Köpek arter ve venlerin Primer Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Özet

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Özet

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Giriş

Köpekler kardiyovasküler hastalık araştırmaları için büyük bir hayvan modeli olarak kullanılmaktadır ve aynı zamanda doğuştan (genetik) vasküler anormallikler ^{1, 2} muzdarip olabilir. Ticari endotel hücre hatları genellikle endotel hücre (EC) işlevselliğini değerlendirmek için kullanılan bu hastalıkların incelenmesi. köpekler için köpek aortundan alınan (CnAOEC) mevcuttur ticari bir endotelyal hücre hattı vardır. Bu hücre hattı çoğunlukla kontrol, normal EC ^3-5 olarak çalışmalarda kullanılmaktadır. kan dolaşım araştırmada en yaygın olarak kullanılan endotel hücre çizgileri sırasıyla insan göbek kordonu damar ve arter türetilen insan Göbek Daman Endotel Hücreleri (HUVECs) ve İnsan Umbilikal Arter Endotel Hücreleri (HUAECs) vardır. HUVECler 1980'lerden ⁶ yılından bu yana damar araştırmalarda altın standart olarak kullanılmıştır. Onlar endotel fonksiyonu ve hastalık adaptasyonunu incelemek için klasik model sistem olarak kabul edilmektedir. Farklı kan damarları izole endotel hücreleri appearanc değişirE ve mikroçevresinin ⁷ genetik arka plan ve maruz kalma nedeniyle işlevsellik. Buna ek olarak, HUVECler ve HUAECs, göbek kordonu şartlarına göre tamamen taklit yetişkin kan damarlarının onlar ve hastalığa yanıt maruz olmayabilir gelişimsel vasküler yapı elde edilir. Bu nedenle, genel olarak kardiyovasküler hastalık için HUVEC bulunan sonuçları ve HUAECs tercüme yetersizdir.

adaptasyon ve yetişkin EC davranışını incelerken, ilgilenilen damarın birincil EC daha doğrudan bir yaklaşım olarak kullanılmalıdır. bu hücrelerin izole edilmesi için, çeşitli yöntemler bildirilmiştir. Ayrıca, HUVEC için kullanılan bir çok tarif edilen yöntem, enzimatik sindirim çözeltisi ⁸ kap yıkama edilir. Bu çoğu zaman, düz kas hücreleri, fibroblastlar ve ⁹ olmayan EC ile kontaminasyon sonuçlanır. izolasyon için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, Floresan-takiben kıyılmış damar doku enzimatik sindirimi olanFarklılaşma (CD) 31 ^{7, 8.} FACS ayıklama endotelyal hücre belirteci küme ve daha sonra, hücre kültürü göre (FACS) aktif hücre hücrelerin nispeten büyük miktarlarda gerektirir ve bu nedenle ince kan damarlarından endotelyumun izolasyon için uygun değildir. Bu nedenle yüksek saflıkta çeşitli köpek kan damarlarından saf endotel hücre popülasyonunu izole etmek için yeni bir sağlam bir yöntem geliştirmeyi amaçladık. Yeni izolasyon yönteminin etkinliğini test etmek için, izole ve büyük ve küçük her ikisi de farklı köpek arterler ve venler, saf Canine Primer endotel hücre (CapeC) kültürleri elde etti. Bu yöntem aynı zamanda doğuştan içi veya dışı hepatik portosistemik şant, köpekler ² ortak bir hastalık olarak hastalıklı ve / veya anormal damarlardan kaynaklanan endotel hücrelerinin kültürü sağlar. kabın en int olarak kalmaktadır, bu yöntem, vasküler düz kas hücreleri gibi aynı geminin alakalı ek hücre tiplerinin izolasyonu sağlarİşlem sırasında hareket ederler.

Protokol

Etik bildirimi: Bu çalışmada kullanılan Kan damarları taze köpek kadavra elde edilen artı malzemesi olarak hasat edildi (n = 4), diğer ilişkisiz araştırma (Üniversite 3R politikası) için ötenazi sağlıklı köpeklerden. Anormal kan damarları (intra ve ekstrahepatik portosistemik şantlar, n = 1 adet) Utrecht Üniversitesi Companion Animals Üniversite Kliniği sunulan köpekler sahiplerinin bilgilendirilmiş onam sonra otopsi hasat edilmiştir.

1. İzolasyon ve Kültür İlköğretim Köpek Endotel Hücreleri

1. 2 ml / göz% 0.5 ağırlık / hacim jelatin ile ön-kat 6 oyuklu plakalar, 37 ° C'de% 5 _CO2 bulunan nemli bir atmosferde bir kuluçka makinesi içinde 2 saat süre ile bırakın. önce birincil hücrelerin ekim aşırı jelatin çözüm çıkarın.
2. Aseptik taze köpek kadavra (Şekil 1A) kan damarı (ler) ilgi (örneğin, aort, vena kava, vena porta) çıkarın. damar sisteminin anatomisini korumakÇevrede kabın her iki ucunda, düz forseps koyarak. endotel hücrelerine zarar görmesini önlemek için forseps ile doku gereksiz manipülasyon kaçının.
   1. cerrahi makas ile her iki ucunda kenetlenmiş gemi kesin ve kadavra kaldırmak. buz üzerinde Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) taşınması.
      Not: yaklaşık olarak 5 sm bir tekne uzunluğu, bu prosedür için tercih edilir, ancak 1 cm boyutlarında o da kültür için yeterli hücreleri sağlar.
3. buz soğukluğunda HBSS ile dolu bir Petri kabı, kan damarı aktarın. Cerrahi makas kullanılarak, damar kendisi sağlam (Şekil 1B) tutmak kabın dışından yapışık doku ve yağ çıkarmak. Optimal görünüm için bir kelepçe veya forseps ile kenara çevredeki dokuyu çekin: keserken emin damar her zaman açıkça görünür olduğundan emin olun.
   1. Bitişik harfler ile her türlü tekne dalları kapatın (örneğin, 3-0 polyglactin) ve daha sonra bunları kaldırmakcerrahi makas veya neşter ile.
4. Dikkatle, kavisli bir Halsted sivrisinek forseps ile bir gemi ucunu girmek geminin diğer ucundaki forseps ucu kelepçe ve dışarı (Şekil 1C-G) tamamen içine kadar sonra yavaş yavaş gemiyi tersini, geri çekin. dış artık endotel hücre tabakasını içermektedir. herhangi bir zorluk gemi tersini üzerine karşılaşılırsa, sürtünmeyi azaltmak için tekrar HBSS daldırın.
5. Tamamen kapatmak için ve sindirim prosedürü (Şekil 1H) herhangi olmayan endotelyal damar dokusu maruz kalmasını önlemek için geminin her iki ucunda purse-string sütür koyun. ters gemi işlemek için bağ uçlarını kullanın.
6. sindirim ve kültür daha sonra yapılırsa, sindirim protokolü (adım 1.7) öncesinde ters gemi cryopreserve.
   1. kriyotüpe içinde ters gemi yerleştirin ve hücre kültür ortamı dondurma ile doldurun. Bir dondurma co kullanarak aşağı -80 ° C'ye kadar Freezentainer. -80 ° C'de saklayın gemiler bir hafta içinde kullanılacak ise. Uzun süreli depolama, -180 ° C'de yer cryovials için. AT izolasyon gerçekleştirirken, bir su banyosu (37 ° C) hızla cryovials çözülme hemen buz soğukluğunda HBSS yerleştirin. 1.7 belirtildiği gibi devam edin.
      Not: izolasyondan sonra EC toplam verimi sayesinde dondurma işlemi sırasında canlılığı kaybına daha düşük olacağı dikkate alacaktır.
7. 50 ml'lik bir tüp gemi aktarın ve (Şekil 1I) (çözülme durumunda veya artık dondurma orta) eritrositler kaldırmak HBSS iki kez yıkayın.
8. Aralıklı yumuşak olan 37 ° C 'de 1 saat boyunca köpek Endotel Hücrelerinde 30 mi kolajenaz tip II (0.15 U / ml) ve dispase (0.15 U / ml) içeren bir çözeltiye Gelişim Ortamı (CECGM) olan bir 50 ml tüp içinde damar Digest çalkalama.
9. g tüpten gemi çıkarın ve x 250 5 dakika boyunca hücre süspansiyonu santrifüj.
10. CECGM a hücre pelletinind tohum 2 ml hücre süspansiyonu oyuk başına (1-3 kuyu damar boyutuna bağlı olarak). Kültür hava içinde% 5 _CO2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C 'de hücreleri ve haftada iki kez kültür ortamı değiştirin.
11. % 80 ulaşıldığında - 70 bir confluency Passage hücreleri.
    1. Ölü ya da olmayan bağlanmış hücreler uzaklaştırılmıştır önceden ısıtılmış HBSS hücreleri yıkayın. Her bir oyuğa 200 ul rekombinant hücre-ayrılma enzimi (1x) ilave edin ve 5 dakika boyunca ya da tüm hücrelerin müstakil kadar tekrar inkübatör yerleştirin.
    2. 15 ml'lik bir tüpe transfer hücreleri ve% 10 cenin buzağı serumu (FCS) içeren kültür ortamı 10 ml (CEGM) eklenerek tripsinizasyon durdurun. 250 x g hızında 5 dakika süreyle santrifüj. Jelatin önceden kaplanmış plaka veya şişede kültür devam edin.

2. Karakterizasyonu

1. Kültür Köpek aort endotel hücreleri (CnAOECs) ve bir mikroskop ile haftada iki kez birincil ve ticari hücre hatlarının morfolojisi karşılaştırın.
   NOT: TO, tipik>% 70 konfluansa ulaştığında iyi görülmektedir yamalar EC desen büyüyen.
   1. % 0.5 ağırlık / hacim jelatin önceden kaplanmış T75 şişesinin üzerine CECGM Kültür CnAOECs. haftada bir kez Passage hücreleri confluency 70 -% 80.
      1. geçirilmesi için önceden ısıtılmış bir kez HBSS ile yıkama hücreleri, 1 ml yeniden birleştirici hücre ayrışma enzimi (1x) ekleyin. 5 dakika boyunca veya tüm hücreler müstakil kadar inkübatör geri şişeyi yerleştirin. % 10 FCS içeren 10 ml kültür ortamı (CEGM) eklenerek tripsin inaktive. 250 x g'de 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj süpernatan atılır ve 1 ml kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri.
      2. Hücre süspansiyonu, 10 ul bir kısım almak ve 1 seyreltin:% 0.4 tripan mavisi ile 1. Otomatik hücre sayıcı kullanarak hücre sayımı ve yeni T75 şişesi içinde 4.0 x 10 ⁵ canlı hücreleri plaka. % 5 _CO2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C'de bir şişeye ve kültür önceden ısıtılmış CECGM 10 ml ekleyin.
2. Kültür CaPECs ve CnAOECs geçişi 1 RNA izole edin.
   1. Bir pelet gibi en az 1 x 10 ³ hücreleri toplamak örnek hazırlama reaktifi (SPR) 20 ul ekle ve hücreleri lize etmek için 1 dakika için inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, dikkatli bir şekilde -70 ° C'de, toplam RNA ve mağaza ihtiva eden hücre lizatı toplar.
3. Üreticinin talimatları izlenerek bir cDNA sentez kiti (örneğin, iScript) kullanılarak cDNA'ya mRNA dönüştürün. qPCR gerçekleştirmek için hazır olana kadar uzun süre için 4 ° C'de bir hafta kadar ya da -20 ° C'de saklayın cDNA.
4. endotel hücre kaynağını teyit etmek için endotelyal işaretleyici CD31 gen ifadesini ölçün. MIQE Özetleyerek yönergeleri ¹⁰ kullanılarak deney düzeneği ve kantifikasyonunu gerçekleştirin. Normalleşmesi için, referans genler GAPDH, RPS19 ve B2MG ¹¹ ifadesini ölçmek.
   1. nükleaz içermeyen su elde edilen cDNA bir 10-kat seyreltme hazırlayın.
   2. hazırlamakStandart hattı için bir araya getirilmiş cDNA örnekleri bir 4-kat seyreltme ve şablon olmayan kontrol olarak nükleaz serbest su kullanın. qPCR reaksiyonları için 50 kat, toplam seyreltme ulaşmak için numune beş kez seyreltilir. 4 ul cDNA ve geri ve ileri doğru primer (Tablo 1) 20 pmol ile karıştırılmış fluorofor 6 ul kullanılarak 384 oyuklu bir formatta iki kez pipetle 10 ul reaksiyonları.
   3. denatürasyon için 95 ° C de 10 saniye 39 döngü, ardından Taq polimeraz aktivasyonu için 5 dakika, tavlama ve uzama için Tm 30 saniye boyunca 95 ° C'ye kadar bir program ayarlama. Her bir primer grubu için Tm Tablo 1 'de gösterilmiştir.
   4. erime eğrisi gerçekleştirin yükseltilir tek bir ürün sağlamak için her çalıştırmak aşağıdaki analiz eder. Referans genlerin ortalama bağıl miktarda kullanarak numunelerin ifade düzeylerini normale ve reaksiyon verimi% 95 ile% 105 arasında ise ACt hesaplayın.
5. Bir Angi EC işlevselliğini değerlendirmekogenesis deneyi.
   1. önceden soğutulmuş bir anjiyojenez sürgünün her çukuruna hücre dışı matrisin 10 ul ilave edilip iyice yüzeyini kaplayan bir pipet ucu ile yayılır. buz üzerinde hücre dışı matris tutmak ve jele hava kabarcıklarının giriş önlemek. 30 dakika boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de, bir kuluçka makinesi içinde suda ıslatılmış kağıt havlu ile bir Petri kabındaki slayt koyarak jel katılaşmaya.
   2. 1.0 x 10 ⁴ birincil ekle EC 50 ul Endotel Gelişim Ortamı ile sabitleştirilir. % 5 _CO2 ile 37 ° C 'de 6 saat süre ile slayt inkübe edin.
   3. 6 saat sonra görüntüdeki tüm kuyu içerdiğinden emin yapma, 20X büyütme ile fotoğraf çekmek.

Sonuçlar

Farklı kan damarları başarıyla açıklanan izolasyon protokolü (Şekil 2) tabi tutuldu. Teşrih ve sağlıklı köpeklerden aort, vena kava, vena porta ve koroner arter ters mümkün olmuştur (her köpekten tüm damarları, n = 4). Aynı yaklaşım EC iki doğumsal portosistemik şant (ekstrahepatik ve intrahepatik, n = 1 adet) izole edilmiştir ile. Aort kolayca ters olmasına rağmen, aort segmentleri abdominal aorta daha zorlu idi. göğüs segmentlerde aort sin...

Tartışmalar

Köpek EC odaklanan çalışmalarda CnAOEC birincil hat köpek ^{3, 12, 13} endotel soy modellemek için kullanılır. İnsan çalışmalarında, HUVEC kültürü hala altın standart olarak kabul edilmektedir. Açıkçası, göbek kordonu elde edilen EC üzerinde sadece odaklanan Kardiyovasküler araştırmalarda bir firma kısıtlama olduğunu. Endotel hücreleri arteriovenöz özelliklerinin belirlenmesiyle belirli bir gen ifade desen var. Doğum sonrası damarlarda bu farklılıkların hesaba katmak için bi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM (1X) + GlutaMAX	Life Technologies	31966-021
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-050
Canine Endothelial Cells Growth Medium	Cell Applications	Cn211-500
CnAOECs	Cell Applications	Cn304-05
Fetal Calf Serum (FCS)	GE Healthcare	16000-044
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013
SPR	Bio-Rad	170-8898
iScript synthesis kit	Bio-Rad	170-8891
SYBR green super mix	Bio-Rad	170-8886
Recovery Cell Freezing Medium	Gibco/Life Technologies	12648-010	Keep on ice prior to use
Freezing container, Nalgene Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)	B. Braun Medical	BC555R
Mosquito forceps	B. Braun Medical	FB440R
Mosquito forceps curved	B. Braun Medical	FB441R
polyglactin 3-0	Ethicon	VCP311H
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013
Automated counting chamber	Bio-Rad	145-0102
Counting Slides, Dual Chamber	Bio-Rad	145-0011
Matrigel	BD Biosciences	BD356231	Slowly thaw on ice
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	81501
Endothelial Growth Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 SingleQuot Kit	Lonza	CC-4176