Isolierung und Kultur von primären Endothelzellen von Canine Arterien und der

Zusammenfassung

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Zusammenfassung

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Einleitung

Hunde sind als Großtiermodell für kardiovaskuläre Erkrankungen Forschung und auch von angeborener (genetischen) Gefäßanomalien ^{1, 2} leiden können. Um diese Krankheiten kommerziellen Endothelzelllinien studieren häufig verwendet werden , um Endothelzellen (EC) Funktionalität beurteilen. Für Hunde gibt es eine kommerzielle Endothelzelllinie verfügbar (CnAOEC), von Eckzahn Aorta abgeleitet. Diese Zelllinie ist vor allem in Studien als Kontrolle normalen ECs ^3-5 verwendet. In der menschlichen kardiovaskulären Forschung sind die am häufigsten verwendeten Endothelzelllinien menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) und menschlichen Nabelschnurarterie Endothelial Cells (HUAECs) aus menschlicher Nabelschnur Vene und Arterie abgeleitet sind. HUVECs wurden als Goldstandard in der Gefäßforschung seit den 1980er Jahren ⁶ verwendet. Sie gelten als das klassische Modellsystem zum Studium der Endothelfunktion und Krankheit Anpassung sein. Endothelial-Zellen isoliert aus verschiedenen Blutgefäße variieren in appearance und Funktionalität durch genetische Hintergrund und der Exposition gegenüber der Mikroumgebung ^7. Zusätzlich werden HUVECs und HUAECs aus Nabelschnur abgeleitet sind, eine Entwicklungsgefäßstruktur, die an die Bedingungen in Bezug erwachsenen Blutgefäße möglicherweise nicht vollständig mimic sie und die Reaktion auf Krankheit ausgesetzt sind. Daher ist unzureichend in HUVECs und HUAECs zu kardiovaskulären Erkrankungen im Allgemeinen gefunden Ergebnisse zu übersetzen.

Wenn die Anpassung und das Verhalten von Erwachsenen ECs studieren, primären ECs aus dem Gefäß von Interesse sollte als direkter Ansatz verwendet werden. Zur Isolierung haben diese Zellen zeigen verschiedene Methoden berichtet. Eine weit beschriebene Verfahren, die auch für HUVECs verwendet wird, wird das Spülen des Behälters mit einem enzymatischen Verdauungslösung ^8. Dies führt oft zu einer Kontamination mit nicht-ECs wie glatte Muskelzellen und Fibroblasten ^9. Ein anderes häufig verwendetes Verfahren zur Isolierung ist die enzymatische Verdauung von gehackten Gefäßgewebe, gefolgt von Fluoreszenz-aktivierte Zelle (FACS) , basierend auf endothelialen Zellmarker Cluster of Differentiation (CD) 31 ^{7, 8.} FACS - Sortierung und anschließender Zellkultur Sortieranlage erfordert relativ große Mengen an Zellen und ist daher nicht geeignet für die Isolierung von Endothel von kleinen Blutgefäßen. Wir haben daher ein neues robustes Verfahren zu entwickeln, zur Isolierung eines reinen endothelialen Zellpopulation aus verschiedenen Hunde- Blutgefäße mit hoher Reinheit gerichtet. Um die Effizienz des neuen Isolationsmethode testen, haben wir isoliert und rein erhalten Canine Primary Endothelzell (CAPEC) Kulturen aus verschiedenen Hunde-Arterien und Venen, große und kleine. Dieses Verfahren ermöglicht auch die Kultur von Endothelzellen aus erkrankten Ursprung und / oder abweichende Gefäße wie angeborene intra- oder extrahepatischen portosystemischen Shunts, eine häufige Erkrankung bei Hunden ^2. Das Verfahren erlaubt die Isolierung von zusätzlichen relevanten Zelltypen des gleichen Gefäß wie vaskulären glatten Muskelzellen, da die meisten des Schiffes int bleibtWährend des Verfahrens handeln.

Protokoll

Ethik-Erklärung: Die Blutgefäße in dieser Studie verwendet wurden, als überschüssige Material geerntet wurden aus frischen Hunde-Kadaver (n = 4) von gesunden Hunden für andere, unabhängige Forschung (Universität 3R Politik) euthanasiert. Aberrant Blutgefäße (intra- und extrahepatischen portosystemischen Shunts, n = je 1) vorgestellt wurden für Haustiere der Universität Utrecht an der Universitätsklinik von Hunden post-mortem nach informierte Zustimmung der Eigentümer geerntet.

1. Isolierung und Kultur von primären Canine Endothelial Cells

1. Precoat-6-well - Platten mit 2 ml / Vertiefung 0,5% w / v Gelatine und mit einer angefeuchteten Atmosphäre von 5% CO ₂ bei 37 ° C für 2 h in einem Brutschrank belassen. Entfernen Lösung überschüssige Gelatine vor der primären Zellen Aussaat.
2. Aseptisch entfernen Sie das Blutgefäß (e) von Interesse (zB Aorta, Hohlvene, Vena porta) von einem frischen Eckzahn kadaver (Abbildung 1A). Aufrechterhaltung der Anatomie des Gefäßsystemsindem gerade Zange an beiden Enden des Schiffes von Interesse. Unnötige Manipulation des Gewebes mit einer Pinzette Schädigung der Endothelzellen zu verhindern.
   1. Schneiden Sie das geklemmt Gefäß an beiden Enden mit chirurgischen Scheren und vom kadaver entfernen. Transport in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) auf Eis.
      HINWEIS: Eine Schiffslänge von ca. 5 cm Für dieses Verfahren wird bevorzugt, aber diejenigen, die 1 cm messen auch genügend Zellen zur Kultur bieten.
3. Übertragen Sie das Blutgefäß in eine Petrischale gefüllt mit eiskaltem HBSS. Mit chirurgische Scheren, entfernen Sie alle anhaftendem Gewebe und Fett von der Außenseite des Gefäßes, halten das Gefäß selbst intakt (1B). Stellen Sie sicher, dass das Schiff jederzeit deutlich sichtbar ist beim Schneiden: beiseite ziehen das umgebende Gewebe mit einer Klammer oder einer Zange für optimale Sicht.
   1. Schließen Sie alle Zweige des Schiffes mit Ligatur (zB Polyglactin 3-0) und sie anschließend zu entfernenmit chirurgischen Schere oder einem Skalpell.
4. Ein Gefäßende mit einem gekrümmten Halsted Moskito Zange, klemmen die Spitze der Zange an dem anderen Ende des Behälters sorgfältig eingeben und dann zurückziehen, langsam das Gefäß Invertieren bis er vollständig von innen nach außen (1C-G) ist. Die Außenseite besteht nun aus der endothelialen Zellschicht. Wenn sich eine Schwierigkeit beim Umdrehen des Behälters angetroffen wird, wieder in HBSS versenken Reibung zu reduzieren.
5. Platzieren Sie Tabaksbeutelnähte an beiden Enden des Schiffes es vollständig zu schließen und die Exposition von Nicht-endothelialen Gefäßgewebe zu dem Aufschlussverfahren (Abbildung 1H) zu verhindern. Verwenden Sie die Ligatur Enden des invertierten Gefäß zu manipulieren.
6. Wenn die Verdauung und Kultur später durchgeführt wird, das invertierte Kryokonservierung Gefäß vor dem Verdau Protokoll (Schritt 1.7).
   1. Legen Sie das invertierte Schiff in einem Kryoröhrchen und füllen mit Zellkultur Einfriermedium. Einfrieren bis -80 ° C, um ein Einfrieren Co mitntainer. Bei -80 ° C, wenn Schiffe sind innerhalb einer Woche verwendet werden. Für die langfristige Lagerung Ort Kryovials bei -180 ° C. Wenn die EG-Isolierung durchgeführt wird, tauen die Kryovials schnell in einem Wasserbad (37 ° C) und sofort in eiskaltem HBSS platzieren. Gehen Sie wie in 1.7 angegeben.
      Hinweis: Beachten Sie, dass die Gesamtausbeute von ECs nach der Isolierung geringer sein wird durch den Verlust der Lebensfähigkeit während des Gefrierprozesses.
7. Übertragen Sie das Gefäß in ein 50 - ml - Röhrchen und spülen Sie es zweimal in HBSS Erythrozyten (oder Rest Einfriermedium bei Auftauen) (1I) zu entfernen.
8. Digest das Gefäß in einer 50-ml-Röhrchen mit einer Lösung von 30 ml Kollagenase Typ II (0,15 U / ml) und Dispase (0,15 U / ml) in Canine Endothelial Cells Growth Medium (CECGM) für 1 h bei 37 ° C mit intermittierender sanften Agitation.
9. Entfernen des Behälters aus dem Rohr und zentrifugieren die Zellsuspension für 5 min bei 250 x g.
10. Zellpellet in CECGM einnd Samen 2 ml Zellsuspension pro Well (1 - 3 Brunnen je nach Gefäßgröße). Kultur der Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO ₂ in Luft und das Kulturmedium zweimal pro Woche ändern.
11. Passage der Zellen, wenn eine Konfluenz von 70-80% erreicht ist.
    1. Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem HBSS tot oder nicht-anhaftenden Zellen zu entfernen. In 200 ul rekombinanter Zell-Dissoziation Enzym (1x) in jede Vertiefung und legen zurück in den Inkubator für 5 Minuten oder bis alle Zellen abgelöst werden.
    2. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube und stoppen Trypsinierung durch Zugabe von 10 ml Kulturmedien (CEGM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS). Zentrifuge für 5 Minuten bei 250 x g. Weiter wird die Kultur im Gelatine vorbeschichtet Platte oder Kolben.

2. Charakterisierung

1. Kultur Canine Aortic Endothelial Cells (CnAOECs) und die Morphologie der primären und kommerziellen Zelllinien zweimal wöchentlich mit einem Mikroskop vergleichen.
   HINWEIS: Ter wächst typisches Muster von ECs in Patches lassen sich am besten beobachtet werden, wenn eine Konfluenz von> 70% erreicht ist.
   1. Kultur CnAOECs in CECGM auf einem 0,5% w / v Gelatine vorbeschichtet T75-Kolben. Passage-Zellen einmal in der Woche, wenn die Konfluenz 70 - 80%.
      1. Für Passagierung, waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmter HBSS und 1 ml rekombinanten Zell-Dissoziation Enzym (1x). Der Kolben wird wieder in den Inkubator für 5 Minuten oder bis alle Zellen abgelöst werden. Inactivate Trypsin von 10 ml Kulturmedium Zugabe (CEGM) mit 10% FCS. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 Minuten bei 250 · g, den Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml Kulturmedium.
      2. Nehmen Sie ein 10-ul-Aliquot der Zellsuspension und verdünnt 1: 1 mit 0,4% Trypanblau. Zählen Sie die Zellen eines automatisierten Zellzähler verwenden, und die Platte aus 4,0 x 10 ⁵ lebensfähigen Zellen in einem neuen T75 - Flasche. 10 ml vorgewärmtes CECGM in den Kolben und die Kultur bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO _2.
2. Isolieren von RNA aus Durchgang 1 der kultivierten CaPECs und CnAOECs.
   1. Sammeln Sie mindestens 1 x 10 ³ Zellen als Pellet, fügen Sie 20 ul der Probenvorbereitung Reagenz (SPR) und Inkubation für 1 min die Zellen zu lysieren. Nach der Inkubation sorgfältig sammeln Zelllysat Gesamt-RNA und lagern bei -70 ° C enthält.
3. Konvertieren von mRNA in cDNA eine cDNA - Synthese - Kit (zB iScript) nach den Anweisungen des Herstellers. Shop cDNA bei 4 ° C bis zu einer Woche oder bei -20 ° C für langfristige, bis bereit, die qPCR auszuführen.
4. Messen Sie die Genexpression der endothelialen Marker CD31 Endothel-Zell-Ursprung zu bestätigen. Führen Versuchsaufbau und die Quantifizierung mit Hilfe der MIQE précis Richtlinien ^10. Zur Normalisierung, messen die Expression von Referenzgenen GAPDH, RPS19 und B2MG ^11.
   1. Bereiten Sie eine 10-fache Verdünnung der erhaltenen cDNA in nukleasefreiem Wasser.
   2. Bereiteneine 4-fache Verdünnung von gepoolten cDNA-Proben für die Standard-Linie und nukleasefreiem Wasser als Nicht-Template-Steuerung verwenden. Verdünnen Sie die Proben fünfmal einen 50-fachen Gesamtverdünnung für qPCR Reaktionen zu erreichen. Pipette 10 ul - Reaktionen in doppelter Ausfertigung in einer 384-Well - Format unter Verwendung von 4 & mgr; l cDNA und 6 & mgr; l des Fluorophors mit 20 pmol reverser gemischt und Vorwärts - Primer (Tabelle 1).
   3. Stellen Sie das Programm auf 95 ° C für 5 min für Taq-Polymerase-Aktivierung, gefolgt von 39 Zyklen von 10 sec bei 95 ° C für die Denaturierung und 30 sec bei Tm zum Glühen und Dehnung. Die Tm für jeden Primersatz ist in Tabelle 1 gezeigt.
   4. Perform Kurve Schmelzen analysiert jede Lauf folgende nur ein Produkt, um sicherzustellen, wird verstärkt. Normalisieren der Expressionsniveaus der Proben die durchschnittliche relative Menge der Referenzgene verwenden, und berechnen die ACt wenn Reaktionswirkungsgrad zwischen 95% und 105% liegt.
5. Beurteilen Sie EC-Funktionalität mit einem angiogenesis Test.
   1. Zugabe von 10 & mgr; l der extrazellulären Matrix zu jeder Vertiefung einer vorgekühlten Angiogenese Dia- und verteilt mit einer Pipettenspitze die Oberfläche der Vertiefung zu bedecken. Halten Sie die extrazelluläre Matrix auf Eis und vermeiden, dass die Einführung von Luftblasen in das Gel. In einem Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 30 min erstarren das Gel durch den Schieber in eine Petrischale mit Wasser getränkten Papiertüchern platzieren.
   2. In 1,0 x 10 ⁴ primäre ECs in 50 ul Endothelial Growth Medium pro Vertiefung. Inkubieren der Objektträger 6 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO _2.
   3. Nach 6 Stunden Fotos mit einer 20-facher Vergrößerung nehmen, um sicherzustellen, das Ganze gut in das Bild aufzunehmen.

Ergebnisse

Verschiedene Blutgefäße wurden erfolgreich auf das beschriebene Isolierungsprotokoll (Figur 2) unterzogen. Es war möglich, zu sezieren und Aorta, Hohlvene, Vena porta invertieren und Koronararterie von gesunden Hunden (alle Gefäße von jedem Hund, n = 4). Mit dem gleichen Ansatz ECs wurden aus zwei angeborenen portosystemischen Shunts (extrahepatische und intrahepatische, n = je 1) isoliert. Obwohl Aorta leicht invertiert wurde, waren thorakalen Aorta Segmente eine g...

Diskussion

In Studien über Hunde-ECs Fokussierung der CnAOEC primäre Linie , die die endotheliale Abstammungslinien des Hundes ^{3, 12,} Modell ^13. In Studien am Menschen wird die HUVEC Kultur immer noch der Goldstandard. Offensichtlich aus Nabelschnur abgeleitet Fokussierung nur auf ECs ist eine feste Beschränkung in der kardiovaskulären Forschung. Endothelial-Zellen haben einen spezifischen Genexpressionsmuster arteriovenöse Spezifikation zu bestimmen. Um diese Unterschiede in der postnatalen Schiffe zu b...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM (1X) + GlutaMAX	Life Technologies	31966-021
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-050
Canine Endothelial Cells Growth Medium	Cell Applications	Cn211-500
CnAOECs	Cell Applications	Cn304-05
Fetal Calf Serum (FCS)	GE Healthcare	16000-044
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013
SPR	Bio-Rad	170-8898
iScript synthesis kit	Bio-Rad	170-8891
SYBR green super mix	Bio-Rad	170-8886
Recovery Cell Freezing Medium	Gibco/Life Technologies	12648-010	Keep on ice prior to use
Freezing container, Nalgene Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)	B. Braun Medical	BC555R
Mosquito forceps	B. Braun Medical	FB440R
Mosquito forceps curved	B. Braun Medical	FB441R
polyglactin 3-0	Ethicon	VCP311H
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013
Automated counting chamber	Bio-Rad	145-0102
Counting Slides, Dual Chamber	Bio-Rad	145-0011
Matrigel	BD Biosciences	BD356231	Slowly thaw on ice
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	81501
Endothelial Growth Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 SingleQuot Kit	Lonza	CC-4176