JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المخطوطة إجراء لتتبع إعادة تشكيل cerebrovasculature خلال تراكم ترسبات الأميلويد في الجسم الحي باستخدام طولية اثنين من الفوتون المجهري. وإعداد ضعفت الجمجمة يمكن تصور الأصباغ الفلورية لتقييم تطور الضرر الدماغية في نموذج الفأر من مرض الزهايمر.

Abstract

إعادة تشكيل الأوعية الدموية في الدماغ هو سمة مشتركة من أمراض الدماغ. في الجسم الحي تقنيات التصوير أساسية للكشف عن المطاوعة الدماغية أو الأضرار التي تحدث الوقت بدل الضائع وفيما يتعلق نشاط الخلايا العصبية أو تدفق الدم. في الجسم الحي المجهري اثنين الفوتون يسمح للدراسة اللدونة الهيكلية والوظيفية وحدات الخلوية كبيرة في الدماغ المعيشة. على وجه الخصوص، وإعداد إطار ضعفت الجمجمة يسمح التصور من المناطق القشرية ذات الاهتمام (ROI) دون التسبب التهابا حادا في الدماغ. جلسات التصوير المتكررة من العائد على الاستثمار القشرية ذات جدوى، وتوفير توصيف بصمات المرض مع مرور الوقت خلال تطور العديد من الأمراض الجهاز العصبي المركزي. هذه التقنية الوصول إلى الهياكل حنوني داخل 250 ميكرون من الدماغ تعتمد على الكشف عن تحقيقات الفلورسنت المشفرة بواسطة علامات الخلوية الوراثية و / أو الأصباغ الحيوية. وتستخدم (على سبيل المثال، dextrans الفلورسنت) الأخيرة لتعيين LUMINمقصورة آل البنى الدماغية. وثيق لبروتوكول الموصوفة هنا هو استخدام علامة في الجسم الحي من الودائع اميلويد، ميثوكسي-O4، لتقييم مرض الزهايمر (AD) التقدم. نحن أيضا وصف معالجة الصور بعد الحيازة تستخدم لتتبع التغيرات الأوعية الدموية وترسبات الأميلويد. مع التركيز في الوقت الحاضر على نموذج م، بروتوكول صفها هو ذات الصلة لاضطرابات الجهاز العصبي المركزي أخرى حيث تحدث التغييرات الدماغية المرضية.

Introduction

الأوعية الدموية في الدماغ هو بنية متعددة الخلايا، التي تشريحيا ووظيفيا بالإضافة إلى الخلايا العصبية. إعادة عرض ديناميكية السفن يحدث في جميع أنحاء نمو الدماغ وخلال تطور أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS) 1،2. ومن المسلم به على نطاق واسع أن الضرر الدماغية هو السمة المميزة لعدة أمراض الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك الصرع ومرض الزهايمر (AD)، إصابات الدماغ، والتهاب الدماغ 3،4. لذلك، وتتبع التغيرات الدماغية في الجسم الحي يصبح كبيرا عندما النمذجة أمراض الجهاز العصبي المركزي، من بداية وفي المراحل المزمنة. في كثير من الأحيان تحدث تعديلات الدماغية بالتزامن مع تلف الخلايا العصبية أو اللدونة، والتصوير من العصبية الأوعية الدموية يمثل نقطة انطلاق رئيسية إلى فك الجهاز العصبي المركزي الفيزيولوجيا المرضية المرض.

يصف هذا البروتوكول إجراء طولية على أساس ثنائي الفوتون لتتبع إعادة تشكيل cerebrovasculature في نموذج الفأر منم، وعلم الأمراض التدريجي تميزت العيوب الدماغية على السفن عيار الكبيرة والصغيرة بسبب amyloidogenic وحة ترسب 5-7. يسمح هذا الإجراء لتصور الودائع اميلويد وتتبع موقف ونموها فيما يتعلق إعادة عائية عصبية طوال فترة المرض. يتم حقن الأصباغ الفلورية الحيوية قبل كل دورة التصوير لتصور من cerebrovasculature واميلويد لويحات في الفئران المعدلة وراثيا م 8. جلسات التصوير المتكررة من العائد على الاستثمار من خلال نافذة الجمجمة الجمجمة ضعيفة غير قابلة للالغازية وطريقة اختيار لتقييم إعادة عائية عصبية في دماغ الفأر المعيشة 2،5،9،10.

يحدد الإجراء أدناه بروتوكول الجراحية، واقتناء الصور ومعالجة. يتميز التقدم المبكر لاعتلال وعائي دماغي اميلويد (CAA) معظمها في السحايا الرقيقة كبير والشرايين اختراق.

Protocol

ويسمح للفئران وصول الإرضاع بحسب الرغبة في الغذاء، والمياه، والحفاظ على دورة ضوء الظلام لمدة 12 ساعة. جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات المختبرية تتفق مع القوانين الأوروبية الوطنية ووتمت الموافقة من قبل الوزارة الفرنسية للتعليم والبحث العلمي (CEEA-LR-00651-01). تم استخدام ما مجموعه 6 المعدلة وراثيا 5xFAD و 4 littermate wildtype (WT) السيطرة على الفئران لهذا الإجراء.

التحضير 1. قبل الجراحة

  1. البريتونى (IP) حقن ميثوكسي-X04 (10 ملغ / كلغ) 48 ساعة قبل الجراحة لتسمية الودائع Aβ 11.
  2. إعداد المعقم السائل الاصطناعي النخاعي (ACSF) (120 ملي مول كلوريد الصوديوم، 26.2 ملم NaHCO 3، 2.5 ملي بوكل، 1 ملم ناه 2 ص 4، 1.3 ملي MgCl 2 و 10 ملي الجلوكوز، فقاعة مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 قبل مضيفا 2.5 ملي CaCl 2).
  3. تعقيم الأدوات الجراحية (مقص، ملقط، شفرة حلاقة والحفر بت)، وذلك باستخدام الأوتوكلاف أو حبة تعقيم الساخن قبل العقيمالعملية الجراحية.
  4. تنظيف الجراحية مقاعد البدلاء، ومجهر لوحة مع 70٪ من الإيثانول والغطاء بقطعة قماش ماصة نظيفة.
  5. حقن الكيتامين / زيلازين (75 ملغ / كغ و 10 ملغم / كغم، على التوالي) وكيتوبروفين مسكن (2.5 ملغ / كلغ) IP.
  6. التحقق من مستوى مناسب من التخدير مع مخلب أو ذيل القرصات.
  7. تطبيق مرهم معقم للعين وحلق الفراء (الأنف إلى الأذن) مع تجنب شعيرات. كريم مزيل الشعر يمكن استخدام ما دام يتبع ذلك من قبل الشطف بعناية مع الماء لمنع تهيج الجلد. حلق الفراء المتبقية بشفرة حلاقة. تعقيم الجلد مع محلول مطهر بوفيدون اليود.
  8. ضع الماوس تحت المجهر مجهر وجعل شق الجلد من الأذن إلى الأنف. سحب الجلد جانبية لفضح الجمجمة. شق السمحاق وشطف مرارا الجمجمة مع معقم ACSF لوقف نزيف محتمل.

2. الأوعية الدموية وصفها وضعفت الجمجمةإعداد الإطار (40 دقيقة)

  1. إزالة مرهم العين مع طرف القطن. تطبيق قطرة من مخدر موضعي العيون (تتراكائين 1٪) والضغط برفق الجلد حول محجر العين إلى تحقيق نتوء.
  2. حقن فلوريسئين ثيوسيانات (FITC) مترافق مع ديكستران (70 كيلو دالتون) (100 ملغ / كغ أو 50 ميكرولتر من 50 ملغ / مل حل، تحت الجلد الانسولين إبرة) في الجيوب الرجعية المدارية باتباع الإجراء التي وصفها Yardeni وزملاؤه 12. تطبيق مرهم معقم للعين.
  3. تأكد من أن الجلد هو تراجع والجمجمة نظيف وجاف في جميع أنحاء منطقة التصوير المحدد. ضع كمية صغيرة من الغراء cyanoacrylic حول نافذة على رأس جبل الجهاز (التي تتكون من مكدسة الحلاقة ريش، انظر الشكل 1)، والغراء في جميع أنحاء المنطقة المستهدفة تطبيق ضغط لطيف لعدة ثوان 10.
  4. سحب طرفي الجلد إلى حافة نافذة في الرأس تركيب الجهاز، والتأكد من المنطقةجاف. تأمين الجلد وحافة النافذة مع كمية صغيرة من الغراء البيطري الصف cyanoacrylic وانتظر حتى الجاف (الشكل 1).
  5. تأمين الحيوان في مرحلة استخدام الجهاز رأس جبل. شطف مع ACSF معقمة وضمان أن البئر بين الجلد ورئيس جهاز جبل مختومة تماما. التفاف الماوس في بطانية البقاء على قيد الحياة للحفاظ على سوائية الحرارة.
  6. أداء ترقق الجمجمة في حل ACSF كما هو موضح سابقا (10). لاحظ أن فروة الرأس وليس إزالتها تماما. بانتظام تغيير ACSF لازالة الانقاض العظام وتجنب ارتفاع درجة الحرارة الأنسجة. أي حطام العظام المتبقية يمكن إزالتها مع نفث الهواء وجيزة. كما خفف الحل ACSF الاهتزازات التي تم إنشاؤها من قبل الحفر.
    ملاحظة: سمك الماوس الجمجمة يتراوح بين 80-150 ميكرون اعتمادا على عمر الحيوان والمنطقة من الفائدة.
  7. عن طريق حفر الأسنان (على سرعة متوسطة ولدغ 0.7 ملم) بدء رقيق على سطح الجمجمة في منطقة 1.0 مليمتر في القطر باستخدام بالتوازي مع الحركة الرأسية منتظم في الجمجمة وإزالة معظم العظم الإسفنجي (الأول 40 - 70 ميكرون). تذكر أن يحل محل ACSF كل 20-30 ثانية، والحد من الحفر دون انقطاع إلى 3-4 ثانية. لاحظ أن العظام الغرز بالقرب من أوعية دموية للغاية. تطبيق ACSF presoaked جلفوم لوقف نزيف في نهاية المطاف.
  8. استخدام حادة يمكن التخلص منها العيون شفرة المجهرية الاستمرار في التخفيف من الجمجمة، والحرص على عدم الضغط المفرط. المنطقة الأخيرة هي حوالي 0.5 مم في القطر، وبسماكة 20 - 35 ميكرون.
    ملاحظة: نظرا لإعادة نمو العظام وتندب، فمن الضروري لزيادة رقيقة نافذة في كل دورة التصوير.

3. ثنائي الفوتون المجهري (45 دقيقة)

  1. إذا لزم الأمر، حقن مع 19 ملغ / كغ من الكيتامين للحفاظ على التخدير الكافي.
  2. نقل الماوس (ثابت إلى مرحلة headmount) تحت المجهر ليزر ثنائي الفوتون. باستخدام الغمر الكائنات 20X المياهECTIVE مع الفتحة العددية 1.0، حدد موقع نافذة الجمجمة ضعيفة في وسط الميدان البصري باستخدام مصباح الفلورسنت برنامج التحصين الموسع. تأكد من أن الهدف من ذلك هو مغمورة دائما في ACSF.
  3. بدء المسح الضوئي ليزر مع وضع مقفل ليزر نابض (تي-الياقوت 680-1040nm). تعيين الطول الموجي الإثارة في 750 نانومتر للكشف عن مضان المنبعثة من ميثوكسي-XO4 وFITC-ديكستران في القنوات الزرقاء والخضراء على التوالي.
    ملاحظة: مجهر اثنين من مقسم الأشعة في 506 نانومتر و 555 نانومتر. يتم التقاط الضوء الأزرق بواسطة كاشف NDD مجهزة مرشح نانومتر 470 ± 12. يتم التقاط الضوء الأخضر من قبل كاشف GaAsP حساسية عالية مجهزة مرشح نانومتر 525 ± 25. قوة الليزر القصوى المنبعثة من الهدف يجب أن لا تتجاوز 10 ميغاواط لتجنب تلف الأنسجة الناتج عن الليزر.
  4. الحصول على كومة تضخم منخفضة (500 ميكرون × 500 ميكرون، 512 × 512 بكسل، 2 ميكرون الخطوة) في تقريب رقمي 0.7X لخلق خريطة 3D لإعادة المركزية دقيقة من العائد على الاستثمارفي نقطة زمنية لاحقة.
  5. الحصول على فسيفساء من 4 صور عالية التكبير الرقمي مع تقريب رقمي 2X (200 ميكرون × 200 ميكرون، 512 × 512 بكسل، 1 ميكرون الخطوة). باستخدام برامج التصوير تحريك نافذة في 200 ميكرون خطوات للقبض على جميع المناطق. عمق اكوام عادة 250 ميكرون، بدءا من سطح حنوني في كل صورة من الفسيفساء.
  6. قبل إزالة الماوس من المجهر، والتقاط صورة أو عمل خريطة 2D من الأوعية الدموية حنوني لإعادة المركزية المستقبلية للمجال التصوير مرسومة باليد.

4. الإنعاش وإعادة التصوير

  1. إزالة الجهاز رأس جبل من خلال تطبيق الجر في حين عقد الجمجمة تحت. إذا بقيت أي الغراء التي تعلق على الجمجمة أو الجلد، وتتخلص من تشغيله بعناية مع ملقط غرامة. خياطة فروة الرأس ووضع الماوس في قفص ساخنة لرصد الانتعاش من التخدير قبل إعادته إلى قفص المنزل. تطبيق كريم مضاد حيوي موضعي للخياطة وحقن كيتوبروفين (2.5 ملغ / كلغ) أناف ما يلي 2 أيام.
  2. كرر الخطوات من 1،1-2،5 لجلسات التصوير المتكررة. إذا لزم الأمر، حلق العظام مع شفرة المجهرية لضمان جودة أفضل للصورة.
    ملاحظة: ترقق إضافية مع حفر الأسنان قد تكون ضرورية عندما تكون الفترة الفاصلة بين جلسات التصوير أطول من شهر واحد.
  3. ضع الماوس تحت المجهر باستخدام الضوء epifluorescent وفقا لخريطة 2D من الأوعية الدموية حنوني مأخوذة من الدورة السابقة (الخطوة 3.6).
  4. بدء المسح الضوئي ليزر ثنائي الفوتون وضبط مرحلة المجهر لتحقيق التوافق في نطاق ميكرون باستخدام خريطة 3D حصلت عليه في الخطوة 3.4. الشروع في التصوير تفصيلا كما هو موضح في الخطوة 3.5.

5. بعد اكتساب ثلاثي الأبعاد إعادة الإعمار وصورة تحليل

  1. الحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد من الأوعية الدموية وترسبات الأميلويد باستخدام صورة برامج التحليل 3D مثل IMARIS (الإصدار 8.0 يستخدم و7.7.2).
  2. استخدام البرنامج المساعد طبقة تطبيع في القائمة ومعالجة الصور وعلى النقيض من تغيير القائمة الفرعية للحصول على النقيض المثالي للقناتين في عمق كامل من كومة الصورة.
  3. فتح الصور من نفس المنطقة في جميع نقاط وقت واحد ومعالجة دائما لهم في نفس الوقت من أجل مقارنة نقاط زمنية مختلفة.
  4. سفن تتبع باستخدام وحدة خيوط التتبع.
    1. انقر على أيقونة خيوط لخلق خيوط جديدة، تخطي التتبع التلقائي واختيار طريقة لصناعة السيارات في الطريق.
    2. تأكد من أن القناة المختارة يتوافق مع صورة الأوعية الدموية واستخدام وظيفة مختارة من المؤشر، انقر على التشعب السفينة التي يتم حفظها عبر جلسات التصوير حين عقد التحول + مراقبة مفاتيح لتحديد نقطة البداية. استخدام الدالة لتحديد مؤشر وانقر أثناء الضغط على مفتاح التحول لتحديد نقطة نهاية خيوط.
      ملاحظة: مقارنة بين obtaiوالهياكل العظمية نيد تظهر التغييرات الهيكلية الأوعية الدموية.
  5. أداء الطائرة من خلال تحليل طائرة لتتبع اللوحات الجديدة. تطبيق وحدة السطح إلى القناة الزرقاء لتتبع نمو لويحات Aβ. انقر على أيقونة سطح لخلق سطح جديد والمضي قدما في إنشاء سطح الآلية. استخدام الأسلوب العتبة لوضع وطرح إشارة الخلفية. توفر قائمة البيانات الإحصائية بالنسبة لسطح الودائع اميلويد الفردية.

النتائج

يصف هذا البروتوكول وسيلة لتصور cerebrovasculature والودائع اميلويد الوقت بدل الضائع. تم حقن الأصباغ الفلورية لتسمية ترسبات الأميلويد (ميثوكسي-XO4) 11 ولملء التجويف الدماغية (FITC-ديكستران) 1. استخدمت وحدات برامج تحليل صورة 3D لخلق صور 3D من حقل المستمر ?...

Discussion

تقنية الجمجمة مفتوحة لفي الجسم الحي اثنين الفوتون المجهر تقدم ميزة جلسات التصوير غير محدود من مجالات التصوير الكبيرة 13،14. ومع ذلك، وتنتج هذه التقنية أيضا التهاب في المنطقة التي تهم 14، في كثير من الأحيان غير متوافق أو تؤثر العصبية الوعائية 15 ال?...

Disclosures

الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

فإن الكتاب أن نعترف الدوري الفرنسي فرانسيز مناهضة L'épilepsie (لMA-L)، المعهد الوطني للسانتيه آخرون للبحوث ميديكال غرانت AVENIR R12087FS (لFJ)، منح من جامعة مونبلييه (لFJ) ومنحة من الاتحاد من أجل لا بحوث سور جنيه Cerveau (لNM). ونحن نعترف المساعدة التقنية من Chrystel افون في IPAM في الجسم الحي منشأة منصة التصوير الأساسية مونبلييه. كما نشكر ماري Vernov (كلية وايل كورنيل الطبية) لتنقيح الكتابة المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
methoxy-X04tocris4920use 10 mg/kg
FITC-Dextran 70 Kdasigma46945use 100 mg/kg
gelfoam/BloxangBausch and Lomb
micorsurgical bladesurgistar6900must be sharp and not dented
povidone-iodinebetadineantisceptic solution
binocular stereomicroscopeolympusSX10optimal image contrast is crucial for this procedure
2-photon microscopezeissZeiss LSM 710mp
fine scissors-toughcutFine science tools14058-09this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue

References

  1. Harb, R., Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. In vivo imaging of cerebral microvascular plasticity from birth to death. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (1), 146-156 (2013).
  2. Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. Perturbed neural activity disrupts cerebral angiogenesis during a postnatal critical period. Nature. 505 (7483), 407-411 (2014).
  3. Masamoto, K., et al. Microvascular sprouting, extension, and creation of new capillary connections with adaptation of the neighboring astrocytes in adult mouse cortex under chronic hypoxia. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 325-331 (2014).
  4. Marchi, N., Lerner-Natoli, M. Cerebrovascular remodeling and epilepsy. Neuroscientist. 19 (3), 304-312 (2013).
  5. Giannoni, P., et al. Cerebrovascular pathology during the progression of experimental Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 88, 107-117 (2016).
  6. Kimbrough, I. F., Robel, S., Roberson, E. D., Sontheimer, H. Vascular amyloidosis impairs the gliovascular unit in a mouse model of Alzheimer's disease. Brain. 138 (Pt 12), 3716-3733 (2015).
  7. Herzig, M. C., et al. Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis. Nat Neurosci. 7 (9), 954-960 (2004).
  8. Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. J Neurosci. 26 (40), 10129-10140 (2006).
  9. Liston, C., et al. Circadian glucocorticoid oscillations promote learning-dependent synapse formation and maintenance. Nat Neurosci. 16 (6), 698-705 (2013).
  10. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
  11. Klunk, W. E., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J Neuropathol Exp Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
  12. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  13. Cao, V. Y., et al. In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons. J Vis Exp. (71), (2013).
  14. Holtmaat, A., et al. Long term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  15. Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
  16. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. (43), (2010).
  17. Joseph-Mathurin, N., et al. Amyloid beta immunization worsens iron deposits in the choroid plexus and cerebral microbleeds. Neurobiol Aging. 34 (11), 2613-2622 (2013).
  18. Sadowski, M., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J Neuropathol Exp Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

118

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved