הכנת דוגמאות MALDI אחידה עבור יישומים כמותי

Summary

פרוטוקול להפחתת heterogeneities המרחבי של אותות יון ספקטרומטריית MALDI ההמונית על ידי ויסות טמפרטורת מצע במהלך תהליכי ייבוש מדגם מודגם.

Abstract

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. The heterogeneity of ion signals is a severe problem in MALDI, which results in poor data reproducibility and makes MALDI unsuitable for quantitative analysis. By regulating sample plate temperature during sample preparation, thermal-induced hydrodynamic flows inside droplets of sample solution are able to reduce the heterogeneity problem. A room-temperature sample preparation chamber equipped with a temperature-regulated copper base block that holds MALDI sample plates facilitates precise control of the sample drying condition. After drying of sample droplets, the temperature of sample plates is returned to room temperature and removed from the chamber for subsequent mass spectrometric analysis. The areas of samples are examined with MALDI-imaging mass spectrometry to obtain the spatial distribution of all components in the sample. In comparison with the conventional dried-droplet method that prepares samples under ambient conditions without temperature control, the samples prepared with the method demonstrated herein show significantly better spatial distribution and signal intensity. According to observations using carbohydrate and peptide samples, decreasing substrate temperature while maintaining the surroundings at ambient temperature during the drying process can effectively reduce the heterogeneity of ion signals. This method is generally applicable to various combinations of samples and matrices.

Introduction

Mass spectrometry (MS) is one of the most important analytical techniques for analyzing the molecular compositions of complex samples. Among all the ionization methods used in MS, matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) is the most sensitive and widely used method in bioanalytical applications.¹ In comparison to other ionization techniques, MALDI has the highest sensitivity and high tolerance to salt contaminants. Such analytical properties make MALDI the first choice for carbohydrate analysis and many proteomics applications. However, sample preparation is a crucial step for obtaining high quality data in MALDI-MS.

The most commonly used sample preparation method for MALDI-MS is the dried-droplet method, in which sample droplets are deposited on a surface and dried under ambient conditions. This drying method is simple and generally effective.^2-5 However, a common problem in the dried-droplet method is that the resultant analyte/matrix crystals normally distribute irregularly. In many cases, the crystals aggregate at the periphery of sample areas, resulting in the so-called ring-stain formation.^6-8 The heterogeneous crystal morphologies affect the spatial distribution of analyte molecules, which results in severe fluctuation in ion signal over sample areas. Such severe signal fluctuations and poor data reproducibility are known as the "sweet spot" problem in MALDI-MS.⁹ Thus, there is a great need for reducing spatial heterogeneities in MALDI-MS dried droplet applications.

Hydrodynamic flows in the sample droplet play an important role in determining the spatial distribution of samples prepared with the dried-droplet method.^10-12 It was found that the evaporation of solvent induces outward capillary flows within droplets, which are responsible for the ring-stain formation.^7,10 In contrast, recirculation flows induced by tangential surface-tension gradients may counterbalance the outward capillary flows.¹³ If the recirculation flow speeds are higher than that of the outward capillary flows, the samples can be efficiently redistributed to reduce the heterogeneity problem.¹⁴

In this work, we demonstrate a detailed protocol for preparing samples with a simple drying chamber to induce efficient recirculation flows during droplet drying processes. Droplet drying conditions are precisely controlled, including the temperatures of the sample plate and its surroundings, and the relative humidity within the chamber. The model analytes include maltotriose and bradykinin chain (1-7). The matrix used for the demonstration is 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP). The samples are examined with time-of-flight (TOF) MS, and the data are analyzed quantitatively to show the reduction of heterogeneity.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מפותח להפחתת ההטרוגניות המרחבית של שבר maltotriose ו ברדיקינין (1-7) מוכן עם שיטת רביב היבש. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים, כולל הכנה נפשית מראש, בתצהיר מדגם וייבוש, וניתוח נתונים ספקטרומטריית מסה. הנהלים מתוארים ותיאר בפירוט רב יותר בהמשך:

הכנת אכשור קד 1.

1. ניקוי פלייט לדוגמא
   1. יש להשתמש בכפפות ניטריל ויד-לשטוף את הצלחת מדגם בעדינות עם חומר ניקוי ומים deionized מזוקקים (DDW).
   2. יש לשטוף את הצלחת המדגם עם מתנול (MeOH) ו DDW.
   3. הכנס את צלחת מדגם בכוס 600 מ"ל ולמלא עם DDW.
   4. Sonicate צלחת מדגם DDW במשך 15 דקות באמבטיה קולית (200 ואט, 40 קילוהרץ).
   5. הסר DDW מן הקנקן כשמילא את הכוס MeOH.
   6. Sonicate הצלחת מדגם MeOH במשך 15 דקות באמבטיה קולי (200 וואט, 40 קילוהרץ).
   7. לפוצץ את טיפות ממס על צלחת עם גז חנקן לשמור על צלחת מדגם יבש לפני בתצהיר מדגם.
2. ויסות טמפרטורת הייבוש
   הערה:. תא ייבוש הוא 35 x 20 x 45 ס"מ ³ (ר x ע x ג) תא אקריליק איור 1 מציג את התמונה של מערכת ייבוש זה. החדר הוא מטוהר עם גז חנקן בטמפרטורת חדר באמצעות מד זרימת גז בקצב זרימה מתמיד כדי לשמור על מצב לחות יחסי נמוך פיקוח על ידי היגרומטר מכויל המותקן בתוך חדר הייבוש. זינוק בסיס נחושת בתא הייבוש מצויד circulator מים בטמפרטורה קבוע מתוכנת משמש כדי להתאים צלחות מדגם נירוסטה. בלוק הבסיס נחושת הוא מסוגל לווסת את טמפרטורת צלחת המדגם בין 5 ל -25 מעלות צלזיוס. הטמפרטורות של אוויר, לחסום בסיס נחושת, ואת צלחת המדגם מנוטרות על ידי צמדים מסוג K.
   1. פתח את הדלת במהירות לשים את צלחת המדגם על הנחושתבלוק בסיס וסוגר את הדלת.
   2. באופן ידני את מד זרימת הגז לקבוע את קצב זרימת החנקן עד 10 רגל מעוקב סטנדרטיים לשעה (SCFH).
   3. לפקח על הלחות היחסית בתא הייבוש על ידי מד הלחות ו לכוונן את מד זרימת הגז על מנת להבטיח את הלחות היחסית היא תמיד מתחת ל -25%.
   4. לנטר את הטמפרטורה של צלחת מדגם ידי צמדים מסוג K ולהתאים את הטמפרטורה circulator מים ידני עד שהצלחת מדגם מגיע 5 מעלות צלזיוס במשך הניסוי או בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) במשך שליטה.
      הערה: כדי לייצב את צלחת המדגם בטמפרטורה מתוכננת, טמפרטורת circulator המים מוגדרת, בדרך כלל 0 עד 5 מעלות צלזיוס נמוך יותר לדוגמה שנועד. לדוגמא, כדי לשמור על 5 מעלות צלזיוס על צלחת המדגם, הגדרת הטמפרטורה של circulator המים היא בטווח של 0 עד 2 מעלות צלזיוס; כדי לשמור על צלחת המדגם ב 25 מעלות צלזיוס, הגדרת הטמפרטורה של circulator המים היא בטווח של C 23 עד 25 °.
   5. ודא הטמפרטורות הנדרשות ואת הלחות היחסית הם הגיעו (טבלה 1) לפני בתצהיר מדגם.
      הערה: כל הפרמטרים כמו גם ערכי ההגדרה שלהם לתהליכי הייבוש עם טמפרטורות צלחת מדגם שונות מוצגים בלוח 1.
      הערה: בטמפרטורת צלחת נמוכה מדגם, עיבוי מים על צלחת המדגם עלול להתרחש אם את דלת החדר פתוחה במשך זמן רב. אם מי עיבוי מתרחש, לסגור את הדלת ואל להפקיד כל מדגם עליו עד עיבוי המים התייבש.
3. הכנת פתרונות מטריקס אנליטי
   1. הכנת פתרונות מטריקס
      1. כן 0.1 פתרון M Thap עם 50% אצטוניטריל (ACN): 50% בתמיסה מימית DDW.
   2. הכנת analytes
      1. כן 10 ^-4 פתרון M maltotriose עם DDW.
      2. כן 10 ^-5 שבר ברדיקינין M (1-7) פתרון אצטוניטריל 50%(ACN): 50% בתמיסה מימית DDW.

2. הפקדה לדוגמא ייבוש

1. Premix 0.25 μl של פתרון 0.1 M Thap ו 0.25 μl של 10 ^-4 M maltotriose או 10 ^-5 M שבר ברדיקינין (1-7) פתרונות בתוך שפופרת microcentrifuge.
2. פתרון וורטקס המעורב במשך 3 שניות.
3. צנטריפוגה פתרון מעורב למשך 2 שניות (2,000 XG) לאסוף את הפתרון בתחתית הצינור צנטריפוגות.
4. פתח את הדלת של חדר הייבוש, בזהירות להפקיד 0.1 μl של הפתרון על צלחת המדגם עם פיפטה ולסגור את הדלת מייד.
5. חכה אגל המדגם להתייבש.
   . הערה: פעמי הייבוש נצפו בדרך כלל עם טמפרטורות צלחת מדגם שונות מפורטות בטבלת 1 עבור טמפרטורת צלחת מדגם של 5 מעלות צלזיוס, זמן הייבוש הממוצע הוא 800 עד 1,000 שניות; עבור טמפרטורת צלחת מדגם של 25 ° C, זמן הייבוש הממוצע הוא 100 עד 150 sEC.
6. לאחר ייבוש, פתח את הדלת של חדר הייבוש.
7. הגדר את הטמפרטורה circulator מים בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס).
   הערה: דלג על שלב זה אם הצלחת מדגם נשמרת כל הזמן בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) במהלך תהליך הייבוש.
8. לאחר תשואות טמפרטורת צלחת המדגם לטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס), להסיר את צלחת המדגם מאולם הייבוש.
9. בדוק את מורפולוגיה הדגימה תחת סטראו 5X ולקחת תמונה בהיר שדה תמונת מצב.
   הערה: אם מורפולוגיה קריסטל לא צפויות כמו, יש צורך להכין מדגם חדש עם אותו ההליך. מורפולוגיה גביש אופייניות מוצגות הלוחות העליונים של איור 2.
   הערה: במקרים עם טמפרטורות צלחת מדגם נמוכות, כגון 5 מעלות צלזיוס, חשוב לחמם את צלחת המדגם לטמפרטורת חדר לפני שלקחת אותו מתוך חדר הייבוש. בעת הפקדת דגימות, אין להחזיק את solutio premixedn ב קצה פיפטה מעל 10 שניות. אין להשתמש פתרון premixed שוב לאחר הפקדת הדגימות. הפנלים העליונים של איור 2 מציגים תמונות בהיר שדה של דגימות מוכנות עם טמפרטורות צלחת מדגם שונות.

3. ניתוח נתונים ספקטרומטריית מסה

1. קליטת נתונים ספקטרומטריית מסה
   הערה: לאחר הכנה, המדגם ניתן לנתח באמצעות הדמיה ספקטרומטריית מסה. במחקר הנוכחי, ניסויי MS ההדמיה נערכים באמצעות TOF כפול קוטביות מסונכרנת בנוי מעבדה (DP-TOF) ספקטרומטר מסת הדמיה. ¹⁵ ספקטרומטרים המוני מסחרי MALDI-TOF עם יכולת הדמיה מתאים גם ניסויים כאלה. ספקטרומטר מסה מופעל החילוץ לינארית מצבי יון חיובי עם עיכובים החילוץ מותאם. האנרגיה הקינטית של יונים היא 20 קילו. גודל קרן הליזר הוא 35 מיקרומטר קוטר על פני השטח המדגמים, והספקטרום של כל נקודה הוא aveזעם של 5 יריות לייזר.
   1. הכנס את צלחת מדגם לתוך ספקטרומטר מסה MALDI.
   2. לבצע הדמית ניתוח ספקטרומטריית מסה על המדגם המוכן בצעדים 2.1-2.9.
   3. בחר לשיא מסת מאפיין מהרשימה המוני מוצגת בחלון התוצאה ולחץ "2D" לתכנן תמונת יון דו ממדים.
      הערה: לקבלת maltotriose מעורבב עם Thap, פסגות מאפיין הם sodiated maltotriose, Thap protonated, ו sodiated Thap. עבור שבר ברדיקינין (1-7) מעורבב עם Thap, פסגות מאפיין כוללות protonated שבר ברדיקינין (1-7), protonated Thap, ו sodiated Thap.
   4. לחץ על לחצני התאמה בחלון הקופץ כדי לקבוע את הגבולות העליונים ותחתונים של עוצמת האות ולוחץ על "שמור תמונה". הגדרה זו קובעת את הניגוד של תמונות יון.
      הערה: בכל סט יחיד של נתונים, האזורים הסדוקים כתמי null מראים בהירות נמוכה בוטלו.
   5. שים ולהשוות את היוןתמונה עם התמונה בהיר השדה שנלקחה בשלב 2.9.
      הערה: הדמיה ספקטרומטריית מסה ובניית תמונות של יונים מסוימים יכולה להיות מושגת באמצעות מכשירים מסחריים. בשל המגוון של רכישת נתונים וניתוח תוכנה, המשתמשים צריכים לפעול בהתאם להנחיות תוכנה המסופקות על ידי ספק המכשיר כדי לקבל תמונות באיכות גבוהות.
2. ניתוח נתונים
   הערה: ההטרוגניות של דגימות מנותחת כמותית. בהפגנה זו, כל מדגם מחולק לאזורי קונצנטריים מרובים על ידי תוכנות שפותחו באופן עצמי לנתח את הפריסה המרחבית של היונים. ניתוח המידע יכול גם להתבצע באמצעות תוכנת ניתוח נתונים עצמאית.
   1. לחץ על הכתמים בטל האזורים הסדוקים בתמונת היון מוצגת בחלון התוצאה להסיר אזורים בלתי חשובים.
      הערה: נוהל זה מגדיר את השטח החיוני של תמונת יון.
   2. לחץ על "למצוא קצה" על מנת למצוא את שכבת קצוני של תמונת היון.
   3. לחץ "לנכות" כדי לשמור את מידע שפע יון של שכבת קצוני במסד נתונים ולהסיר שכבה זו מתמונת היון בו זמנית. תיבת סימון מייצג שכבה קצוני זה תופיע ברשימת "נתוני תפוקה" של חלון התוצאה.
   4. חזור על שלבים 3.2.2 ו 3.2.3 עד מרכז התמונה יון מוגדר.
   5. לחץ ובחר את כל תיבות הסימון ברשימה "נתוני תפוקה" ולחץ על "יצוא" כדי לייצא את הנתונים.
   6. פתח את הנתונים המיוצאים באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני כדי לחשב את שפע יון הממוצע של כל השכבה כדי להשיג את המידע הפריסה המרחבית של יונים.

תוצאות

התמונות בהיר השדה כמו גם תמונות MS של שבר maltotriose ו ברדיקינין (1-7) מוכן עם טמפרטורת צלחת מדגם של 5 ו -25 ° C מוצגות באיור 1. במקרה של maltotriose sodiated, אות היון בעיקר מאכלס בשולי שטח המדגם כאשר הוא מוכן עם טמפרטורת צלחת מדגם של 25 מעלות צלזיוס. ובאמצעות ?...

Discussion

בהתבסס על תחזיות תיאורטיות קודמות, תזרים הידרודינמית מושרה טמפרטורה בתוך טיפות יכול להתגבר החוצה תזרים נימי מושרה על ידי אידוי ממס. היעילות של סחרור פנימי כזה של מולקולות מוגברות כאשר הטמפרטורה הדרגתית בתוך עליית רביב. על פי התוצאות ניבא, כאשר שמירה על טמפרטורת צלחת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Detergent powder	Alconox	242985
Methanol	Merck	106009
Acetonitrile	Merck	100003
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)	Sigma-Aldrich	T64602
Bradykinin fragment (1-7)	Sigma-Aldrich	B1651
Maltotriose	Sigma-Aldrich	47884
Pipette tips	Mettler Toledo	17005091
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification system	Millipore	ZMQS6VFT1
Powder-free nitrile gloves	Microflex	SU-690
600 ml beaker	Duran	2110648
Ultrasonic cleaner	Delta	DC300H
Hygrometer	Wisewind	5330
Nitrogen gas flowmeter	Dwyer	RMA-6-SSV
K-type thermocouples	Digitron	311-1670
Centrifuge	Select BioProducts	Force Mini
Pipette	Rainin	pipet-lite XLS
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Temperature controllable drying chamber	this lab
Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS)	this lab
MALDI-TOF stainless steel sample target	this lab