Aislamiento y cultivo de células endoteliales primarias de las arterias y venas caninas

Resumen

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Resumen

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Introducción

Los perros se utilizan como gran modelo animal para la investigación de enfermedades cardiovasculares y también pueden sufrir de anomalías congénitas vasculares (genéticos) ^{1, 2.} Para estudiar estas enfermedades líneas de células endoteliales comerciales a menudo se utilizan para evaluar la funcionalidad de las células endoteliales (CE). Para los perros hay una línea de células endoteliales comercial disponible (CnAOEC), derivado de la aorta canino. Esta línea celular se utiliza sobre todo en los estudios como el control normal de los EC ^3-5. En la investigación cardiovascular humano las líneas de células endoteliales más comúnmente utilizadas son células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) y de la arteria umbilical humana Las células endoteliales (HUAECs) derivadas de la vena umbilical humana espinal y la arteria, respectivamente. HUVECs se han utilizado como el estándar de oro en la investigación vascular desde la década de 1980 ^6. Ellos son considerados como el sistema clásico modelo para estudiar la función endotelial y la adaptación de la enfermedad. Las células endoteliales aisladas de diferentes vasos sanguíneos varían en appearance y funcionalidad debido a antecedentes genéticos y la exposición al microentorno ^7. Además, HUVECs y HUAECs se derivan de cordón umbilical, una estructura vascular del desarrollo que no pueden vasos sanguíneos adulto completamente imitan con respecto a las condiciones que se exponen a y la respuesta a la enfermedad. Por lo tanto, la traducción de los resultados encontrados en las HUVEC y HUAECs de enfermedades cardiovasculares en general es insuficiente.

Cuando se estudia la adaptación y comportamiento de los adultos EC, EC primarias del vaso de interés deben utilizarse como un enfoque más directo. Para aislar estas células, se han descrito varios métodos. Un método ampliamente descrito, que también se utiliza para HUVECs, está vaciando el recipiente con una solución de digestión enzimática ^8. Esto a menudo resulta en la contaminación con no ECs tales como las células de músculo liso y fibroblastos ^9. Otro método utilizado frecuentemente para el aislamiento es la digestión enzimática de tejido de vasos picada seguido de por fluorescenciade células activadas (FACS) basado en Cluster marcador de células endoteliales de diferenciación (CD) 31 ^{7, 8.} FACS clasificación y cultivo celular posterior requiere cantidades relativamente grandes de las células y por lo tanto no es adecuado para el aislamiento de endotelio de los vasos sanguíneos pequeños. Por lo tanto, el objetivo fue desarrollar un nuevo método robusto para aislar una población pura de células endoteliales de diversos vasos sanguíneos caninos con alta pureza. Para probar la eficacia del nuevo método de aislamiento, se aislaron y se obtuvieron cultivos puros Canine primaria de células endoteliales (CAPEC) de diferentes arterias y venas canino, tanto grandes como pequeñas. Este método también permite que el cultivo de células endoteliales procedentes de enfermo y / o vasos aberrantes tales como derivaciones portosistémicas intra o extra-hepáticos congénitos, una enfermedad común en los perros ^2. El método permite el aislamiento de tipos de células relevantes adicionales de la misma embarcación, tales como células de músculo liso vascular ya que la mayoría de la embarcación permanece intactuar durante el procedimiento.

Protocolo

Ética declaración: Los vasos sanguíneos utilizados en este estudio fueron cosechadas como material excedente obtenido a partir de cadáveres caninos frescas (n = 4) de los perros sanos sacrificados para otras investigaciones no relacionado (política de la Universidad 3R). vasos sanguíneos anormales (derivación portosistémica intra y extrahepáticas, n = 1 cada uno) fueron cosechadas después de la muerte tras el consentimiento informado de los propietarios de los perros presentados a la Clínica Universitaria de Animales de Compañía de la Universidad de Utrecht.

1. Aislamiento y cultivo de células endoteliales primaria canina

1. Pre-coat placas de 6 pocillos con 2 ml / pocillo 0,5% w / v de gelatina y se deja durante 2 horas en una incubadora con una atmósfera humidificada de 5% _{de CO2} a 37 ° C. Eliminar el exceso de solución de gelatina antes de la siembra de las células primarias.
2. Asépticamente eliminar el vaso sanguíneo (s) de interés (por ejemplo, aorta, vena cava, la vena porta) de un fresco canino cadáver (Figura 1A). Mantener la anatomía del sistema de vasosmediante la colocación de pinzas rectas en ambos extremos del vaso de interés. Evitar la manipulación innecesaria de tejido con unas pinzas para evitar daños en las células endoteliales.
   1. Cortar el recipiente sujetado en ambos extremos con tijeras quirúrgicas y retirar del cadáver. Transporte en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) en hielo.
      NOTA: A la eslora del buque de aproximadamente 5 cm es el preferido para este procedimiento, pero los que miden 1 cm también proporcionará suficientes células para la cultura.
3. Transferir el vaso sanguíneo a una placa de Petri llena de HBSS enfriado con hielo. Usando tijeras quirúrgicas, eliminar cualquier tejido adherente y la grasa de la parte exterior del recipiente, manteniendo el recipiente en sí intacta (Figura 1B). Asegúrese de que el buque es claramente visible en todo momento cuando se corta: tirar de un lado el tejido circundante con una pinza o una pinza para la visión óptima.
   1. Cierre todas las ramas de la embarcación con ligaduras (por ejemplo, poliglactina 3-0) y posteriormente eliminarloscon unas tijeras quirúrgicas o un bisturí.
4. Introducir cuidadosamente un extremo recipiente con un fórceps curvos mosquito Halsted, sujete la punta de las pinzas en el otro extremo del recipiente y luego retraer, invirtiendo lentamente el recipiente hasta que esté completamente dentro hacia fuera (Figura 1C-G). El exterior ahora consiste en la capa de células endoteliales. Si cualquier dificultad se encuentra en la inversión del recipiente, sumergir en HBSS de nuevo para reducir la fricción.
5. Coloque suturas en bolsa de tabaco en ambos extremos de la vasija para cerrarla completamente y para evitar la exposición de cualquier tejido vascular no endotelial para el procedimiento de digestión (Figura 1H). Usa los extremos de ligadura para manipular el recipiente invertido.
6. Si la digestión y la cultura se lleva a cabo más tarde, criopreservar el recipiente invertido antes de la digestión de protocolo (paso 1.7).
   1. Coloque el recipiente invertido en un criovial y se llenan de cultivo celular medio de congelación. Congelar hasta -80 ° C utilizando un co congelaciónntainer. Almacenar a -80 ° C, si los barcos se van a utilizar dentro de una semana. Para el almacenamiento a largo plazo, en lugar crioviales -180 ° C. Al realizar el aislamiento CE, descongelar los crioviales rápidamente en un baño de agua (37 ° C) y colocar inmediatamente en HBSS enfriado con hielo. Proceder como se indica en 1.7.
      NOTA: Tenga en cuenta que el rendimiento total de los CE después del aislamiento será más bajo debido a la pérdida de viabilidad durante el proceso de congelación.
7. Transferir el buque a un tubo de 50 ml y enjuague dos veces en HBSS para eliminar los eritrocitos (o medio de congelación residual en caso de descongelación) (Figura 1I).
8. Digerir el recipiente en un tubo de 50 ml con una solución de 30 ml de colagenasa tipo II (0,15 U / ml) y dispasa (0,15 U / ml) en células caninas medio de crecimiento endotelial (CECGM) durante 1 hora a 37 ° C con suave intermitente agitación.
9. Retire el recipiente del tubo y centrifugar la suspensión celular durante 5 minutos a 250 x g.
10. Resuspender el sedimento celular en un CECGMnd semilla de 2 ml de suspensión celular por pocillo (1 - 3 pozos dependiendo del tamaño del recipiente). Cultivar las células a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de _CO2 en aire y el cambio del medio de cultivo dos veces por semana.
11. El paso de las células cuando una confluencia del 70 - 80% se alcanza.
    1. Lavar las células con HBSS precalentado para eliminar las células muertas o no inscritos. Añadir 200 enzima de disociación celular recombinante l (1x) a cada pocillo y colocar de nuevo en la incubadora durante 5 min o hasta que se separan todas las células.
    2. Transferir las células a un tubo de 15 ml y dejar de tripsinización añadiendo 10 ml de medios de cultivo (CEGM) incluyendo 10% suero fetal de ternera (FCS). Centrifugar durante 5 min a 250 x g. Continuar la cultura en una placa de gelatina pre-recubiertos o frasco.

2. Caracterización

1. Cultura células endoteliales aórticas canina (CnAOECs) y comparar la morfología de las líneas de células primarias y comerciales dos veces por semana con un microscopio.
   NOTA: Tlo típico patrón de crecimiento en los EC parches mejor se puede observar cuando se alcanza una confluencia de> 70%.
   1. Cultura CnAOECs en CECGM en un matraz T75 0,5% w / v de gelatina pre-revestido. células de paso una vez a la semana cuando la confluencia puede alcanzar el 70 - 80%.
      1. Para los pases, se lavan las células una vez con HBSS precalentado y añadir 1 ml de la enzima de disociación celular recombinante (1x). Colocar el matraz de nuevo en la incubadora durante 5 min o hasta que se separan todas las células. Inactivar la tripsina mediante la adición de medio de cultivo 10 ml (CEGM) que incluye 10% de FCS. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 250 xg, descartar el sobrenadante y resuspender las células en medio de cultivo 1 ml.
      2. Tomar una parte alícuota de 10 l de la suspensión de células y diluir 1: 1 con 0,4% de azul de tripano. Contar las células usando un contador de células automatizado y se resiembra 4,0 x 10 ⁵ células viables en un nuevo matraz T75. Añadir 10 ml de CECGM pre-calentado al matraz y la cultura a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de _CO2.
2. Aislar el ARN del paso 1 de los CaPECs cultivadas y CnAOECs.
   1. Recoge al menos 1 x 10 ³ células como un gránulo, añadir 20 l de reactivo de preparación de la muestra (SPR) y se incuba durante 1 min para lisar las células. Después de la incubación, recoger cuidadosamente el lisado celular que contiene el ARN total y se almacena a -70 ° C.
3. Convertir ARNm en ADNc usando un kit de síntesis de ADNc (por ejemplo, iScript) siguiendo las instrucciones del fabricante. ADNc se almacena a 4 ° C durante hasta una semana, oa -20 ° C a largo plazo hasta que esté listo para realizar la qPCR.
4. Medir la expresión génica de la CD31 marcador endotelial para confirmar el origen de las células endoteliales. Realice la configuración experimental y cuantificación utilizando las directrices de actas MIQE ^10. Para la normalización, medir la expresión de genes de referencia GAPDH, rps19, y B2MG ^11.
   1. Preparar una dilución de 10 veces del cDNA obtenido en agua libre de nucleasa.
   2. Prepararuna dilución de 4 veces a partir de muestras de cDNA mancomunados a la línea estándar y el uso de agua libre de nucleasa como un control sin plantilla. Diluir las muestras cinco veces para llegar a un total de dilución de 50 veces para las reacciones de qPCR. Pipeta de 10 l reacciones por duplicado en un formato de 384 pocillos usando 4 l de cDNA y 6 l del fluoróforo se mezcla con 20 pmol de cebador directo y reverso (Tabla 1).
   3. Configurar el programa para 95 ° C durante 5 min para la activación de la polimerasa Taq, seguido por 39 ciclos de 10 segundos a 95 ° C para la desnaturalización, y 30 seg a Tm para el recocido y elongación. La Tm para cada conjunto de cebadores se muestra en la Tabla 1.
   4. Ejecutar un análisis de curva de fusión después de cada carrera que exista un sólo producto se amplifica. Normalizar los niveles de expresión de las muestras usando la cantidad relativa media de los genes de referencia, y calcular el Ct si la eficiencia de reacción está entre 95% y 105%.
5. Evaluar la funcionalidad CE con un angiogenesis ensayo.
   1. Añadir 10 l de matriz extracelular a cada pocillo de un portaobjetos de angiogénesis pre-enfriado y extender con una punta de pipeta para cubrir la superficie del pozo. Mantener la matriz extracelular en hielo y evitar la introducción de burbujas de aire en el gel. Solidificar el gel mediante la colocación de la corredera en una placa de Petri con agua empapada toallas de papel en una incubadora a 37 ° C con 5% de _CO2 durante 30 min.
   2. Añadir 1,0 x 10 ⁴ primaria EC en 50 l de Crecimiento Endotelial de medio por pocillo. Incubar el portaobjetos durante 6 horas a 37 ° C con 5% de CO _2.
   3. Después de 6 horas tomar fotografías con una ampliación de 20X, asegurándose de incluir todo el bien en la imagen.

Resultados

Diferentes vasos sanguíneos se sometieron con éxito para el protocolo de aislamiento descrito (Figura 2). Fue posible diseccionar e invierta aorta, vena cava, la vena porta y la arteria coronaria de perros sanos (todos los buques de cada perro, n = 4). Con los mismos ECs de aproximación se aislaron a partir de dos derivación portosistémica congénita (extrahepática y intrahepática, n = 1 cada uno). Aunque aorta se invierte fácilmente, los segmentos de aorta torá...

Discusión

En los estudios que se centran en los EC canina de la línea primaria CnAOEC se utiliza para modelar los linajes endoteliales del perro ^{3, 12, 13.} En estudios en humanos, la cultura HUVEC todavía se considera el estándar de oro. Claramente, centrándose simplemente en ECs derivadas de cordón umbilical es una restricción firme en la investigación cardiovascular. Las células endoteliales tienen un patrón de expresión de genes específicos para determinar la especificación arteriovenosa. Con el fin de d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM (1X) + GlutaMAX	Life Technologies	31966-021
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-050
Canine Endothelial Cells Growth Medium	Cell Applications	Cn211-500
CnAOECs	Cell Applications	Cn304-05
Fetal Calf Serum (FCS)	GE Healthcare	16000-044
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013
SPR	Bio-Rad	170-8898
iScript synthesis kit	Bio-Rad	170-8891
SYBR green super mix	Bio-Rad	170-8886
Recovery Cell Freezing Medium	Gibco/Life Technologies	12648-010	Keep on ice prior to use
Freezing container, Nalgene Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)	B. Braun Medical	BC555R
Mosquito forceps	B. Braun Medical	FB440R
Mosquito forceps curved	B. Braun Medical	FB441R
polyglactin 3-0	Ethicon	VCP311H
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013
Automated counting chamber	Bio-Rad	145-0102
Counting Slides, Dual Chamber	Bio-Rad	145-0011
Matrigel	BD Biosciences	BD356231	Slowly thaw on ice
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	81501
Endothelial Growth Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 SingleQuot Kit	Lonza	CC-4176