Isolamento e coltura di cellule endoteliali primarie dalle arterie e vene Canine

Riepilogo

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Abstract

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Introduzione

I cani vengono utilizzati come grande modello animale per la ricerca sulle malattie cardiovascolari e possono anche soffrire di innata (genetici) anomalie vascolari ^{1, 2.} Per studiare queste malattie linee di cellule endoteliali commerciali sono spesso utilizzati per valutare la funzionalità delle cellule endoteliali (CE). Per i cani c'è una linea commerciale delle cellule endoteliali a disposizione (CnAOEC), derivato da dell'aorta canino. Questa linea cellulare è usato soprattutto in studi come normale controllo EC ^3-5. Nella ricerca cardiovascolare umano linee di cellule endoteliali più comunemente usati sono cellule ombelicale Vena endoteliali (HUVEC) e ombelicale umano Arteria cellule endoteliali (HUAECs) derivate dalla vena umana cordone ombelicale e delle arterie, rispettivamente. HUVECs sono stati usati come il golden standard nel campo della ricerca vascolare dal 1980 ^6. Essi sono considerati essere il sistema modello classico per studiare la funzione endoteliale e adattamento malattia. Le cellule endoteliali isolate da diversi vasi sanguigni variano in appearancE e funzionalità a causa di background genetico e l'esposizione al microambiente ^7. Inoltre, HUVEC e HUAECs derivano dal cordone ombelicale, una struttura vascolare sviluppo che potrebbero non pienamente mimici vasi sanguigni adulto rispetto alle condizioni a cui sono esposti e la risposta alla malattia. Quindi, traducendo Risultati trovati in HUVECs e HUAECs per le malattie cardiovascolari, in generale, è inadeguata.

Quando si studia l'adattamento e il comportamento degli adulti EC, EC primari dal vaso di interesse dovrebbero essere usati come un approccio più diretto. Per isolare queste cellule, sono stati riportati diversi metodi. Un metodo ampiamente descritto, che è anche usato per HUVEC, sta eliminando il recipiente con una soluzione digestione enzimatica ^8. Questo si traduce spesso in contaminazione con non-EC come le cellule muscolari lisce e fibroblasti ^9. Un altro metodo frequentemente utilizzato per l'isolamento è la digestione enzimatica del tessuto nave tritato seguito da fluorescence-cellule attivate (FACS) basato su endoteliali Cluster indicatore di cella di differenziazione (CD) 31 ^{7, 8.} FACS ordinamento e successiva coltura cellulare richiede quantità relativamente elevate di cellule e non è quindi adatto per l'isolamento di endotelio da piccoli vasi sanguigni. Abbiamo quindi finalizzata allo sviluppo di un nuovo metodo robusto per isolare una popolazione di cellule endoteliali puro da vari vasi sanguigni canine con elevata purezza. Per verificare l'efficacia del nuovo metodo di isolamento, abbiamo isolato e ottenuto colture pure Canine endoteliali primarie cellulare (CAPEC) da diverse arterie e vene canini, grandi e piccoli. Questo metodo consente anche la cultura di cellule endoteliali provenienti da malati e / o vasi aberranti come innate shunt porto intra o extra-epatiche, una malattia comune nei cani ^2. Il metodo permette l'isolamento di altri tipi di cellule competenti della stessa nave, come le cellule muscolari lisce vascolari poiché la maggior parte della nave rimane intagire durante la procedura.

Protocollo

Etica dichiarazione: I vasi sanguigni utilizzati in questo studio sono state raccolte come materiale in eccesso ottenuti da cadaveri freschi canino (n = 4) da cani sani eutanasia per altre ricerche non correlate (politica Università 3R). vasi sanguigni aberranti (shunt porto intra- e extra-epatiche, n = 1 ciascuno) sono state raccolte post mortem dopo consenso informato dei proprietari di cani presentati alla clinica universitaria per Animali da Compagnia di Università di Utrecht.

1. Isolamento e la coltura di cellule primarie Canine endoteliali

1. Pre-coat 6 pozzetti con 2 ml / pozzetto 0,5% w / v di gelatina e lasciare per 2 ore in un incubatore con atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ a 37 ° C. Rimuovere soluzione di gelatina in eccesso prima semina delle cellule primarie.
2. Asetticamente rimuovere il vaso sanguigno (s) di interesse (ad esempio, aorta, vena cava, vena porta) a partire da un fresco canino cadavere (Figura 1A). Mantenere l'anatomia del sistema naveponendo pinze diritte su entrambe le estremità del vaso di interesse. Evitare manipolazioni inutili del tessuto con una pinza per evitare danni alle cellule endoteliali.
   1. Tagliare la nave bloccato su entrambe le estremità con le forbici chirurgiche e togliere dal cadavere. Trasporti in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) su ghiaccio.
      NOTA: Una lunghezza imbarcazione di circa 5 cm è preferito per questa procedura, ma quelli che misurano 1 cm fornirà anche abbastanza cellule per la cultura.
3. Trasferire il vaso sanguigno di una capsula di Petri riempite con HBSS ghiacciata. Utilizzando le forbici chirurgiche, rimuovere eventuali tessuti aderenti e grasso dall'esterno del recipiente, mantenendo il recipiente stesso intatta (Figura 1B). Assicurarsi che il vaso è ben visibile in ogni momento durante il taglio: tirare a parte il tessuto circostante con un morsetto o pinze per la visualizzazione ottimale.
   1. Chiudere tutti i rami della nave con legature (ad esempio, Polyglactin 3-0) e, successivamente, rimuoverlicon le forbici chirurgiche o un bisturi.
4. Immettere cautela un'estremità recipiente con curve pinza zanzara Halsted, bloccare la punta della pinza all'altra estremità della nave e quindi ritrarre, invertendo lentamente il serbatoio finché è completamente esterno (Figura 1C-G). L'esterno ora consiste dello strato di cellule endoteliali. Se si incontra difficoltà sulla invertendo il vaso, immergerlo in HBSS nuovamente per ridurre l'attrito.
5. Posizionare suture a borsa di entrambe le estremità della nave per chiuderla completamente e per evitare l'esposizione di qualsiasi tessuto vascolare non-endoteliale alla procedura di digestione (Figura 1H). Utilizzare le estremità legatura di manipolare la nave rovesciata.
6. Se la digestione e la cultura viene eseguita in seguito, cryopreserve la nave rovesciata prima del protocollo di digestione (passo 1,7).
   1. Posizionare il vaso rovesciato in una provetta Microbank ™ e riempire con colture cellulari congelamento media. Antigelo fino a -80 ° C con una co congelamentontainer. Conservare a -80 ° C se i vasi devono essere utilizzati entro una settimana. Per la conservazione a lungo termine, luogo cryovials a -180 ° C. Quando si esegue l'isolamento CE, scongelare i cryovials rapidamente in un bagno d'acqua (37 ° C) e collocare immediatamente in ghiaccio freddo HBSS. Procedere come indicato in 1.7.
      NOTA: Prendere in considerazione che la resa totale di EC dopo l'isolamento sarà inferiore a causa della perdita di vitalità durante il processo di congelamento.
7. Trasferire la nave verso un tubo da 50 ml e lavare due volte in HBSS per rimuovere gli eritrociti (o medio congelamento residua in caso di scongelamento) (Figura 1I).
8. Digerire il vaso in un tubo da 50 ml con una soluzione di 30 ml di collagenasi di tipo II (0,15 U / ml) e dispasi (0,15 U / ml) in cellule Canine endoteliali Growth Medium (CECGM) per 1 ora a 37 ° C con intermittente delicato agitazione.
9. Rimuovere il recipiente dal tubo e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 250 x g.
10. Risospendere il pellet di cellule in un CECGMND seme 2 sospensione cellulare ml per bene (1 - 3 pozzi a seconda delle dimensioni nave). Coltivare le cellule a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% di CO ₂ in aria e cambiare il terreno di coltura due volte a settimana.
11. Passaggio delle cellule quando una confluenza di 70 - si raggiunge l'80%.
    1. Lavare le cellule con HBSS preriscaldata per rimuovere le cellule morte o non iscritti. Aggiungere 200 ml ricombinante enzima cellulare-dissociazione (1x) per ciascun bene e mettere di nuovo in incubatrice per 5 minuti o fino a quando tutte le cellule sono staccati.
    2. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml e fermare tripsinizzazione con l'aggiunta di 10 ml di terreni di coltura (CEGM) di cui 10% siero fetale di vitello (FCS). Centrifugare per 5 min a 250 x g. Continuare la cultura in un piatto di gelatina pre-verniciato o pallone.

2. Caratterizzazione

1. Culture cellule endoteliali aortiche Canine (CnAOECs) e confrontare la morfologia delle linee cellulari primarie e commerciale due volte alla settimana con un microscopio.
   NOTA: Tegli tipico modello di crescita di cellule endoteliali in patch può essere meglio osservato quando viene raggiunta una confluenza di> 70%.
   1. Culture CnAOECs in CECGM su una beuta T75 0,5% w / v di gelatina prerivestita. cellule Passage una volta alla settimana quando la confluenza è del 70 - 80%.
      1. Per passaging, lavare le cellule una volta con HBSS preriscaldata e aggiungere 1 ml ricombinante cella-dissociazione enzimatica (1x). Porre il pallone torna in incubatrice per 5 minuti o fino a quando tutte le cellule sono staccati. Inattivare tripsina con l'aggiunta di mezzo di coltura 10 ml (CEGM) incluso 10% FCS. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 250 xg, scartare il surnatante e risospendere le cellule in terreno di coltura 1 ml.
      2. Prendete una aliquota di 10 microlitri di sospensione cellulare e diluire 1: 1 con il 0,4% trypan blu. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato, e piastra out 4.0 x 10 ⁵ cellule vitali in un pallone nuovo T75. Aggiungere 10 ml di pre-riscaldato CECGM al pallone e coltura a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% di CO _2.
2. Isolare RNA dal passaggio 1 delle CaPECs coltivate e CnAOECs.
   1. Raccogliere almeno 1 x 10 ³ cellule come pellet, aggiungere 20 ml di preparazione del campione reagente (SPR) e incubare per 1 min per lisare le cellule. Dopo l'incubazione, raccogliere con attenzione il lisato cellulare contenente RNA totale e conservare a -70 ° C.
3. Convertire mRNA in cDNA utilizzando un kit di sintesi di cDNA (ad esempio, iScript) seguendo le istruzioni del produttore. Conservare cDNA a 4 ° C fino a una settimana, oa -20 ° C per il lungo termine fino al momento di eseguire la qPCR.
4. Misurare l'espressione del gene del CD31 marcatore endoteliale per confermare l'origine delle cellule endoteliali. Eseguire l'impostazione sperimentale e quantificazione utilizzando le linee guida precis MIQE ^10. Per la normalizzazione, misurare l'espressione di geni di riferimento GAPDH, RPS19, e B2MG ^11.
   1. Preparare una diluizione di 10 volte del cDNA ottenuto in acqua priva di nucleasi.
   2. Preparareuna diluizione di 4 volte da campioni di cDNA pool per la linea standard e utilizzare l'acqua priva di nucleasi come un controllo non-modello. Diluire i campioni cinque volte per raggiungere una diluizione totale di 50 volte per le reazioni qPCR. Pipettare 10 microlitri reazioni in duplicato in un formato da 384 pozzetti con 4 ml di cDNA e 6 ml di fluoroforo mescolato con 20 pmol di retromarcia e primer forward (Tabella 1).
   3. Impostare il programma a 95 ° C per 5 minuti per l'attivazione polimerasi Taq, seguita da 39 cicli di 10 secondi a 95 ° C per la denaturazione, e 30 sec a Tm per la ricottura e l'allungamento. La Tm di ogni primer è mostrato nella Tabella 1.
   4. Eseguire la fusione curva di analisi eseguite dopo ogni corsa al fine di garantire un solo prodotto è amplificato. Normalizzare i livelli di espressione dei campioni con la quantità media relativa dei geni di riferimento, e calcolare il ΔCt se l'efficienza reazione è compresa tra il 95% e il 105%.
5. Valutare la funzionalità CE con un Angisaggio ogenesis.
   1. Aggiungere 10 ml di matrice extracellulare a ciascun pozzetto di una slitta pre-raffreddata angiogenesi e diffondere con un puntale per coprire la superficie del pozzetto. Mantenere la matrice extracellulare su ghiaccio ed evitare l'introduzione di bolle d'aria nel gel. Solidificare il gel ponendo il vetrino in una capsula di Petri con acqua imbevuto asciugamani di carta in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 30 min.
   2. Aggiungere 1,0 x 10 ⁴ primario EC in 50 microlitri Endothelial Growth medio per pozzetto. Incubare il vetrino per 6 ore a 37 ° C con 5% di CO _2.
   3. Dopo 6 ore scattare fotografie con un ingrandimento 20x, avendo cura di includere l'intera bene nell'immagine.

Risultati

Diversi vasi sanguigni sono stati sottoposti con successo al protocollo descritto isolamento (Figura 2). Era possibile sezionare e invertire aorta, vena cava, vena porta, e l'arteria coronaria da cani sani (tutte le navi da ciascun cane, n = 4). Con le stesse EC approccio sono stati isolati da due shunt porto congenite (extraepatica e intraepatica, n = 1 ciascuno). Anche se dell'aorta era facilmente invertita, segmenti dell'aorta toracica sono stati più impe...

Discussione

In studi incentrati sul canino EC linea primaria CnAOEC viene utilizzato per modellare le linee endoteliali del cane ^{3, 12, 13.} Negli studi umani, la cultura HUVEC è ancora considerato il gold standard. Chiaramente, concentrandosi solo sulla EC derivate da cordone ombelicale è una restrizione fermo nella ricerca cardiovascolare. Le cellule endoteliali hanno una specifica pattern di espressione genica che determina le specifiche artero-venosa. Per tenere conto di queste differenze di vasi postnatale presenti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM (1X) + GlutaMAX	Life Technologies	31966-021
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-050
Canine Endothelial Cells Growth Medium	Cell Applications	Cn211-500
CnAOECs	Cell Applications	Cn304-05
Fetal Calf Serum (FCS)	GE Healthcare	16000-044
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013
SPR	Bio-Rad	170-8898
iScript synthesis kit	Bio-Rad	170-8891
SYBR green super mix	Bio-Rad	170-8886
Recovery Cell Freezing Medium	Gibco/Life Technologies	12648-010	Keep on ice prior to use
Freezing container, Nalgene Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)	B. Braun Medical	BC555R
Mosquito forceps	B. Braun Medical	FB440R
Mosquito forceps curved	B. Braun Medical	FB441R
polyglactin 3-0	Ethicon	VCP311H
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013
Automated counting chamber	Bio-Rad	145-0102
Counting Slides, Dual Chamber	Bio-Rad	145-0011
Matrigel	BD Biosciences	BD356231	Slowly thaw on ice
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	81501
Endothelial Growth Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 SingleQuot Kit	Lonza	CC-4176