العزلة والثقافة من الخلايا البطانية الأولية من الشرايين والأوردة الكلاب

Summary

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Abstract

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Introduction

وتستخدم الكلاب كنموذج الحيوانات الكبيرة لأبحاث أمراض القلب والأوعية الدموية ويمكن أيضا تعاني من وراثي (الوراثية) تشوهات الأوعية الدموية ^{1 و 2.} ولدراسة هذه الأمراض غالبا ما تستخدم خطوط الخلايا البطانية التجارية لتقييم الخلايا البطانية وظيفة (EC). للكلاب هناك خط الخلية البطانية تجاري واحد متاح (CnAOEC)، والمستمدة من الشريان الأورطي الكلاب. يستخدم هذا الخط خلية معظمها في دراسات عن التحكم العادي ECS ^3-5. في مجال البحوث القلب والأوعية الدموية البشري خطوط الخلايا البطانية الأكثر شيوعا هي خلايا الحبل السري الإنسان الوريد غشائي (HUVECs) والسري الإنسان الشريان الخلايا البطانية (HUAECs) المستمدة من الوريد البشري الحبل السري والشريان، على التوالي. وقد استخدمت HUVECs كمعيار ذهبي في مجال البحوث الأوعية الدموية منذ 1980s ^6. وهي تعتبر أن النظام النموذج التقليدي لدراسة وظيفة بطانة الأوعية الدموية والتكيف مع المرض. الخلايا البطانية معزولة من الأوعية الدموية المختلفة تختلف في المظهره وظيفة بسبب الخلفية الوراثية والتعرض لالمكروية ^7. وبالإضافة إلى ذلك، وتستمد HUVECs وHUAECs من الحبل السري، وهيكل الأوعية الدموية التنموية التي قد لا الأوعية الدموية الكبار تقليد تماما فيما يتعلق الظروف التي يتعرضون لها والاستجابة للمرض. وبالتالي، ترجمة نتائج في HUVECs وHUAECs لمرض القلب والأوعية الدموية بشكل عام غير كافية.

عند دراسة التكيف وسلوك الكبار ECS، ECS الأولية من السفينة من الاهتمام ينبغي أن تستخدم باعتبارها نهجا أكثر مباشرة. لعزل هذه الخلايا، وقد تم الإبلاغ عن العديد من الطرق. وهناك طريقة وصفها على نطاق واسع، والذي يستخدم أيضا لHUVECs، وفلاشينغ السفينة مع حل الهضم الأنزيمي ^8. هذا غالبا ما يؤدي إلى تلوث مع غير ECS مثل خلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية ^9. آخر الطريقة المستخدمة في كثير من الأحيان لعزل هو الهضم الأنزيمي من الأنسجة سفينة مفروم تليها fluorescence-خلية تنشيط الفرز (FACS) بناء على البطانية العنقودية خلية علامة على التمايز (CD) 31 ^{7، 8.} FACS الفرز وزراعة الخلايا اللاحقة تتطلب كميات كبيرة نسبيا من الخلايا وبالتالي فهي ليست مناسبة لعزل البطانة من الأوعية الدموية الصغيرة. وبالتالي فإننا تهدف إلى تطوير وسيلة قوية جديدة لعزل محض السكان الخلية البطانية من مختلف الأوعية الدموية الكلاب مع نقاء عالية. لاختبار كفاءة أسلوب العزلة جديد، ونحن عزل وحصل نقية الثقافات الناب الابتدائية الخلية البطانية (CaPEC) من الشرايين والأوردة الكلاب مختلفة، كبيرها وصغيرها. يتيح هذا الأسلوب أيضا ثقافة الخلايا البطانية التي تنشأ من المريضة و / أو الأوعية الشاذة مثل يحول بوابية مجموعية داخل الإقليم أو خارج الكبد وراثي، وهو مرض شائع في الكلاب ^2. يسمح طريقة عزل أنواع الخلايا ذات الصلة إضافية من السفينة نفسها مثل خلايا العضلات الملساء الوعائية منذ أكثر من السفينة لا تزال كثافة العملياتالتصرف أثناء العملية.

Protocol

تم حصاد الأوعية الدموية المستخدمة في هذه الدراسة كمادة فائض تم الحصول عليها من الجثث الكلاب طازجة (ن = 4) من الكلاب صحية الموت الرحيم للبحث لا علاقة لها (سياسة جامعة 3R) الأخرى: الأخلاق بيان. تم حصاد الأوعية الدموية الشاذة (يحول بوابية مجموعية البينية وخارج الكبد، ن = 1 لكل منهما) بعد الوفاة بعد الموافقة المسبقة من أصحابها من الكلاب التي قدمت إلى عيادة الجامعة للحيوانات مدللة من جامعة أوتريخت.

1. العزلة والثقافة من الخلايا الابتدائية الناب غشائي

1. قبل معطف 6 لوحات جيدة مع 2 مل / جيد 0.5٪ ث / ت الجيلاتين ويترك لمدة 2 ساعة في حاضنة مع جو مرطب من 5٪ CO ₂ عند 37 درجة مئوية. إزالة حل الجيلاتين الزائد قبل البذر الخلايا الأولية.
2. جو معقم و مطهر إزالة الأوعية الدموية (ق) من الفائدة (على سبيل المثال، الشريان الأبهر، الوريد الأجوف، الوريد بورتا) من جديد الكلاب جيفة (الشكل 1A). الحفاظ على تشريح الجهاز سفينةعن طريق وضع ملقط على التوالي على طرفي السفينة من الفائدة. تجنب التلاعب غير الضرورية من النسيج مع ملقط لمنع تلف الخلايا البطانية.
   1. قطع السفينة فرضت على طرفي مع مقص جراحي وإزالتها من جيفة. النقل في هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS) على الجليد.
      ملاحظة: طول السفينة حوالي 5 سم ويفضل لهذا الإجراء، ولكن تلك التي تقيس 1 سم أيضا توفير ما يكفي من الخلايا في الثقافة.
3. نقل الأوعية الدموية إلى طبق بيتري مليئة HBSS الجليد الباردة. باستخدام مقص جراحي، وإزالة أي نوع من الأنسجة الملتصقة والدهون من خارج السفينة، والحفاظ على السفينة نفسها سليمة (الشكل 1B). تأكد من السفينة واضحة للعيان في جميع الأوقات عند قطع: سحب جانبا الأنسجة المحيطة بها مع المشبك أو الملقط لمشاهدة الأمثل.
   1. إغلاق أي فروع للسفينة مع الأربطة (على سبيل المثال، polyglactin 3-0) وبعد ذلك إزالتهامع مقص جراحي أو مشرط.
4. بعناية إدخال نهاية السفينة مع منحني ملقط البعوض هالستيد، المشبك غيض من ملقط في الطرف الآخر من السفينة ومن ثم التراجع، عكس ببطء السفينة حتى هو تماما الداخل الى الخارج (الشكل 1C-G). يتكون الخارج الآن من طبقة الخلايا البطانية. إذا واجهت أي صعوبة على عكس السفينة، يغرق في HBSS مرة أخرى للحد من الاحتكاك.
5. وضع الغرز صارة على طرفي السفينة لإغلاقه تماما ومنع التعرض للأي نوع من الأنسجة الوعائية غير البطانية لإجراء عملية الهضم (الشكل 1H). استخدام نهايات الربطة على التعامل مع السفينة المقلوبة.
6. إذا تم تنفيذ عملية الهضم والثقافة في وقت لاحق، cryopreserve السفينة المقلوبة قبل بروتوكول الهضم (الخطوة 1.7).
   1. وضع السفينة المقلوبة في cryovial وملء مع ثقافة الخلية تجميد المتوسطة. تجميد أسفل إلى -80 درجة مئوية باستخدام شارك تجميدNTAINER. مخزن في -80 درجة مئوية إذا السفن التي ستستخدم خلال أسبوع واحد. للتخزين على المدى الطويل، cryovials مكان في -180 درجة مئوية. عند تنفيذ العزلة الأوروبية، ذوبان الجليد في cryovials بسرعة في حمام مائي (37 درجة مئوية) ووضع على الفور في الجليد الباردة HBSS. المضي قدما كما هو مبين في 1.7.
      ملاحظة: خذ بعين الاعتبار أن العائد الكلي للECS بعد العزلة سيكون أقل بسبب فقدان الجدوى خلال عملية التجميد.
7. نقل السفينة إلى أنبوب 50 مل وشطفه مرتين في HBSS لإزالة كريات الدم الحمراء (أو المتوسطة تجميد المتبقية في حالة الذوبان) (الشكل 1I).
8. هضم السفينة في أنبوب 50 مل بمحلول مكون من 30 مل نوع كولاجيناز الثاني (0.15 U / مل)، وdispase (0.15 U / مل) في خلايا الناب غشائي النمو المتوسطة (CECGM) لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية مع متقطعة لطيف الإثارة.
9. إزالة وعاء من الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 250 × ز.
10. resuspend الكرية خلية في CECGM لالثانية البذور 2 تعليق خلية مل لكل بئر (1-3 الآبار اعتمادا على حجم السفينة). ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO ₂ في الهواء وتغيير مستنبت مرتين في الأسبوع.
11. مرور الخلايا عندما confluency من 70 - يتم التوصل إلى 80٪.
    1. غسل الخلايا مع حرارة ما قبل HBSS لإزالة الخلايا الميتة أو غير المرفقة. إضافة 200 ميكرولتر المؤتلف انزيم الخلية تفارق (1X) إلى كل بئر والمكان مرة أخرى في الحاضنة لمدة 5 دقائق أو إلى أن يتم فصل كل الخلايا.
    2. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل ووقف trypsinization بإضافة 10 مل من وسائل الاعلام والثقافة (CEGM) بما في ذلك 10٪ الجنين العجل المصل (FCS). أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 250 × ز. تواصل الثقافة في الجيلاتين قبل المغلفة لوحة أو قارورة.

2. توصيف

1. ثقافة الخلايا الناب الأورطي غشائي (CnAOECs) والمقارنة بين التشكل من خطوط الخلايا الأولية والتجارية مرتين أسبوعيا مع المجهر.
   ملاحظة: Tانه نموذجية تزايد نمط ECS في بقع يمكن أن يكون أفضل لاحظ عندما يتم التوصل إلى confluency من> 70٪.
   1. ثقافة CnAOECs في CECGM على قارورة T75 0.5٪ ث / ت الجيلاتين قبل المغلفة. خلايا مرور مرة واحدة في الأسبوع عندما confluency هو 70-80٪.
      1. لالركض، وغسل خلايا مرة واحدة مع درجة حرارة ما قبل HBSS وإضافة 1 مل المؤتلف خلية التفكك انزيم (1X). ضع قارورة مرة أخرى في حاضنة لمدة 5 دقائق أو إلى أن يتم فصل كل الخلايا. تعطيل التربسين بإضافة مستنبت 10 مل (CEGM) بما في ذلك 10٪ FCS. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 250 x ج، تجاهل طاف و resuspend الخلايا في مستنبت 1 مل.
      2. اتخاذ قسامة 10 ميكرولتر من التعليق الخلية وتمييع 1: 1 مع 0.4٪ التريبان الأزرق. عد الخلايا باستخدام عداد الخلية الآلي، ولوحة من 4.0 × 10 ⁵ خلايا قابلة للحياة في قارورة T75 الجديدة. إضافة 10 مل من CECGM قبل تحسنت إلى قارورة والثقافة في 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO _2.
2. عزل الحمض النووي الريبي من مرور 1 من CaPECs مثقف وCnAOECs.
   1. جمع لا يقل عن 1 × 10 ³ خلايا باعتباره بيليه، إضافة 20 ميكرولتر من كاشف إعداد العينات (SPR)، واحتضان لمدة 1 دقيقة لليز الخلايا. بعد مرور فترة الحضانة، وجمع بعناية المحللة خلية تحتوي على الحمض النووي الريبي مجموع ومخزن في -70 درجة مئوية.
3. تحويل مرنا إلى كدنا] باستخدام عدة توليف [كدنا (على سبيل المثال، iScript) تنفيذا لتعليمات الشركة المصنعة. متجر كدنا] في 4 درجات مئوية تصل إلى أسبوع واحد، أو في -20 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل حتى على استعداد لأداء QPCR.
4. قياس التعبير الجيني للCD31 علامة البطانية لتأكيد أصل الخلايا البطانية. أداء الإعداد التجريبية والكمي باستخدام المبادئ التوجيهية المحاضر الموجزة MIQE ^10. للتطبيع، وقياس التعبير عن الجينات إشارة GAPDH، RPS19، وB2MG ^11.
   1. إعداد التخفيف 10 أضعاف من كدنا] التي تم الحصول عليها في المياه الحرة نوكلياز.
   2. إعدادالتخفيف 4 أضعاف من عينات كدنا] تجميع للخط القياسية واستخدام المياه مجانا نوكلياز كعنصر تحكم غير القالب. تمييع عينات خمس مرات للوصول إلى التخفيف الكلي 50 ضعفا عن ردود الفعل QPCR. ماصة 10 ميكرولتر ردود الفعل في مكررة في شكل 384 جيدا باستخدام 4 ميكرولتر [كدنا و 6 ميكرولتر من fluorophore مختلطة مع 20 بمول من الاتجاه المعاكس والتمهيدي إلى الأمام (الجدول 1).
   3. وضع برنامج ل95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتنشيط البلمرة طق، تليها 39 دورات من 10 ثانية في 95 درجة مئوية لمدة تمسخ، و 30 ثانية في تيم لالصلب واستطالة. يظهر تيم لكل مجموعة التمهيدي في الجدول 1.
   4. أداء ذوبان منحنى تحليل بعد كل شوط لضمان منتج واحد فقط يتم تضخيمه. تطبيع مستويات التعبير من العينات باستخدام متوسط ​​الكمية النسبية للجينات مرجعية، وحساب ΔCt إذا كانت فعالية رد الفعل ما بين 95٪ و 105٪.
5. تقييم الأداء الوظيفي EC مع أنجيogenesis الفحص.
   1. إضافة 10 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية إلى كل بئر من شريحة الأوعية الدموية تبرد قبل وانتشرت مع طرف ماصة لتغطية سطح البئر. الحفاظ على المصفوفة خارج الخلية على الجليد وتجنب إدخال فقاعات الهواء في هلام. ترسيخ هلام عن طريق وضع شريحة في طبق بيتري مع الماء المنقوع المناشف الورقية في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ لمدة 30 دقيقة.
   2. إضافة 1.0 × 10 ⁴ الابتدائي ECS في 50 ميكرولتر غشائي النمو المتوسطة لكل بئر. احتضان الشريحة لمدة 6 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.
   3. بعد 6 ساعات التقاط الصور مع التكبير 20X، والتأكد من أن تشمل البئر كله في الصورة.

النتائج

تعرض الأوعية الدموية المختلفة بنجاح إلى بروتوكول العزلة وصفها (الشكل 2). كان من الممكن لتشريح وعكس الشريان الأبهر، الوريد الأجوف، بورتا الوريد، والشريان التاجي من الكلاب صحية (جميع السفن من كل كلب، ن = 4). مع وعزل ECS النهج نفسه من اثنين يحول بو...

Discussion

في الدراسات التي تركز على الكلاب ECS يستخدم الخط الأساسي CnAOEC لنموذج الأنساب البطانية الكلب ^{3 و 12 و 13.} في الدراسات الإنسانية، ثقافة HUVEC لا يزال يعتبر معيار الذهب. ومن الواضح أن مجرد التركيز على ECS المستمدة من الحبل السري هو تقييد راسخ في الأبحاث القلب والأوعية الدمو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM (1X) + GlutaMAX	Life Technologies	31966-021
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-050
Canine Endothelial Cells Growth Medium	Cell Applications	Cn211-500
CnAOECs	Cell Applications	Cn304-05
Fetal Calf Serum (FCS)	GE Healthcare	16000-044
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013
SPR	Bio-Rad	170-8898
iScript synthesis kit	Bio-Rad	170-8891
SYBR green super mix	Bio-Rad	170-8886
Recovery Cell Freezing Medium	Gibco/Life Technologies	12648-010	Keep on ice prior to use
Freezing container, Nalgene Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)	B. Braun Medical	BC555R
Mosquito forceps	B. Braun Medical	FB440R
Mosquito forceps curved	B. Braun Medical	FB441R
polyglactin 3-0	Ethicon	VCP311H
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013
Automated counting chamber	Bio-Rad	145-0102
Counting Slides, Dual Chamber	Bio-Rad	145-0011
Matrigel	BD Biosciences	BD356231	Slowly thaw on ice
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	81501
Endothelial Growth Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 SingleQuot Kit	Lonza	CC-4176