בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים

Summary

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Abstract

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Introduction

כלבים משמשים כמודל חיה גדול למחקר מחלות לב וכלי דם וכן עלול לסבול מולדת (גנטי) מומים בכלי דם ^{1, 2.} כדי לחקור מחלות אלה שורות תאים מסחריות אנדותל משמשות לעתים קרובות כדי להעריך תא האנדותל פונקציונלי (EC). לכלבים יש קו תא האנדותל מסחרי אחד זמין (CnAOEC), נגזר האאורטה כלבים. שורת תאים זה משמשת בעיקר במחקרים כשליטה נורמלית ECS ^3-5. במחקר לב וכלי דם אדם שורות תאי אנדותל הנפוץ ביותר הם אדם טבורי הווריד לתאי אנדותל (HUVECs) ותאי האנדותל עורקים אדם טבורים (HUAECs) נגזרים ורידים ועורקים כבל אדם טבור, בהתאמה. HUVECs שמש כתקן זהב במחקר וסקולרית מאז 1980 ^6. הם נחשבים מערכת המודל הקלסית ללמוד תפקוד האנדותל והתאמת מחלה. תאי האנדותל מבודדים כלי דם שונים להשתנות appearancדואר ופונקציונליות בשל רקע גנטי וחשיפה במיקרו-סביבה של ^7. בנוסף, HUVECs ו HUAECs נגזרות חבל הטבור, מבנה כלי הדם התפתחותי שעלול לא לחקות באופן מלא כלי דם בוגרים ביחס לתנאי הם נחשפים ותגובה למחלות. לפיכך, תרגום תוצאות שנמצאו HUVECs ו HUAECs למחלות לב וכלי דם בכלל אינו מספק.

כאשר לומד הסתגלות והתנהגות של ECS המבוגרת, ECS העיקרי מהספינה של ריבית צריך לשמש גישה ישירה יותר. כדי לבודד תאים אלה, מספר שיטות דווחו. שיטה שתואר נרחב, אשר משמש גם HUVECs, מוחקת את הספינה עם פתרון עיכול אנזימטי ^8. זה לעתים קרובות תוצאות זיהום עם הלא-ECS כגון תאי שריר חלק פיברובלסטים ^9. שיטה נוספת בשימוש תדיר לבידוד היא עיכול אנזימטי של רקמת כלי הטחונה ואחריו fluorescence-תא מיון מופעל (FACS) מבוסס על אשכול סמן תא האנדותל של בידול (CD) 31 ^{7, 8.} FACS מיון תרבית תאים עוקבות דורש כמויות גדולות יחסית של תאים, ולכן הוא לא מתאים הבידוד של האנדותל מכלי דם קטנים. לפיכך, אנו שמטרתה לפתח שיטה חזקה חדשה לבידוד אוכלוסיית תא האנדותל טהורה מכלי דם כלבים שונים עם טוהר גבוה. כדי לבדוק את יעילות שיטת הבידוד החדשה, אנחנו מבודדים וקבלנו תא האנדותל הראשי כלב טהור (CaPEC) תרבויות מן עורקי כלבים שונים ורידים, גדולים וקטנים כאחד. שיטה זו גם מאפשרת התרבות של תאי אנדותל שמקורם חולה ו / או כלי סוטה כגון shunts portosystemic תוך או חוץ-כבדית מולד, מחלה נפוצה אצל כלבים ^2. השיטה מאפשרת הבידוד של תאים מסוגים רלוונטיים נוספים של אותו הכלי כמו תאי שריר חלק בכלי דם מאחר שרוב הכולים נשאר intלפעול במהלך ההליך.

Protocol

אתיקת הצהרה: כלי דם השתמשו במחקר זה נבצרו כחומר עודף המתקבל גוויות כלבים טריות (n = 4) מכלבים בריאים מורדמים למחקר קשור אחרת (מדיניות האוניברסיטה 3R). כלי הדם סוטה (shunts portosystemic התוך extrahepatic, n = 1 כל אחד) נבצרו שלאחר המוות לאחר הסכמה מדעת של בעלי מכלבים בפני מרפאת אוניברסיטת עבור חיות של אוניברסיטת אוטרכט.

1. ניתוק והתרבות של תאים האנדותל לכלבים ראשיים

1. טרום מעיל 6-גם צלחות עם 2 מ"ל / גם 0.5% w / v ג'לטין ולהשאיר למשך 2 שעות באינקובטור עם אווירה humidified של 5% CO ₂ על 37 מעלות צלזיוס. סור פתרון ג'לטין עודף לפני זריעת התאים הראשוניים.
2. בסביבה נקיה מחיידקים, להסיר את כלי הדם (ים) של עניין (למשל, אב עורקים, וריד נבוב, נבוב פורטה) מתוך (איור 1 א) פגר כלב טרי. לשמור על האנטומיה של מערכת כליעל ידי הצבת מלקחיים ישרים בשני הקצוות של כלי השיט של עניין. הימנע מניפולציה מיותרת של הרקמה עם מלקחיים כדי למנוע נזק לתאי אנדותל.
   1. חותך את הכלי המהודק בשני הקצוות עם מספרי כירורגיות ומסיר את הגופה. תחבורה תמיסת המלח המאוזן של האנק (HBSS) על קרח.
      הערה: כלי באורך של כ -5 סנטימטר היא מועדף עבור הליך זה, אבל אלה המודדים 1 סנטימטר גם יספקו מספיק תאים לתרבות.
3. מעביר את כלי הדם כדי בצלחת פטרי המלאה HBSS קר כקרח. בעזרת מספרי כירורגיות, להסיר את כל רקמת שומן חסיד מהחלק החיצוני של הספינה, שמירה על הכלי עצמו ללא פגע (איור 1 ב). ודא הכלי נראה בבירור בכל העת כאשר חיתוך: מסיט הצידה את הרקמה שמסביב עם מהדק או מלקחיים עבור תצוגה אופטימלית.
   1. סגור את כל הסניפים של כלי השיט עם ליגטורה (למשל, polyglactin 3-0) ובהמשך להסיר אותםעם מספריים כירורגיות או אזמל.
4. בזהירות להזין סוף כלי עם מלקחי יתוש מעוקלים הלסטד, מהדק את קצה המלקחיים בקצה השני של הספינה ולאחר מכן לחזור בו, היפוך הכלי לאט עד שהוא לגמרי מבפנים החוצה (איור 1 ג-ז). מבחוץ עכשיו מורכב של שכבת תא האנדותל. אם כל קושי הוא נתקל על היפוך הכלי, לצלול HBSS שוב כדי להפחית את החיכוך.
5. מניחים התפרים הארנק מיתרים בשני קצותיו של כלי השיט כדי לסגור אותו לחלוטין כדי למנוע חשיפה של כל רקמת כלי הדם הלא-אנדותל לנוהל העיכול (1H איור). השתמש הקצוות ליגטורה לתפעל את הכלי ההפוך.
6. אם עיכול והתרבות מתבצע מאוחר יותר, cryopreserve הספינה ההפוכה לפני פרוטוקול העיכול (שלב 1.7).
   1. מניח את הכלי ההפוך בתוך cryovial ולמלא עם תרבית תאי הקפאה בינונית. להקפיא עד -80 ° C באמצעות שיתוף הקפאהntainer. חנות ב -80 ° C אם כלי ישמשו בתוך שבוע. עבור אחסון לטווח ארוך, במקום cryovials ב -180 מעלות צלזיוס. בעת ביצוע הבידוד EC, להפשיר את cryovials במהירות באמבט מים (37 מעלות צלזיוס) ומכניסים מיד HBSS קר כקרח. המשך כמצוין 1.7.
      הערה: קח בחשבון כי התשואה הכוללת של ECS לאחר הבידוד תהיה נמוכה כתוצאה מאובדן כדאיות במהלך תהליך ההקפאה.
7. מעביר את הכלי לצינור 50 מ"ל ולשטוף אותו פעמים HBSS להסיר אריתרוציטים (או בינוני הקפאה שיורית במקרה של הפשרה) (איור 1 ט).
8. לעכל את כלי בתוך שפופרת 50 מ"ל עם פתרון מסוג 30 מ"ל collagenase השנייה (0.15 U / ml) ו dispase (0.15 U / ml) בתאי האנדותל לכלבים צמיחה בינוני (CECGM) במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס עם לסירוגין עדין תסיסה.
9. הסר את הכלי מצינור צנטריפוגות השעית התא במשך 5 דקות ב 250 x גרם.
10. Resuspend גלולה תא CECGMnd ההשעיה תא מ"ל זרע 2 לכל טוב (1 - 3 בארות בהתאם לגודל כלי). התרבות התאים ב 37 ° C באווירה humidified עם 5% CO ₂ באוויר ולשנות את המדיום תרבות פעמיים בשבוע.
11. מעבר התאים כאשר confluency של 70 - 80% הוא הגיע.
    1. שוטפים את התאים עם HBSS מחומם מראש כדי להסיר תאים מתים או שאינם מחוברים. הוסף 200 μl אנזים רקומביננטי תא דיסוציאציה (1x) זה טוב ומניח בחזרה בחממה במשך 5 דקות או עד שכל התאים מנותקים.
    2. מעבירים את התאים לצינור 15 מ"ל ולעצור trypsinization ידי הוספת 10 מ"ל של התקשורת בתרבות (CEGM) כולל 10% עוברית עגל בסרום (FCS). צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 250 x. המשך התרבות צלחת או בקבוק מראש מצופה ג'לטין.

אפיון 2.

1. לתאי אנדותל התרבות כלבים אבי העורקים (CnAOECs) ולהשוות את המורפולוגיה של שורות תאים ראשוניים מסחרי פעמיים בשבוע עם מיקרוסקופ.
   הערה: Tהוא אופייני גדל דפוס של ECS בטלאים יכול להיות הכי טוב שנצפה כאשר confluency של> 70% הוא הגיע.
   1. תרבות CnAOECs ב CECGM על ג'לטין 0.5% w / v מצופה מראש בבקבוק T75. תאי מעבר פעם בשבוע כאשר confluency הוא 70 - 80%.
      1. לקבלת passaging, לשטוף את התאים פעם עם HBSS מחומם מראש ולהוסיף 1 מ"ל אנזים התא דיסוציאציה רקומביננטי (1x). מניח את הבקבוק בחזרה בחממה במשך 5 דקות או עד שכל התאים מנותקים. להשבית טריפסין על ידי הוספת בינוני תרבות 10 מ"ל (CEGM) כולל 10% FCS. צנטריפוגה ההשעיה תא במשך 5 דקות ב 250 XG, וזורקים supernatant ו resuspend התאים במדיום תרבות 1 מ"ל.
      2. קחו aliquot 10 μl של ההשעיה תא לדלל 1: 1 עם 0.4% trypan כחול. ספירת התאים באמצעות דלפק תא אוטומטי, צלחת החוצה 4.0 x 10 ⁵ תאי קיימא בבקבוק T75 חדש. הוסף 10 מ"ל של מחומם מראש CECGM אל הבקבוק ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% CO _2.
2. לבודד RNA מפסוק 1 של CaPECs התרבותי CnAOECs.
   1. אסוף לפחות 1 x 10 ³ תאים כמו גלולה, להוסיף 20 μl של מגיב הכנת המדגם (SPR) ו דגירה של 1 דק 'כדי lyse התאים. לאחר דגירה, בזהירות לאסוף את lysate התא המכיל RNA ולאחסן הכולל ב -70 ° C..
3. המרת mRNA כדי cDNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA (למשל, iScript) בהתאם להוראות היצרן. cDNA חנות ב 4 ° C עד שבוע, או ב -20 ° C לטווח ארוך עד מוכן לבצע את qPCR.
4. מדוד ביטוי גנים של CD31 סמן אנדותל לאשר ממוצא תא האנדותל. בצע התקנה ניסיונית וכימות באמצעות הנחיות תמצית MIQE ^10. לנורמליזציה, למדוד ביטוי של גנים התייחסות GAPDH, RPS19, ו B2MG ^11.
   1. הכן דילול של פי 10 של cDNA שהושגו מים חינם nuclease.
   2. להכיןדילול של פי 4 ממדגם cDNA ונקוו עבור הקו הרגיל ולהשתמש מים חינם nuclease כביקורת הלא תבנית. לדלל את הדגימות חמש פעמים להגיע דילול כולל של פי 50 לתגובות qPCR. פיפטה 10 תגובות μl בשני עותקים בפורמט 384 גם באמצעות 4 cDNA μl ו -6 μl של fluorophore מעורבב עם 20 pmol של הפוך פריימר קדימה (טבלה 1).
   3. הגדר את התוכנית עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עבור הפעלת פולימראז תקי, ואחריו 39 מחזורים של 10 שניות על 95 מעלות צלזיוס למשך denaturation, ו -30 שניות ב Tm עבור חישול התארכות. ה- TM עבור כל קבוצה פריימר מוצג בטבלה 1.
   4. לבצע המסת עקומת המנתח הבאה כל ריצה כדי להבטיח מוצר אחד בלבד מוגברת. לנרמל את רמות הביטוי של דגימות באמצעות הכמות היחסית הממוצעת של גנים התייחסות, ולחשב את ΔCt אם יעילות התגובה היא בין 95% ו -105%.
5. להעריך פונקציונלי EC עם angiassay ogenesis.
   1. הוסף 10 μl של מטריקס היטב בכל שקופית אנגיוגנזה טרום מקורר להתפשט עם קצה פיפטה כדי לכסות את פני השטח של הבאר. שמור את תאי מטריקס על הקרח ולהימנע כניסתה של בועות אוויר לתוך הג'ל. לחזק את הג'ל על ידי הצבת את השקופית בצלחת פטרי עם מגבות נייר ספוגה מים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ למשך 30 דקות.
   2. להוסיף 1.0 x 10 ⁴ עיקרי ECS ב 50 μl בינוני צמיחה האנדותל לכל טוב. דגירת השקופיות עבור 6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
   3. לאחר 6 שעות לצלם עם הגדלה 20X, והקפד לכלול הבאר כולו בתמונה.

תוצאות

כלי דם שונים היו נתונים בהצלחת פרוטוקול הבידוד המתואר (תרשים 2). אפשר היה לנתח והפוך אבי העורקים, הווריד הנבוב, פורטה הנבוב, ואת העורקים הכליליים מכלבים בריאים (כל כלי מכל כלב, n = 4). עם אותה ECS הגישה בודדה שני shunts portosystemic המולד (extrahepatic ו intrahepatic, n ...

Discussion

במחקרי ההתמקדות כלבית ECS הקו העיקרי CnAOEC משמש מודל השושלות האנדותל של הכלב ^{3, 12, 13.} במחקרים בבני אדם, תרבות HUVEC עדיין נחשבה תקן הזהב. ברור, התמקדות רק על ECS נגזרה חבל טבור היא הגבלת משרד במחקר לב וכלי דם. יש לתאי אנדותל דפוס ביטוי גנים ספציפיים קביעת מפרט arteriovenous. על מנ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM (1X) + GlutaMAX	Life Technologies	31966-021
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-050
Canine Endothelial Cells Growth Medium	Cell Applications	Cn211-500
CnAOECs	Cell Applications	Cn304-05
Fetal Calf Serum (FCS)	GE Healthcare	16000-044
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013
SPR	Bio-Rad	170-8898
iScript synthesis kit	Bio-Rad	170-8891
SYBR green super mix	Bio-Rad	170-8886
Recovery Cell Freezing Medium	Gibco/Life Technologies	12648-010	Keep on ice prior to use
Freezing container, Nalgene Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)	B. Braun Medical	BC555R
Mosquito forceps	B. Braun Medical	FB440R
Mosquito forceps curved	B. Braun Medical	FB441R
polyglactin 3-0	Ethicon	VCP311H
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013
Automated counting chamber	Bio-Rad	145-0102
Counting Slides, Dual Chamber	Bio-Rad	145-0011
Matrigel	BD Biosciences	BD356231	Slowly thaw on ice
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	81501
Endothelial Growth Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 SingleQuot Kit	Lonza	CC-4176