Preparación de las muestras MALDI homogéneo para aplicaciones cuantitativas

Resumen

Un protocolo para la reducción de las heterogeneidades espaciales de las señales de iones en la espectrometría de masas MALDI mediante la regulación de la temperatura del sustrato durante el proceso de secado de la muestra se demuestra.

Resumen

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. The heterogeneity of ion signals is a severe problem in MALDI, which results in poor data reproducibility and makes MALDI unsuitable for quantitative analysis. By regulating sample plate temperature during sample preparation, thermal-induced hydrodynamic flows inside droplets of sample solution are able to reduce the heterogeneity problem. A room-temperature sample preparation chamber equipped with a temperature-regulated copper base block that holds MALDI sample plates facilitates precise control of the sample drying condition. After drying of sample droplets, the temperature of sample plates is returned to room temperature and removed from the chamber for subsequent mass spectrometric analysis. The areas of samples are examined with MALDI-imaging mass spectrometry to obtain the spatial distribution of all components in the sample. In comparison with the conventional dried-droplet method that prepares samples under ambient conditions without temperature control, the samples prepared with the method demonstrated herein show significantly better spatial distribution and signal intensity. According to observations using carbohydrate and peptide samples, decreasing substrate temperature while maintaining the surroundings at ambient temperature during the drying process can effectively reduce the heterogeneity of ion signals. This method is generally applicable to various combinations of samples and matrices.

Introducción

Mass spectrometry (MS) is one of the most important analytical techniques for analyzing the molecular compositions of complex samples. Among all the ionization methods used in MS, matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) is the most sensitive and widely used method in bioanalytical applications.¹ In comparison to other ionization techniques, MALDI has the highest sensitivity and high tolerance to salt contaminants. Such analytical properties make MALDI the first choice for carbohydrate analysis and many proteomics applications. However, sample preparation is a crucial step for obtaining high quality data in MALDI-MS.

The most commonly used sample preparation method for MALDI-MS is the dried-droplet method, in which sample droplets are deposited on a surface and dried under ambient conditions. This drying method is simple and generally effective.^2-5 However, a common problem in the dried-droplet method is that the resultant analyte/matrix crystals normally distribute irregularly. In many cases, the crystals aggregate at the periphery of sample areas, resulting in the so-called ring-stain formation.^6-8 The heterogeneous crystal morphologies affect the spatial distribution of analyte molecules, which results in severe fluctuation in ion signal over sample areas. Such severe signal fluctuations and poor data reproducibility are known as the "sweet spot" problem in MALDI-MS.⁹ Thus, there is a great need for reducing spatial heterogeneities in MALDI-MS dried droplet applications.

Hydrodynamic flows in the sample droplet play an important role in determining the spatial distribution of samples prepared with the dried-droplet method.^10-12 It was found that the evaporation of solvent induces outward capillary flows within droplets, which are responsible for the ring-stain formation.^7,10 In contrast, recirculation flows induced by tangential surface-tension gradients may counterbalance the outward capillary flows.¹³ If the recirculation flow speeds are higher than that of the outward capillary flows, the samples can be efficiently redistributed to reduce the heterogeneity problem.¹⁴

In this work, we demonstrate a detailed protocol for preparing samples with a simple drying chamber to induce efficient recirculation flows during droplet drying processes. Droplet drying conditions are precisely controlled, including the temperatures of the sample plate and its surroundings, and the relative humidity within the chamber. The model analytes include maltotriose and bradykinin chain (1-7). The matrix used for the demonstration is 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP). The samples are examined with time-of-flight (TOF) MS, and the data are analyzed quantitatively to show the reduction of heterogeneity.

Protocolo

NOTA: Este protocolo se ha desarrollado para la reducción de la heterogeneidad espacial de fragmento de maltotriosa y bradiquinina (1-7) preparada con el método de la gota se seca. El protocolo consta de tres pasos principales, incluyendo la preparación y acondicionamiento previo, la deposición de la muestra y secado, y el análisis de los datos de espectrometría de masas. Los procedimientos se describen y se describen en más detalle a continuación:

1. Preparación y acondicionamiento previo

1. Limpieza de la placa de muestras
   1. Use guantes de nitrilo y de la mano-lavar la placa de la muestra suavemente con detergente y agua destilada-desionizada (DDW).
   2. Enjuague la placa de la muestra con metanol (MeOH) y DDW.
   3. Inserte la placa de muestra en un vaso de 600 ml y se llenan de DDW.
   4. Sonicar la placa de muestra en DDW durante 15 minutos en un baño de ultrasonidos (200 W, 40 kHz).
   5. Retire DDW del vaso y llenar el vaso de precipitado con MeOH.
   6. Sonicar la placa de muestra en MeOH durante 15 minutos en el baño de ultrasonidos (200 W, 40 kHz).
   7. Soplar las gotas de disolvente en el plato con gas nitrógeno y mantener la placa de muestra seca antes de la deposición de la muestra.
2. Regulación de la temperatura cámara de secado
   NOTA:. La cámara de secado se encuentra a 35 x 20 x 45 cm ³ (W x D x H) acrílico cámara de la figura 1 se muestra la imagen de este sistema de secado. La cámara se purga con gas nitrógeno temperatura ambiente a través de un medidor de flujo de gas a un caudal constante para mantener una condición de baja humedad relativa controlada por un higrómetro calibrado instalado dentro de la cámara de secado. Un bloque a base de cobre en la cámara de secado equipado con un dispositivo de circulación de agua a temperatura constante programada se utiliza para alojar placas de muestra de acero inoxidable. El bloque de base de cobre es capaz de regular la temperatura de la placa de muestra de 5 a 25 ° C. Las temperaturas del aire, bloque a base de cobre, y la placa de muestra son controlados por termopares de tipo K.
   1. Abra la puerta y rápidamente poner la placa de la muestra sobre el cobrebloque de base y cierre la puerta.
   2. Para ajustar manualmente el medidor de flujo de gas para ajustar el caudal de nitrógeno a 10 pies cúbicos estándar por hora (SCFH).
   3. Controlar la humedad relativa en la cámara de secado por el higrómetro y afinar el medidor de flujo de gas para asegurar la humedad relativa es siempre por debajo de 25%.
   4. Controlar la temperatura de la placa de la muestra mediante termopares de tipo K y ajustar la temperatura de recirculación de agua manualmente hasta que la placa de la muestra alcanza los 5 ° C durante el experimento o la temperatura ambiente (25 ° C) para el control.
      NOTA: A fin de estabilizar la placa de muestra a una temperatura diseñado, la temperatura de recirculación de agua se fija típicamente 0-5 ° C más baja que la muestra diseñada. Por ejemplo, para mantener la 5 ° C en la placa de muestra, el ajuste de temperatura de la bomba de circulación de agua está en el intervalo de 0 a 2 ° C; para mantener la placa de muestra a 25 ° C, el ajuste de temperatura de la circulación de agua que se encuentra en el rango de 23 a 25 ° C.
   5. Asegúrese de que las temperaturas requeridas y la humedad relativa se alcanzan (Tabla 1) antes de la deposición de la muestra.
      NOTA: Todos los parámetros, así como sus valores de ajuste para los procesos de secado con diferentes temperaturas de la placa de muestra se muestran en la Tabla 1.
      NOTA: A una temperatura baja placa de la muestra, la condensación de agua en el plato de la muestra puede ocurrir si la puerta de la cámara está abierta durante mucho tiempo. Si se produce condensación de agua, cierre la puerta y NO deposite cualquier muestra en ella hasta que la condensación de agua se seca.
3. Preparación de la matriz y el analito Soluciones
   1. Preparación de las soluciones de la matriz
      1. Preparar una solución 0,1 M THAP con un 50% de acetonitrilo (ACN): DDW solución acuosa al 50%.
   2. Preparación de analitos
      1. Preparar 10 ^-4 M solución maltotriosa con DDW.
      2. Preparar 10 ^-5 fragmento bradiquinina M (1-7) en solución de 50% de acetonitrilo(ACN): 50% de solución acuosa DDW.

2. Deposición de la muestra y de secado

1. Premezcla de 0,25 l de solución THAP 0,1 M y 0,25 l de 10 ^-4 M maltotriosa o fragmento de la bradicinina 10 ^-5 M (1-7) soluciones en un tubo de microcentrífuga.
2. Vortex la solución mixta durante 3 s.
3. Centrifugar la solución mixta de 2 seg (2.000 xg) para recoger la solución en la parte inferior del tubo de centrífuga.
4. Abra la puerta de la cámara de secado, cuidadosamente depositar 0,1 l de la solución en la placa de muestra con la pipeta y cerrar la puerta inmediatamente.
5. Espere a que la gota de muestra se seque.
   . NOTA: Los tiempos de secado normalmente observadas con diferentes temperaturas de placa de muestra se enumeran en la Tabla 1 para la temperatura del plato de muestra de 5 ° C, el tiempo medio de secado es de 800 a 1.000 seg; para la temperatura de la placa muestra de 25 ° C, el tiempo medio de secado es de 100 a 150 sCE.
6. Después del secado, abrir la puerta de la cámara de secado.
7. Ajuste la temperatura de recirculación de agua a temperatura ambiente (25 ° C).
   NOTA: Omita este paso si la placa de muestra se mantiene constante a temperatura ambiente (25 ° C) durante el proceso de secado.
8. Después de que las muestras que la temperatura de la placa a temperatura ambiente (25 ° C), retire la placa de la muestra de la cámara de secado.
9. Examinar la morfología de la muestra bajo un microscopio estereoscópico 5X y tomar la imagen de campo brillante de una instantánea.
   NOTA: Si no son los esperados las morfologías de cristal, es necesario preparar una nueva muestra con el mismo procedimiento. Morfologías cristalinas típicas se muestran en los paneles superior de la Figura 2.
   Nota: en los casos con temperaturas de placa de muestra bajas, tales como 5 ° C, es importante calentar la placa de la muestra a la temperatura ambiente antes de sacarlo de la cámara de secado. Al depositar las muestras, NO mantener el SOLUTIO premezcladon en la punta de la pipeta durante 10 s. NO use la solución premezclada de nuevo después de depositar las muestras. Los paneles superiores de la Figura 2 muestran imágenes de campo brillante de muestras preparadas con diferentes temperaturas de la placa de la muestra.

Análisis de Datos 3. Espectrometría de Masas

1. La espectrometría de masas Adquisición de Datos
   NOTA: Después de la preparación, la muestra puede analizarse mediante espectrometría de masas de imagen. En el estudio actual, los MS experimentos de imagen se llevan a cabo usando una transferencia sincronizada TOF-doble polaridad de laboratorio construido (DP-TOF) espectrómetro de masas de imágenes. ¹⁵ espectrómetros de masas MALDI-TOF comercial con capacidad de imagen también son adecuados para tales experimentos. El espectrómetro de masas se utiliza en la extracción lineal y modos de iones positivos con retrasos de extracción optimizado. La energía cinética de los iones es 20 kV. El tamaño del haz de láser es de 35 micras de diámetro en la superficie de la muestra, y el espectro de cada punto es el avela rabia de 5 disparos de láser.
   1. Inserte la placa de muestra en el espectrómetro de masas MALDI.
   2. Realizar análisis de imagen espectrometría de masas para la muestra preparada en los pasos 2.1-2.9.
   3. Seleccionar un pico de masa característicos de la lista de masas se muestra en la ventana de resultados y haga clic en "2D" para trazar una imagen de iones de dos dimensiones.
      NOTA: Para maltotriosa mezclado con THAP, los picos característicos son sodiated maltotriosa, THAP protonada, y sodiated THAP. Para fragmento de bradicinina (1-7) mezclado con THAP, los picos característicos incluyen el fragmento de la bradicinina (1-7), protonado THAP protonadas y sodiated THAP.
   4. Haga clic en los botones de ajuste en la ventana emergente para determinar los límites superior e inferior de la intensidad de la señal y haga clic en "guardar una imagen". Este ajuste define el contraste de las imágenes de iones.
      NOTA: En cada conjunto individual de datos, las regiones agrietados y los puntos nulos muestran bajo brillo se eliminan.
   5. Observar y comparar el ionimagen de la imagen de campo brillante que fue tomada en el paso 2.9 con.
      NOTA: Imágenes espectrometría de masas y construcción de imágenes de iones particulares se puede lograr con instrumentos comerciales. Debido a la variedad de adquisición de datos y software de análisis, los usuarios deben seguir las instrucciones de software proporcionados por el proveedor de instrumento para obtener imágenes de alta calidad.
2. Análisis de los datos
   NOTA: La heterogeneidad de las muestras se analizó cuantitativamente. En esta demostración, cada muestra se divide en varias zonas concéntricas de software de desarrollo propio para analizar la distribución espacial de los iones. El análisis también se puede realizar utilizando software de análisis de datos independiente.
   1. Haga clic en los puntos nulos y las regiones agrietados la imagen de iones se muestra en la ventana de resultados en extirpar las áreas sin importancia.
      NOTA: Este procedimiento define el área esencial de la imagen de iones.
   2. Haga clic en el botón "borde buscar" para encontrar la mayor capa de la imagen de iones.
   3. Haga clic en "deducir" para guardar la información de la abundancia de iones de la capa más externa de una base de datos y eliminar esta capa de la imagen de iones de forma simultánea. Una casilla de verificación que representa esta capa más externa aparecerá en la lista de "datos de salida" de la ventana de resultados.
   4. Repita los pasos 3.2.2 y 3.2.3 hasta que se defina el centro de la imagen de iones.
   5. Haga clic y seleccionar todas las casillas de verificación en la lista de "datos de salida" y haga clic en "Exportar" para exportar los datos.
   6. Abra los datos exportados utilizando el software de hoja de cálculo para calcular el promedio de abundancia de iones de cada capa para obtener la información de la distribución espacial de los iones.

Resultados

Las imágenes de campo brillante, así como las imágenes de EM de fragmento de maltotriosa y bradiquinina (1-7) preparada con temperatura de la placa de muestra de 5 y 25 ° C se muestran en la Figura 1. En el caso de maltotriosa sodiated, la señal de ion principalmente puebla en la periferia de la zona de la muestra cuando se prepara con una temperatura de la placa de muestra de 25 ° C. Al disminuir la temperatura de la placa de la muestra a 5 ° C, la señal rellena...

Discusión

En base a las predicciones teóricas anteriores, los flujos hidrodinámicos inducidos por la temperatura dentro de las gotitas hacia el exterior pueden superar los flujos capilares inducidas por evaporación del disolvente. La eficiencia de tales recirculación interna de las moléculas es mayor cuando la temperatura de los gradientes dentro de un aumento de las gotitas. De acuerdo con los resultados predichos, cuando manteniendo la temperatura de la placa muestra bajo 5 ° C mientras se mantiene el entorno a la tempera...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Detergent powder	Alconox	242985
Methanol	Merck	106009
Acetonitrile	Merck	100003
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)	Sigma-Aldrich	T64602
Bradykinin fragment (1-7)	Sigma-Aldrich	B1651
Maltotriose	Sigma-Aldrich	47884
Pipette tips	Mettler Toledo	17005091
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification system	Millipore	ZMQS6VFT1
Powder-free nitrile gloves	Microflex	SU-690
600 ml beaker	Duran	2110648
Ultrasonic cleaner	Delta	DC300H
Hygrometer	Wisewind	5330
Nitrogen gas flowmeter	Dwyer	RMA-6-SSV
K-type thermocouples	Digitron	311-1670
Centrifuge	Select BioProducts	Force Mini
Pipette	Rainin	pipet-lite XLS
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Temperature controllable drying chamber	this lab
Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS)	this lab
MALDI-TOF stainless steel sample target	this lab