JoVE Logo

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол для уменьшения пространственных неоднородностей ионных сигналов в MALDI масс-спектрометрии с помощью регулирования температуры подложки во время процессов сушки образцов демонстрируется.

Аннотация

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. The heterogeneity of ion signals is a severe problem in MALDI, which results in poor data reproducibility and makes MALDI unsuitable for quantitative analysis. By regulating sample plate temperature during sample preparation, thermal-induced hydrodynamic flows inside droplets of sample solution are able to reduce the heterogeneity problem. A room-temperature sample preparation chamber equipped with a temperature-regulated copper base block that holds MALDI sample plates facilitates precise control of the sample drying condition. After drying of sample droplets, the temperature of sample plates is returned to room temperature and removed from the chamber for subsequent mass spectrometric analysis. The areas of samples are examined with MALDI-imaging mass spectrometry to obtain the spatial distribution of all components in the sample. In comparison with the conventional dried-droplet method that prepares samples under ambient conditions without temperature control, the samples prepared with the method demonstrated herein show significantly better spatial distribution and signal intensity. According to observations using carbohydrate and peptide samples, decreasing substrate temperature while maintaining the surroundings at ambient temperature during the drying process can effectively reduce the heterogeneity of ion signals. This method is generally applicable to various combinations of samples and matrices.

Введение

Mass spectrometry (MS) is one of the most important analytical techniques for analyzing the molecular compositions of complex samples. Among all the ionization methods used in MS, matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) is the most sensitive and widely used method in bioanalytical applications.1 In comparison to other ionization techniques, MALDI has the highest sensitivity and high tolerance to salt contaminants. Such analytical properties make MALDI the first choice for carbohydrate analysis and many proteomics applications. However, sample preparation is a crucial step for obtaining high quality data in MALDI-MS.

The most commonly used sample preparation method for MALDI-MS is the dried-droplet method, in which sample droplets are deposited on a surface and dried under ambient conditions. This drying method is simple and generally effective.2-5 However, a common problem in the dried-droplet method is that the resultant analyte/matrix crystals normally distribute irregularly. In many cases, the crystals aggregate at the periphery of sample areas, resulting in the so-called ring-stain formation.6-8 The heterogeneous crystal morphologies affect the spatial distribution of analyte molecules, which results in severe fluctuation in ion signal over sample areas. Such severe signal fluctuations and poor data reproducibility are known as the "sweet spot" problem in MALDI-MS.9 Thus, there is a great need for reducing spatial heterogeneities in MALDI-MS dried droplet applications.

Hydrodynamic flows in the sample droplet play an important role in determining the spatial distribution of samples prepared with the dried-droplet method.10-12 It was found that the evaporation of solvent induces outward capillary flows within droplets, which are responsible for the ring-stain formation.7,10 In contrast, recirculation flows induced by tangential surface-tension gradients may counterbalance the outward capillary flows.13 If the recirculation flow speeds are higher than that of the outward capillary flows, the samples can be efficiently redistributed to reduce the heterogeneity problem.14

In this work, we demonstrate a detailed protocol for preparing samples with a simple drying chamber to induce efficient recirculation flows during droplet drying processes. Droplet drying conditions are precisely controlled, including the temperatures of the sample plate and its surroundings, and the relative humidity within the chamber. The model analytes include maltotriose and bradykinin chain (1-7). The matrix used for the demonstration is 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP). The samples are examined with time-of-flight (TOF) MS, and the data are analyzed quantitatively to show the reduction of heterogeneity.

протокол

Примечание: Этот протокол разработан для уменьшения пространственной неоднородности мальтотриоза и брадикинина фрагмента (1-7), полученного с использованием метода высохших капель. Протокол состоит из трех основных этапов, включая подготовку и предобусловливанием, осаждение образца и сушки, а также масс-спектрометрического анализа данных. Процедуры изложены и описаны более подробно ниже:

1. Подготовка и Предобусловливание

  1. Очистка образца плиты
    1. Надеть нитриловые перчатки и ручной мыть образец пластины аккуратно с моющим средством и дистиллированной деионизированной воды (DDW).
    2. Промыть образец стекла с метанолом (MeOH) и DDW.
    3. Вставьте образец пластины в стакане емкостью 600 мл и залить DDW.
    4. Разрушать ультразвуком образца пластины в DDW в течение 15 мин в ультразвуковой ванне (200 Вт, 40 кГц).
    5. Удалить DDW из стакана и залейте стакан с метанолом.
    6. Разрушать ультразвуком образца пластины в MeOH в течение 15 мин в ультразвуковой ванне (200 Вт, 40 кГц).
    7. Сдувать растворителя капли на пластине с газообразным азотом и держать образец пластины сухой перед нанесением образца.
  2. Регулирование температуры сушильной камеры
    Примечание:. Сушильная камера 35 х 20 х 45 см 3 (Ш х Г х В ) акриловой камеры На рисунке 1 показана картина этой системы сушки. Камера продувается при комнатной температуре газообразным азотом через газовый расходомер при постоянной скорости потока для поддержания состояния низкой относительной влажности отслеживается с помощью калиброванного гигрометра, установленной внутри сушильной камеры. Медное основание блока в сушильной камере, оснащенной запрограммированной постоянной циркулятор температуры воды используется для размещения образцов из нержавеющей стали пластины. Медное основание блок способен регулировать температуру образца плиты от 5 до 25 ° C. Температуры воздуха, меди базового блока и образец пластины контролируются термопарами К-типа.
    1. Откройте дверь и быстро поместить образец пластину на медибазовый блок затем закройте дверцу.
    2. Ручная регулировка газового расходомера, чтобы установить скорость потока азота до 10 стандартных кубических футов в час (SCFH).
    3. Монитор относительную влажность воздуха в сушильной камере с помощью гигрометра и точной настройки газа расходомер для обеспечения относительной влажности воздуха всегда ниже 25%.
    4. Контролировать температуру образца пластины термопарами К-типа и регулировать температуру воды циркулятора вручную, пока образец пластина не достигнет 5 ° С в течение эксперимента или при комнатной температуре (25 ° C) для контроля.
      Примечание: Для того, чтобы стабилизировать образец стекла при заданной температуры, температура воды циркуляционный обычно устанавливается от 0 до 5 ° С ниже, чем проектируемого образца. Например, чтобы поддерживать на 5 ° C на образце пластины, установка температуры воды циркулятора, находится в диапазоне от 0 до 2 ° C; для поддержания образца пластины при температуре 25 ° С, значение температуры воды циркулятора находится в диапазоне от 23 до 25 ° С.
    5. Обеспечение требуемых значений температуры и относительной влажности достигаются (таблица 1) перед нанесением пробы.
      Примечание: Все параметры, а также их значения параметров для процессов сушки с различными температурами образца пластины приведены в таблице 1.
      Примечание: При низкой температуре образца плиты, конденсацию воды на образце пластины может произойти, если дверь камера открыта в течение длительного времени. Если происходит конденсация воды, закройте дверцу и не предъявляйте любой образец на нем до конденсации воды не высохли.
  3. Получение матричных и аналита решений
    1. Получение матричных решений
      1. Готовят 0,1 М раствора Тап с помощью 50% ацетонитрила (ACN) 50% -ного водного раствора DDW.
    2. Получение аналитов
      1. Приготовьте 10 -4 М мальтотриозу раствор с пониженным содержанием дейтерия.
      2. Приготовьте 10 -5 М фрагмент брадикинина (1-7) в раствор 50% ацетонитрила(АКС): 50% -ный водный раствор DDW.

2. Образец Отложение и сушки

  1. Премикс 0,25 мкл 0,1 М раствора Тап и 0,25 мкл 10 -4 М мальтотриоза или 10 -5 М фрагмента брадикинина (1-7) растворов в микроцентрифужных трубки.
  2. Vortex смешанный раствор в течение 3 сек.
  3. Центрифуга смешанного раствора в течение 2 с (2000 XG) для сбора раствора в нижней части трубки центрифуги.
  4. Откройте дверцу сушильной камеры, тщательно депонировать 0,1 мкл раствора на образце пластины с пипеткой и закрыть дверь немедленно.
  5. Подождите, пока образец капли, чтобы высохнуть.
    . Примечание: обычно наблюдаемые время сушки с различными температурами образца пластины приведены в таблице 1 для температуры образца пластины 5 ° С, среднее время сушки составляет от 800 до 1000 с; для измерения температуры образца пластины 25 ° С, среднее время сушки составляет от 100 до 150 летес.
  6. После сушки, откройте дверцу сушильной камеры.
  7. Установите температуру воды циркуляционного до комнатной температуры (25 ° C).
    Примечание: Пропустить этот шаг, если образец пластина постоянно хранится при комнатной температуре (25 ° C) в процессе сушки.
  8. После того как температура пластины примере возвращается к комнатной температуре (25 ° C), удалить образец пластины из сушильной камеры.
  9. Изучение морфологии образец под стереомикроскопа 5X и взять ярко-поле моментальный снимок.
    Примечание: Если кристалл морфологию не как ожидалось, необходимо подготовить новый образец с той же процедурой. Типичные морфологию кристаллические показаны на верхних панелях на фиг.2.
    Примечание: В случаях с низкими температурами пластины образца, например, 5 ° С, важно, чтобы нагреть образец пластины до комнатной температуры, прежде чем принимать его из сушильной камеры. При сдаче на хранение образцов, не держат предварительно приготовленного SOLUTIOп в кончика пипетки в течение 10 сек. НЕ использовать заранее приготовленный раствор снова после внесения образцов. Верхние панели Рисунок 2 показывают ярко-полевые изображения образцов , приготовленных с различными температурами образца пластины.

Анализ 3. Данные масс-спектрометрии

  1. Масс-спектрометрия сбора данных
    Примечание: После подготовки, образец может быть проанализирован с помощью масс-спектрометрии изображений. В настоящем исследовании, формирующую изображение эксперименты MS проводят с использованием лабораторного встроенной синхронизированную с двойным полярности TOF (DP-TOF) масс - спектрометр с формированием изображения. 15 масс - спектрометры коммерческого MALDI-TOF с возможностью формирования изображения также подходят для таких экспериментов. Масс-спектрометр работает в линейной экстракции и положительных ионов с режимами оптимизированными задержки экстракции. Кинетическая энергия ионов составляет 20 кВ. Размер лазерного пучка составляет 35 мкм в диаметре на поверхности образца, а спектр каждого пятна прярость 5 лазерных выстрелов.
    1. Вставьте образец пластины в MALDI масс-спектрометра.
    2. Выполнение визуализации масс-спектрометрического анализа для образца, полученного на этапах 2.1-2.9.
    3. Выберите характерный пик массы из списка масс-показанного в окне результата и нажмите кнопку "2D", чтобы построить двумерный ионное изображение.
      Примечание: Для получения мальтотриозу смешанного с Тап, характерные пики sodiated мальтотриозу, протонированных Тап и sodiated Тап. Для фрагмента брадикинина (1-7), смешанной с Тап, характерные пики включают протонированные фрагмент брадикинина (1-7), протонированных Тап и sodiated Тап.
    4. Нажмите кнопки регулировки во всплывающем окне, чтобы определить верхний и нижний пределы интенсивности сигнала и нажмите кнопку "Сохранить изображение". Этот параметр определяет контраст ионных изображений.
      Примечание: В каждом отдельном наборе данных, то сломанные регионы и нулевые пятна, показывающие низкую яркость устраняются.
    5. Наблюдать и сравнить ионизображение с ярко-поле изображения, которое было принято на шаге 2.9.
      Примечание: Визуализация масс-спектрометрии и построение образов отдельных ионов может быть достигнуто с коммерческими инструментами. В связи с разнообразием сбора данных и программного обеспечения для анализа, пользователи должны следовать инструкциям программного обеспечения, предоставленного прибора поставщика, чтобы получить высокое качество изображения.
  2. Анализ данных
    Примечание: Неоднородность образцов анализируют количественно. В этой демонстрации, каждый образец делится на несколько концентрических областей с помощью программного обеспечения собственной разработки для анализа пространственного распределения ионов. Анализ также может быть выполнен с использованием автономного программного обеспечения для анализа данных.
    1. Нажмите нулевые пятна и трещины областей в изображении ионов отображается в окне результата для удаления несущественных областей.
      Примечание: Эта процедура определяет существенную область ионного изображения.
    2. Нажмите кнопку "край найти", чтобы найти слой крайнем ионного изображения.
    3. Нажмите кнопку "вычитать", чтобы сохранить информацию о ионом пресыщение слоя в самому дальнему от центра базы данных и удалить этот слой из ионного изображения одновременно. Флажок, представляющий этот слой будет крайнем появится в списке "выходных данных" окна результатов.
    4. Повторите шаги 3.2.2 и 3.2.3 до центра иона изображения не определяется.
    5. Нажмите и выберите все флажки в списке "выходных данных" и нажмите кнопку "Экспорт", чтобы экспортировать данные.
    6. Откройте экспортированные данные с помощью программного обеспечения электронной таблицы для расчета среднего иона обилие каждого слоя, чтобы получить информацию о пространственном распределении ионов.

Результаты

Изображения светлого поля, а также изображения МС мальтотриоза и брадикинина фрагмента (1-7) , полученного с температурой образца пластины 5 и 25 ° С, показаны на рисунке 1. В случае sodiated мальтотриоза, ионного сигнала в основном заполнит на периферии участка образ...

Обсуждение

На основе предыдущих теоретических предсказаний, температуры, вызванной гидродинамические потоки внутри капель может преодолеть внешние капиллярные потоки, вызванные испарением растворителя. Эффективность такого внутренней рециркуляции молекул усиливается, когда градиенты темпе?...

Раскрытие информации

The authors declare no competing financial interest.

Благодарности

This work is supported by the Genomics Research Center, Academia Sinica and the Ministry of Science and Technology of Taiwan, the Republic of China (Contract No. 104-2119-M-001-014).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Detergent powderAlconox242985
MethanolMerck106009
AcetonitrileMerck100003
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)Sigma-AldrichT64602 
Bradykinin fragment (1-7)Sigma-AldrichB1651
MaltotrioseSigma-Aldrich47884
Pipette tipsMettler Toledo17005091
Microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification systemMilliporeZMQS6VFT1
Powder-free nitrile glovesMicroflexSU-690
600 ml beakerDuran2110648
Ultrasonic cleanerDeltaDC300H
HygrometerWisewind5330
Nitrogen gas flowmeterDwyerRMA-6-SSV
K-type thermocouplesDigitron311-1670
CentrifugeSelect BioProductsForce Mini 
PipetteRaininpipet-lite XLS
StereomicroscopeOlympusSZX16
Temperature controllable drying chamberthis lab
Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS)this lab
MALDI-TOF stainless steel sample targetthis lab

Ссылки

  1. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).
  2. Beavis, R. C., Chait, B. T. Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption. Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).
  3. Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).
  4. Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).
  5. Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. 2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).
  6. Hu, H., Larson, R. G. Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate. J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).
  7. Deegan, R. D., et al. Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
  8. Hu, J. -. B., Chen, Y. -. C., Urban, P. L. Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).
  9. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation. J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).
  10. Hu, H., Larson, R. G. Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions. J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).
  11. Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study. New J. Phys. 11, 075020 (2009).
  12. Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop. J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).
  13. Probstein, R. F. . Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction. , 305-361 (1994).
  14. Lai, Y. -. H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).
  15. Hsiao, C. -. H., et al. Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).
  16. Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation. Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).
  17. Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).
  18. Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting. Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

116MALDI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены