定量的なアプリケーションのための均質なMALDI試料の調製

要約

サンプルの乾燥工程時の基板温度を調節することにより、MALDI質量分析法におけるイオン信号の空間的な不均一性を低減するためのプロトコルが示されています。

要約

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. The heterogeneity of ion signals is a severe problem in MALDI, which results in poor data reproducibility and makes MALDI unsuitable for quantitative analysis. By regulating sample plate temperature during sample preparation, thermal-induced hydrodynamic flows inside droplets of sample solution are able to reduce the heterogeneity problem. A room-temperature sample preparation chamber equipped with a temperature-regulated copper base block that holds MALDI sample plates facilitates precise control of the sample drying condition. After drying of sample droplets, the temperature of sample plates is returned to room temperature and removed from the chamber for subsequent mass spectrometric analysis. The areas of samples are examined with MALDI-imaging mass spectrometry to obtain the spatial distribution of all components in the sample. In comparison with the conventional dried-droplet method that prepares samples under ambient conditions without temperature control, the samples prepared with the method demonstrated herein show significantly better spatial distribution and signal intensity. According to observations using carbohydrate and peptide samples, decreasing substrate temperature while maintaining the surroundings at ambient temperature during the drying process can effectively reduce the heterogeneity of ion signals. This method is generally applicable to various combinations of samples and matrices.

概要

Mass spectrometry (MS) is one of the most important analytical techniques for analyzing the molecular compositions of complex samples. Among all the ionization methods used in MS, matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) is the most sensitive and widely used method in bioanalytical applications.¹ In comparison to other ionization techniques, MALDI has the highest sensitivity and high tolerance to salt contaminants. Such analytical properties make MALDI the first choice for carbohydrate analysis and many proteomics applications. However, sample preparation is a crucial step for obtaining high quality data in MALDI-MS.

The most commonly used sample preparation method for MALDI-MS is the dried-droplet method, in which sample droplets are deposited on a surface and dried under ambient conditions. This drying method is simple and generally effective.^2-5 However, a common problem in the dried-droplet method is that the resultant analyte/matrix crystals normally distribute irregularly. In many cases, the crystals aggregate at the periphery of sample areas, resulting in the so-called ring-stain formation.^6-8 The heterogeneous crystal morphologies affect the spatial distribution of analyte molecules, which results in severe fluctuation in ion signal over sample areas. Such severe signal fluctuations and poor data reproducibility are known as the "sweet spot" problem in MALDI-MS.⁹ Thus, there is a great need for reducing spatial heterogeneities in MALDI-MS dried droplet applications.

Hydrodynamic flows in the sample droplet play an important role in determining the spatial distribution of samples prepared with the dried-droplet method.^10-12 It was found that the evaporation of solvent induces outward capillary flows within droplets, which are responsible for the ring-stain formation.^7,10 In contrast, recirculation flows induced by tangential surface-tension gradients may counterbalance the outward capillary flows.¹³ If the recirculation flow speeds are higher than that of the outward capillary flows, the samples can be efficiently redistributed to reduce the heterogeneity problem.¹⁴

In this work, we demonstrate a detailed protocol for preparing samples with a simple drying chamber to induce efficient recirculation flows during droplet drying processes. Droplet drying conditions are precisely controlled, including the temperatures of the sample plate and its surroundings, and the relative humidity within the chamber. The model analytes include maltotriose and bradykinin chain (1-7). The matrix used for the demonstration is 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP). The samples are examined with time-of-flight (TOF) MS, and the data are analyzed quantitatively to show the reduction of heterogeneity.

プロトコル

注意：このプロトコルは、乾燥液滴法を用いて調製した（1-7）マルトトリオース及びブラジキニンフラグメントの空間的な不均一性を減少させるために開発されています。プロトコルは、調製及び前処理、試料堆積、乾燥、及び質量分析データ分析を含む三つの主要な段階からなります。手順は、以下でより詳細に概説し、説明します。

1.準備と前処理

1. サンプルプレートのクリーニング
   1. ニトリル手袋を着用し、洗剤と蒸留脱イオン水（DDW）で穏やかにサンプルプレートを手で洗います。
   2. メタノール（MeOH）でとDDWでサンプルプレートをすすぎます。
   3. 600ミリリットルのビーカーにサンプルプレートを挿入し、DDWでいっぱい。
   4. 超音波浴（200 W、40キロヘルツ）で15分間、DDWでサンプルプレートを超音波処理します。
   5. ビーカーからDDWを削除し、MeOHでビーカーを埋めます。
   6. 超音波浴（200 W、40キロヘルツ）で15分間、MeOH中でサンプルプレートを超音波処理します。
   7. 窒素ガスをプレート上で溶剤滴を吹き飛ばすとサンプル堆積前にサンプルプレートの乾燥を保ちます。
2. 乾燥チャンバーの温度を調節します
   注：乾燥室は35×20×45 cm ³である（幅×奥行き×高さ）アクリルチャンバー図1は、この乾燥システムの写真を示します。チャンバは、乾燥室の内部に設置較正湿度計によって監視低い相対湿度を維持するために一定の流量でガス流量計を介して室温窒素ガスでパージされます。プログラムされた恒温水循環装置を備えた乾燥室中の銅ベースブロックは、ステンレス鋼サンプルプレートを収容するために使用されます。銅ベースブロックを25℃に5からのサンプルプレートの温度を調節することができます。空気、銅ベースのブロック、及びサンプルプレートの温度は、K型熱電対によって監視されます。
   1. ドアを開け、急速に銅をサンプルプレートを置きますベースブロックは、その後、ドアを閉じます。
   2. 手動で時間当たり10標準立方フィート（SCFH）で窒素流量を設定するためにガス流量計を調整します。
   3. 相対湿度が常に25％未満である保証するために、湿度計と微調整ガス流量計による乾燥チャンバ内の相対湿度を監視します。
   4. K型熱電対によってサンプルプレートの温度を監視し、サンプルプレートは、実験又は対照を室温（25℃）が5℃になるまで手動で水循環温度を調整します。
      注：設計温度でサンプルプレートを安定させるために、水循環装置の温度は、典型的には、設計されたサンプルよりも低い0〜5℃に設定されています。例えば、サンプルプレートに5℃を維持するように、水循環装置の温度設定は、0℃〜2の範囲です。 25℃でのサンプルプレートを維持するために、水循環装置の温度設定は23℃〜25℃の範囲です。
   5. 必要な温度と相対湿度はサンプル堆積の前に（ 表1）に達していることを確認します。
      注：異なるサンプルプレートの温度が乾燥プロセスのすべてのパラメータ、ならびにそれらの設定値を表1に示します。
      注：室のドアを長時間開いている場合は、低いサンプルプレートの温度では、サンプルプレート上の結露が発生することがあります。結露が発生した場合は、ドアを閉じて、結露が出て乾燥するまでの任意のサンプルを堆積しないでください 。
3. マトリックスと分析物溶液の調製
   1. マトリックス溶液の調製
      1. 50％DDW水溶液：50％アセトニトリル（ACN）と0.1 M THAP溶液を調製します。
   2. 検体の準備
      1. DDWで10 ^-4 Mマルトトリオース溶液を調製します。
      2. 10 ^-5 Mのブラジキニン断片（1-7）溶液を50％アセトニトリル中で調製します（ACN）：50％DDW水溶液。

2.サンプル沈着と乾燥

1. プレミックス0.1 MのTHAP液の0.25μlの10 ^-4 Mのマルトトリオースまたは10 ^-5 Mブラジキニンフラグメント（1-7）マイクロ遠心チューブ内のソリューションの0.25μlの。
2. 3秒間混合溶液をボルテックス。
3. 遠心管の底に溶液を回収するために2秒（2,000×gで）混合液を遠心分離。
4. 乾燥室のドアを開け、慎重にピペットでサンプルプレート上に溶液0.1μLを堆積し、すぐにドアを閉めます。
5. 試料液滴が乾燥するのを待ちます。
   注：典型的に観察された乾燥時間の異なるサンプルプレートの温度を表1に記載されていると5℃のサンプルプレートの温度は、平均乾燥時間が800〜1000秒です。 25°Cのサンプルプレート温度について、平均乾燥時間は100〜150秒ですEC。
6. 乾燥させた後、乾燥室の扉を開きます。
7. 室温（25℃）での水循環温度を設定します。
   注：サンプルプレートは、乾燥工程中に、室温（25℃）で常に保たれている場合は、このステップをスキップします。
8. 室温（25℃）にサンプルプレートの温度が戻った後、乾燥室からサンプルプレートを取り外します。
9. 5Xの実体顕微鏡下でのサンプルの形態を調べ、スナップショット明視野像を取ります。
   注：予想通りの結晶形態ではない場合は、同様の手順を使用して新しいサンプルを用意する必要があります。典型的な結晶形態は、図2の上のパネルに示されています。
   注：このような5°Cなどの低サンプルプレート温度、との例では、乾燥室からそれを取る前に室温にサンプルプレートをウォームアップすることが重要です。サンプルを堆積すると、予混合solutioを保管しないでください10秒以上のピペットの先端中のn。サンプルを堆積した後、再び予混合ソリューションを使用しないでください 。 図2の上のパネルは、異なるサンプルプレートの温度を用いて調製した試料の明視野画像を示します。

3.質量分析データ解析

1. 質量分析データ集録
   注：調製後、試料をイメージング質量分析を用いて分析することができます。現在の研究では、イメージングMS実験を実験室内蔵同期デュアル極性TOFを使用して行われる（DP-TOF）イメージング質量分析計。撮像能力を持つ¹⁵市販MALDI-TOF質量分析計は、また、そのような実験に適しています。質量分析計は、線形抽出と最適化された抽出遅延を有する陽イオンモードで操作されます。イオンの運動エネルギーは、20 kVです。レーザービームの大きさは、試料表面上の直径が35μmであり、すべてのスポットのスペクトルAVEあります5レーザーショットの怒り。
   1. MALDI質量分析計にサンプルプレートを挿入します。
   2. ステップ2.1から2.9に調製した試料を撮像する質量分析を実行します。
   3. 結果ウィンドウに表示される質量リストから特有の質量ピークを選択して、2次元イオン画像をプロットする「2D」をクリックします。
      注：THAPと混合マルトトリオースのために、特徴的なピークは、マルトトリオース、プロトン化THAPをナトリウムイオン付加し、THAPをナトリウムイオン付加されています。 THAPと混合ブラジキニン断片（1-7）について、特徴的なピークは、ブラジキニンフラグメント（1-7）、プロトン化THAPをプロトン化、およびTHAPをナトリウムイオン付加が含まれます。
   4. 信号強度の上限と下限を決定するために、ポップアップウィンドウに調整ボタンをクリックして、「画像を保存」をクリックします。この設定は、イオンの画像のコントラストを定義します。
      注：データのすべての個々のセットでは、ひび割れ領域及び低輝度を示すヌルスポットが除去されます。
   5. イオンを観察し、比較しますステップ2.9で撮影された明視野像と画像。
      注記：特定のイオンの画像のイメージング質量分析法及び構造は、市販の機器を使用して達成することができます。データ収集および解析ソフトウェアの様々な、ユーザーは、高品質の画像を取得するために、機器ベンダーが提供するソフトウェア命令に従ってください。
2. データ分析
   注：サンプルの不均一性を定量的に分析されます。このデモでは、すべてのサンプルは、イオンの空間分布を分析するために、社内で開発されたソフトウェアにより、複数の同心円状の領域に分割されています。分析はまた、スタンドアロンのデータ分析ソフトウェアを用いて行うことができます。
   1. 重要でない領域を除去するために、結果ウィンドウに表示されているイオン像にヌルスポットやひび割れ領域をクリックしてください。
      注：この手順では、イオン像の本質的な領域を定義します。
   2. イオン像の最外層を見つけるために、「エッジを見つける」ボタンをクリックします。
   3. データベース内の最も外側の層のイオン存在情報を保存し、同時にイオン像から、この層を除去するために、「控除」をクリックします。この最外層を表すチェックボックスが結果ウィンドウの「出力データ」リストに表示されます。
   4. イオン像の中心が定義されるまで繰り返して、3.2.2と3.2.3を繰り返します。
   5. クリックして、「出力データ」リストのすべてのチェックボックスを選択して、データをエクスポートする「エクスポート」をクリックします。
   6. イオンの空間分布情報を取得するために、すべての層の平均イオン存在を計算するために、表計算ソフトを使用してエクスポートしたデータを開きます。

結果

明視野画像並びにサンプルプレート5の温度25℃で調製マルトトリオース及びブラジキニンフラグメント（1-7）のMS画像は、図1に示されている。ナトリウムイオン付加マルトトリオース、イオン信号主としてを移入の場合それは、25℃のサンプルプレートの温度を用いて調製された試料領域の周囲に。 5℃にサンプルプレートの温度を下げることにより、信?...

ディスカッション

以前の理論的予測に基づいて、液滴内の温度誘導性の流体力学的な流れは、溶媒の蒸発によって誘導される外向きの毛細管流れを克服することができます。温度は、液滴増大内勾配時の分子のような内部再循環の効率が向上します。周囲温度でその周囲を維持しながら、5℃下、サンプルプレートの温度を維持した場合に予測された結果によれば、液滴内の再循環流の平均速度は、外側にキャ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Detergent powder	Alconox	242985
Methanol	Merck	106009
Acetonitrile	Merck	100003
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)	Sigma-Aldrich	T64602
Bradykinin fragment (1-7)	Sigma-Aldrich	B1651
Maltotriose	Sigma-Aldrich	47884
Pipette tips	Mettler Toledo	17005091
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification system	Millipore	ZMQS6VFT1
Powder-free nitrile gloves	Microflex	SU-690
600 ml beaker	Duran	2110648
Ultrasonic cleaner	Delta	DC300H
Hygrometer	Wisewind	5330
Nitrogen gas flowmeter	Dwyer	RMA-6-SSV
K-type thermocouples	Digitron	311-1670
Centrifuge	Select BioProducts	Force Mini
Pipette	Rainin	pipet-lite XLS
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Temperature controllable drying chamber	this lab
Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS)	this lab
MALDI-TOF stainless steel sample target	this lab