen Sie den Becher mit MeOH.
    6. Beschallen die Probenplatte in MeOH für 15 min im Ultraschallbad (200 W, 40 kHz).
    7. Brennen Sie die Lösungsmitteltropfen auf der Platte mit Stickstoffgas ab und halten Sie die Probenplatte trocken vor der Probenabscheidung.
  2. Die Regulierung Trockenkammer Temperatur
    . HINWEIS: Die Trockenkammer ist ein 35 x 20 x 45 cm 3 (B x T x H) Acryl-Kammer Abbildung 1 zeigt das Bild dieses Trocknungssystems. Die Kammer wird mit Raumtemperatur Stickstoffgas durch einen Gasdurchflussmesser bei einer konstanten Strömungsgeschwindigkeit gespült eine niedrige relative Feuchtigkeitsbedingung durch eine geeichte Hygrometer innerhalb der Trocknungskammer eingebaut überwacht aufrechtzuerhalten. Ein Kupferbasisblock in der Trocknungskammer mit einer programmierten konstanten Temperatur Wasser Zirkulator ausgestattet wird verwendet Edelstahlprobenplatten aufzunehmen. Die Kupferbasisblock kann die Probenplatte Temperatur 5-25 ° C zu regulieren. Die Temperaturen der Luft, Kupferbasisblock und der Probenplatte werden durch K-Typ-Thermoelemente überwacht.
    1. Öffnen Sie die Tür und legte schnell die Probenplatte auf dem KupferBasisblock schließen Sie die Tür.
    2. Manuelle Einstellung der Gasdurchflussmesser der Stickstoffvolumenstrom bis 10 Standard-Kubikfuß pro Stunde (SCFH) einzustellen.
    3. Überwachung der relativen Feuchtigkeit in der Trockenkammer durch das Hygrometer und Feinabstimmung der Gasdurchflussmesser die relative Feuchtigkeit ist immer unter 25% zu gewährleisten.
    4. Überwachen Sie die Temperatur der Probenplatte durch K-Typ-Thermoelemente und stellen Sie die Wasser Zirkulator Temperatur manuell, bis die Probenplatte erreicht 5 ° C für das Experiment oder Raumtemperatur (25 ° C) für die Steuerung.
      HINWEIS: Um die Probenplatte bei einer Temperatur ausgelegt, die Wassertemperatur Zirkulator wird typischerweise 0 bis 5 ° C niedriger als die vorgesehene Probe eingestellt zu stabilisieren. Beispielsweise 5 ° C an der Probenplatte zu erhalten, ist die Temperatureinstellung des Wassers Zirkulators im Bereich von 0 bis 2 ° C; der Probenplatte bei 25 ° C, die Temperatureinstellung des Wassers Zirkulator liegt im Bereich von 23 bis 25 ° C zu halten.
    5. Achten Sie darauf , die erforderlichen Temperaturen und die relative Luftfeuchtigkeit erreicht werden (Tabelle 1) vor der Probenabscheidung.
      HINWEIS: Alle Parameter sowie deren Einstellwerte für die Trocknungsverfahren mit unterschiedlichen Probenplattentemperaturen sind in Tabelle 1 gezeigt.
      HINWEIS: Bei einer niedrigen Probenplattentemperatur, Wasserkondensation auf der Probenplatte auftreten können, wenn die Kammertür für eine lange Zeit offen ist. Wenn Wasserkondensation auftritt, schließen Sie die Tür und DO Anzahlung nicht jede Probe auf, bis Kondensation von Wasser ausgetrocknet ist.
  3. Herstellung von Matrix und Analytlösungen
    1. Herstellung von Matrixlösungen
      1. Bereiten 0,1 M THAP-Lösung mit 50% Acetonitril (ACN): 50% wässrige Lösung DDW.
    2. Präparation von Analyten
      1. Bereiten 10 -4 M Maltotriose Lösung mit DDW.
      2. Bereiten Sie 10 -5 M Bradykinin - Fragment (1-7) Lösung in 50% Acetonitril(ACN): 50% wässrige Lösung DDW.

2. Probenabscheidung und Trocknung

  1. Premix 0,25 ul 0,1 M THAP Lösung und 0,25 ul 10 -4 M Maltotriose oder 10 -5 M Bradykinin - Fragment (1-7) Lösungen in einem Reaktionsgefäß.
  2. Vortex die gemischte Lösung für 3 Sekunden.
  3. Zentrifugieren der gemischten Lösung für 2 sec (2,000 xg), um die Lösung am Boden des Zentrifugenröhrchens zu sammeln.
  4. Öffnen Sie die Tür der Trocknungskammer, deponieren sorgfältig 0,1 ul der Lösung auf der Probenplatte mit Pipette und schließen Sie sofort die Tür.
  5. Warten Sie auf die Probe Tröpfchen zu trocknen.
    . HINWEIS: Die typischerweise beobachtet Trocknungszeiten mit unterschiedlichen Probenplattentemperaturen in aufgeführt sind Tabelle 1 Für die Probenplattentemperatur von 5 ° C, die durchschnittliche Trocknungszeit beträgt 800 bis 1000 sec; für die Probenplattentemperatur von 25 ° C beträgt die durchschnittliche Trocknungszeit 100 bis 150 sec.
  6. Nach dem Trocknen die Tür öffnen, der Trocknungskammer.
  7. Stellen Sie den Wasser Zirkulator Temperatur auf Raumtemperatur (25 ° C).
    HINWEIS: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn die Probenplatte ständig bei Raumtemperatur (25 ° C) während des Trocknungsprozesses gehalten wird.
  8. Nach der Probenplatte Temperatur wieder auf Raumtemperatur (25 ° C), Entfernen von der Trocknungskammer, um die Probenplatte.
  9. Untersuchen Sie die Probenmorphologie unter einem 5fach-Stereomikroskop und einen Schnappschuss Hellfeldbild.
    HINWEIS: Wenn die Kristallmorphologien nicht erwartet werden, ist es notwendig, eine neue Probe mit dem gleichen Verfahren herzustellen. Typische Kristallmorphologien sind in den oberen Platten der Figur 2 gezeigt.
    HINWEIS: In den Fällen mit geringen Probenplattentemperaturen, wie 5 ° C, es ist wichtig, die Probenplatte auf Raumtemperatur aufwärmen, bevor es aus der Trocknungskammer nehmen. Wenn die Proben Ablagerung, halten Sie nicht die vorgemischten solution in der Spitze der Pipette über 10 sec. Sie nicht die vorgemischten Lösung wieder verwenden , nachdem die Proben abgeschieden werden . Die oberen Platten von 2 zeigen Hellfeld - Bilder von Proben hergestellt mit unterschiedlichen Probenplattentemperaturen.

3. Mass Spectrometry Datenanalyse

  1. Mass Spectrometry Datenerfassung
    HINWEIS: Nach der Zubereitung kann die Probe mit bildgebenden Massenspektrometrie analysiert werden. In der aktuellen Studie werden die Imaging - MS - Experimente durchgeführt , ein Labor gebauten Synchronized Dual-Polarität TOF mit (DP-TOF) Imaging - Massenspektrometer. 15 Handels MALDI-TOF - Massenspektrometer mit Imaging - Fähigkeit eignen sich auch für solche Experimente. Das Massenspektrometer wird in linearer Extraktion und positive Ionen-Modi mit optimierter Extraktions Verzögerungen betrieben. Die kinetische Energie der Ionen beträgt 20 kV. Der Laserstrahl Größe beträgt 35 & mgr; m im Durchmesser auf der Probenoberfläche, und das Spektrum von jedem Spot ist der aveWut von 5 Laserschüssen.
    1. Legen Sie die Probenplatte in das MALDI-Massenspektrometer.
    2. Führen Sie die Abbildung Massenspektrometrie-Analyse der Probe in Schritten hergestellt 2,1-2,9.
    3. Wählen Sie eine charakteristische Massenspitze aus der Massenliste im Ergebnisfenster angezeigt und klicken Sie auf "2D", um ein zweidimensionales Ionenbild zeichnen.
      HINWEIS: Bei Maltotriose gemischt mit THAP die charakteristischen Spitzen sind sodiated Maltotriose, protonierten THAP und sodiated THAP. Für Bradykinin-Fragment (1-7) mit THAP gemischt, umfassen die charakteristischen Peaks Bradykinin Fragment protoniert (1-7), protonierten THAP und sodiated THAP.
    4. Klicken Sie auf die Tasten zur Einstellung der im Popup-Fenster die oberen und unteren Grenzen der Signalintensität zu bestimmen, und klicken Sie auf "Bild speichern". Diese Einstellung definiert den Kontrast von Ionen Bilder.
      HINWEIS: In jedem einzelnen Satz von Daten, die gerissenen Bereiche und die Null-Punkte niedriger Helligkeit eliminiert zeigen.
    5. Bitte beachten und zu vergleichen, das IonBild mit dem Hellfeld-Bild, das in Schritt 2.9 gemacht.
      HINWEIS: Imaging-Massenspektrometrie und Konstruktion von Bildern von bestimmten Ionen können mit kommerziellen Geräten erreicht werden. Aufgrund der Vielzahl der Datenerfassung und Analyse-Software, sollten die Anwender Software-Anweisungen vom Instrument Anbieter bereitgestellten folgen Bilder von hoher Qualität zu erhalten.
  2. Datenanalyse
    HINWEIS: Die Heterogenität der Proben quantitativ analysiert. In dieser Demonstration wird jede Probe von Software im eigenen Haus entwickelt in mehrere konzentrische Bereiche unterteilt, die räumliche Verteilung der Ionen zu analysieren. Die Analyse kann auch eigenständige Datenanalyse-Software durchgeführt werden.
    1. Klicken Sie auf die Nullstellen und die gerissenen Bereiche in dem Ionenbild im Ergebnisfenster angezeigt zu unwichtigen Bereichen zu entfernen.
      Hinweis: Dieses Verfahren definiert die wesentlichen Bereich des Ionenbild.
    2. Klicken Sie die Schaltfläche "Kante finden", um die äußerste Schicht des Ionenbild zu finden.
    3. Klicken Sie auf "abziehen", um den Ionenfluss Informationen der äussersten Schicht in einer Datenbank zu speichern und diese Schicht aus dem Ionen Bild entfernen gleichzeitig. Ein Kontrollkästchen diese äußerste Schicht darstellt, wird in der "Ausgangsdaten" Liste des Ergebnisfensters angezeigt.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.2 und 3.2.3 bis das Zentrum des Ionenbild definiert ist.
    5. Klicken Sie auf und wählen Sie alle Kontrollkästchen in der "Ausgangsdaten" und klicken Sie auf "Export", um die Daten zu exportieren.
    6. Öffnen Sie die exportierten Daten Tabellenkalkulations-Software mit dem durchschnittlichen Ionenhäufigkeit jeder Schicht zu berechnen, die räumliche Verteilung Informationen von Ionen zu erhalten.

Ergebnisse

Die Hellfeld - Bilder sowie die MS Bilder von Maltotriose und Bradykinin - Fragment (1-7) hergestellt , mit Probenplattentemperatur von 5 und 25 ° C sind in 1 gezeigt. Im Fall der sodiated Maltotriose, das Ionensignal hauptsächlich bevölkert an der Peripherie des Gebietes Probe, wenn es mit einer Probe Plattentemperatur von 25 ° C hergestellt. die Probenplatte Temperatur auf 5 ° C, füllt das Signal homogen über die gesamte Probenfläche Durch die Verringerung. Der...

Diskussion

Basierend auf früheren theoretischen Vorhersagen, temperaturbedingten hydrodynamischen Strömungen innerhalb Tröpfchen nach außen Kapillare fließt überwinden durch Verdampfen des Lösungsmittels induziert. Die Effizienz solcher interne Rezirkulation von Molekülen wird erhöht, wenn die Temperatur innerhalb eines Tröpfchens Zunahme Steigungen. Entsprechend den vorhergesagten Ergebnissen, wenn die Probenplatte Temperatur unter 5 ° C gehalten wurde, während seine Umgebung bei Umgebungstemperatur gehalten wird, ist...

Offenlegungen

The authors declare no competing financial interest.

Danksagungen

This work is supported by the Genomics Research Center, Academia Sinica and the Ministry of Science and Technology of Taiwan, the Republic of China (Contract No. 104-2119-M-001-014).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Detergent powderAlconox242985
MethanolMerck106009
AcetonitrileMerck100003
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)Sigma-AldrichT64602 
Bradykinin fragment (1-7)Sigma-AldrichB1651
MaltotrioseSigma-Aldrich47884
Pipette tipsMettler Toledo17005091
Microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification systemMilliporeZMQS6VFT1
Powder-free nitrile glovesMicroflexSU-690
600 ml beakerDuran2110648
Ultrasonic cleanerDeltaDC300H
HygrometerWisewind5330
Nitrogen gas flowmeterDwyerRMA-6-SSV
K-type thermocouplesDigitron311-1670
CentrifugeSelect BioProductsForce Mini 
PipetteRaininpipet-lite XLS
StereomicroscopeOlympusSZX16
Temperature controllable drying chamberthis lab
Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS)this lab
MALDI-TOF stainless steel sample targetthis lab

Referenzen

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