uzunlamasına<em&gt; İn Vivo</em&gt; Cerebrovasculature Görüntüleme: MSS Hastalıkları uygunluk

Özet

Bu yazının uzunlamasına iki foton mikroskopi kullanılarak in vivo amiloid plak birikimi sırasında cerebrovasculature bir biçimlenme izlemek için bir yordam açıklanır. Incelmiş kafatası preparat, Alzheimer hastalığının bir fare modelinde serebrovasküler hasara ilerlemesini değerlendirmek için floresan boyalar görselleştirme sağlar.

Özet

beynin damarsal Tadilat beyin patolojileri ortak bir özelliktir. In vivo görüntüleme teknikleri serebrovasküler plastisite veya hasar fazla mesai meydana gelen ve nöronal aktivitenin ya da kan akışına ilişkin tespit etmek esastır. In vivo iki foton mikroskopi yaşam beyinde büyük hücresel birimlerinin yapısal ve fonksiyonel plastisite çalışma sağlar. Özellikle, inceltilmiş-kafatası pencere hazırlama önemli beyin iltihabı neden olmadan faiz (ROI) kortikal bölgelerinde görselleştirme sağlar. kortikal ROI Tekrarlanan görüntüleme oturumları çok sayıda CNS hastalıklarının ilerlemesi sırasında zamanla hastalık işaretlerinden karakterizasyonu sağlayan mümkün bulunmaktadır. Beynin 250 um olan pial yapıları erişmek Bu teknik, genetik hücresel belirteçleri ve / veya vital boyaların tarafından kodlanan floresan probları tespitine dayanır. Ikinci (örneğin, floresan dekstranlar) Lumin eşlemek için kullanılırserebrovasküler yapıların al bölmesi. Burada tarif edilen protokole Germane Alzheimer hastalığı (AD) ilerlemesini değerlendirmek için amiloid birikintilerinin in vivo işaretleyici, metoksi-O4, kullanılmasıdır. Biz de vasküler değişiklikleri ve amiloid birikimlerinin izlemek için kullanılan alım sonrası görüntü işleme açıklar. AD model üzerinde halen odaklanarak, açıklanan protokol patolojik serebrovasküler değişiklikler meydana diğer merkezi sinir sistemi bozukluklarına alakalı.

Giriş

Beyin damar anatomik ve fonksiyonel nöron elde etmek için bir çok hücreli yapıdır. Gemilerin dinamik yeniden şekillenme beyin gelişimi süresince ve merkezi sinir sistemi (MSS) ^1,2 patolojilerin ilerlemesi sırasında oluşur. Yaygın serebrovasküler hasar Alzheimer hastalığı (AH), epilepsi dahil olmak üzere birçok CNS hastalıkları, travmatik beyin hasarının bir işaretidir ve ^3,4 ensefalit olduğu kabul edilmektedir. Başlangıcından ve kronik evreye, MSS hastalıkları modelleme nedenle, in vivo serebrovasküler değişiklikleri izleme belirgin hale gelir. serebrovasküler değişiklikler genellikle nöronal hasar veya plastisite ile eşzamanlı meydana geldiğinde nöro-damar yapısının görüntüleme MSS hastalığı patofizyolojiye deşifre etmek önemli bir giriş noktasını temsil eder.

Bu protokol, bir fare modelinde cerebrovasculature bir yenileme izlemek için uzunlamasına iki foton göre prosedürü anlatmaktadırAD nedeniyle amiloidojenik plak birikimi ^5-7 büyük ve küçük kalibreli damarları serebrovasküler kusurları ile işaretlenmiş bir ilerici patoloji. Bu prosedür, hastalığın süresi boyunca nörovasküler yeniden ile ilgili amiloid birikintileri ve konum ve büyüme izleme olarak gösterebilir. Vital floresan boyalar transgenik AD fareler ⁸ cerebrovasculature ve amiloid plaklarının görüntülenmesi için her bir görüntüleme oturumundan önce enjekte edilir. Bir inceltilmiş kafatası transkranial pencereden bir ROI Mükerrer görüntüleme oturumları non-invaziv ve seçim yöntemi yaşayan fare beyninde ^2,5,9,10 nörovasküler biçimlenme değerlendirmek için.

Aşağıdaki prosedür cerrahi protokol, görüntü toplama ve işleme özetliyor. çoğunlukla büyük leptomeningeal ve delici arteriyollerde serebral amiloid anjiyopati (CAA) erken ilerlemesi karakterizedir.

Protokol

Fareler yiyecek, su ad libitum giriş izin verilir ve bir 12-st bir ışık-karanlık döngüsünde tutulur. laboratuar hayvanları da içeren tüm prosedürler Ulusal ve Avrupa yasaları uyduğu ve Eğitim ve Bilimsel Araştırma (CEEA-LR-00651-01) Fransız Bakanlığı tarafından onaylanmıştır. 6 transgenik 5xFAD 4 yavru vahşi tipli (WT) kontrol farelerinin toplam Bu prosedür kullanıldı.

1. Ameliyat öncesi hazırlık

1. Intraperitoneal (İP) metoksi-x04 (10 mg / kg) Aβ mevduat ¹¹ etiketlemek için ameliyattan önce 48 saat enjekte edilir.
2. Steril yapay serebrospinal akışkan (CSF) (120 mM NaCI, 26.2 mM NaHCO _3, 2.5 mM KCI, Hazırlama 1 mM NaH ₂ PO _4, 1.3 mM _MgCl2, 10 mM glikoz, 95% O _{2/5% CO2} önce kabarcık 2.5 mM _CaCl2) eklenmiştir.
3. Bir otoklav veya aseptik önce sıcak bir boncuk sterilizatör kullanılarak, cerrahi aletleri (makas, forseps, jilet ve matkap ucu) Sterilizecerrahi.
4. Temiz emici bir bezle% 70 etanol ve kapaklı cerrahi tezgah ve mikroskop plaka temizleyin.
5. ketamin / ksilazin (75 mg / kg ve 10 mg / kg, sırası ile) ve analjezik ketoprofen (2.5 mg / kg) IP enjekte edilir.
6. pençe ya da kuyruk tutam anestezi uygun seviyesini kontrol edin.
7. Gözleri steril oftalmik merhem sürün ve bıyık kaçınarak kürk (kulak burun) tıraş. dikkatli cilt tahrişi önlemek için su ile durulanır, ardından olduğu gibi tüy dökücü krem ​​sürece kullanılabilir. bir jilet kalan kürk traş. povidon-iyot antiseptik solüsyon ile cilt sterilize edin.
8. binoküler mikroskop altında fare yerleştirin ve burun kulaklar bir cilt kesi yapmak. kafatası açığa çıkarmak için yanlara cilt çekin. periost insizyon ve art arda olası kanamayı durdurmak için steril aCSF ile kafatası durulayın.

2. Damarlanma Etiketleme ve inceltilmiş KafatasıPencere hazırlanması (40 dakika)

1. Bir pamuk uçlu göz merhemi çıkarın. Topikal oftalmik anestetik (tetrakain% 1) bir damla uygulayın ve nazikçe çıkıntı elde etmek için göz çukurlarının çevresindeki deri baskı.
2. Yardeni ve arkadaşları ¹² tarafından tarif edilen prosedür takip edilerek, retro-orbital sinüste (deri altı insülin iğne 100 mg / kg ya da 50 mg / ml solüsyon, 50 uL), dekstran (70 kDa) ile konjuge floresein izotiosiyanat (FITC) enjekte edilir. Gözleri steril oftalmik merhem sürün.
3. cilt geri çekilmiş ve kafatası seçilen görüntüleme alanı çevresinde temiz ve kuru olduğundan emin olun. Cihazı monte baş pencerenin etrafında siyonoakrilik tutkal küçük bir miktar uygulayın birkaç saniye ¹⁰ hafif basınç uygulayarak hedef bölgenin etrafında ve tutkal (yığılmış jilet bıçakları oluşan Şekil 1).
4. alan emin, cihaz monte baş pencerenin kenarına deri uçlarını çekinkuru. Cildi ve veteriner sınıf siyonoakrilik tutkal küçük bir miktar ile pencerenin kenarına sabitleyin ve kuru (Şekil 1) kadar bekleyin.
5. Baş-montaj cihazı kullanılarak aşamada hayvan sabitleyin. Steril aCSF ile durulayın ve iyice deri ve kafa monte aygıt arasında tamamen sızdırmaz olduğundan emin olun. normotermi korumak için bir hayatta kalma battaniye fareyi sarın.
6. Daha önce ¹⁰ açıklandığı gibi aCSF çözeltisi içinde kafatası incelme gerçekleştirin. kafa derisi tamamen kaldırıldı unutmayın. Düzenli kemik enkaz temizlemek için ve doku aşırı ısınmasını önlemek için aCSF değiştirin. Kalan kemik enkaz kısa hava ponponları kaldırılabilir. aCSF çözümü de sondaj yarattığı titreşimleri azaltır.
   NOT: hayvanın yaşına ve ilgi bölgeye göre 150 mikron 80 ila fare kafatası kalınlığı değişir.
7. (Orta hızda ve bir 0.7 mm çapak) bir diş matkap kullanarak bir alanda 1 kafatası yüzeyi incelme başlar.kafatasına düzenli dikey hareket paralel kullanarak ve kaldırmak çapı 0 mm süngerimsi kemik çoğu (ilk 40-70 mikron). ACSF her 20-30 saniyede değiştirin ve 3-4 sn kesintisiz sondaj sınırlamak için unutmayın. kemik yakın sütür Not oldukça vaskülarize olduğunu. aCSF nihai kanamayı durdurmak için gelfoam önceden ıslatılmış uygulayın.
8. aşırı baskı uygulamak için dikkatli olmak, kafatasının incelmesi ile devam etmek için keskin bir tek kullanımlık göz mikrocerrahi bıçak kullanın. 35 um - Nihai bölgesi çapında ve 20 bir kalınlığı yaklaşık 0.5 mm taşımaktadır.
   NOT: Kemik büyütme ve yara izi, her görüntüleme oturumda daha ince pencere için gerekli nedeniyle.

3. İki foton Mikroskopi (45 dk)

1. Gerekirse, uygun anesteziyi muhafaza etmek üzere 19 mg / kg ketamin enjekte edilir.
2. İki foton lazer mikroskop altında (headmount aşamasına sabit) fare aktarın. 20X suya daldırma obj kullanarak1,0 sayısal diyafram ile özelliklerin etkili epi-floresan lamba kullanarak optik alanın merkezinde incelmiş kranial pencereyi bulun. Amaç her zaman aCSF dalmış olduğundan emin olun.
3. Bir mod kilitli darbeli lazer (Ti-Safir 680-1040nm) ile lazer tarama başlatın. sırasıyla, mavi ve yeşil kanallarda yayılan metoksi-XO4 floresan ve FITC-dekstran tespit etmek için, 750 nm de dalgaboyu ayarlayın.
   Not: Mikroskop 506 nm ve 555 nm 'de iki ışın dağıtıcıları, yer alır. Mavi ışık, bir 470 ± 12 nm filtresi ile donatılmış bir NDD detektörü tarafından yakalanır. Yeşil ışık 525 ± 25 nm filtresi ile donatılmış yüksek hassasiyet GaAsP dedektör tarafından yakalanır. amaç yayılan maksimal lazer gücü, lazer kaynaklı doku hasarı önlemek için 10 mW aşmamalıdır.
4. düşük bir büyütme yığını Edinme (500 mm x 500 mm, 512 x 512 piksel, 2 mikron adım) ROI kesin yerini değiştirmesi için bir 3D harita oluşturmak için 0.7X sayısal zoomsonraki zaman noktalarında.
5. 2X sayısal zoom 4 yüksek dijital büyütme görüntülerin bir mozaik Edinme (200 mm x 200 mm, 512 x 512 piksel, 1 mikron adım). görüntüleme yazılımı 200 mikron adımda penceresini taşımak kullanarak tüm bölgeleri yakalamak için. yığınlar derinliği mozaik her görüntüde Pial yüzeyinden başlayarak, tipik olarak 250 mm.
6. mikroskop fareyi çıkarmadan önce, bir resim çekmek veya görüntüleme alanının gelecekteki yerini değiştirmesi için pial damarsal bir elle çizilmiş 2D harita yapmak.

4. Kurtarma ve Yeniden görüntüleme

1. altında kafatası tutarken çekiş uygulayarak kafa monte aygıtı kaldırın. Herhangi bir tutkal kafatası ya da deriye takılı kalırsa, ince forseps ile dikkatlice kazıyın. derisini dikin ve ev kafesine dönmeden önce anestezi kurtarma izlemek için ısıtılmış bir kafes içinde fare yerleştirin. sütür topikal antibiyotik krem ​​sürün ve ketoprofen enjekte (2.5 mg / kg) IP 2 gün sonra.
2. Tekrarlayın 1.1 tekrarlanan görüntüleme oturumları için 2.5 için yineleyin. Gerekirse, görüntünün en iyi kaliteyi sağlamak için bir mikrocerrahi bıçak ile kemik tıraş.
   NOT: görüntüleme oturumları arasındaki aralık bir aydan daha uzun olduğunda diş matkap ile ek inceltme gerekli olabilir.
3. önceki oturumda (adım 3.6) alınan pial damarların 2B haritasına göre epifluorescent ışık kullanarak mikroskop altında fare yerleştirin.
4. İki foton lazer tarama başlatın ve adım 3.4 'de elde edilen 3 boyutlu harita kullanarak mikrometre ölçekte uyum sağlanması için mikroskop sahne ayarlayın. Adım 3.5 anlatıldığı gibi ayrıntılı görüntüleme geçin.

5. Post-satın alma Üç boyutlu İmar ve Görüntü Analizi

1. Üç boyutlu damarların rekonstrüksiyon ve Imaris olarak 3D görüntü analiz yazılımı kullanarak amiloid birikimlerinin (sürüm 8.0 ve 7.7.2 kullanılan) edinin.
2. Görüntü yığını bütün derinliği iki kanal ideal kontrast elde etmek için görüntü işleme menüsü ve kontrast değişikliği alt menüsünde Normale Katman eklentisi kullanın.
3. Aynı anda tüm zaman noktalarında aynı bölgeden görüntüleri açın ve her zaman farklı zaman noktalarında karşılaştırmak amacıyla paralel olarak bunları işlemek.
4. Filament izleyici modülü kullanılarak iz gemiler.
   1. Yeni bir filaman oluşturmak için Filament simgesine tıklayın otomatik izleyici atlamak ve otomatik yol yöntemini seçin.
   2. Seçilen kanal damar görüntü ve işaretçi seçin fonksiyonunu kullanarak karşılık emin olun, bir başlangıç ​​noktası belirlemek için shift + kontrol tuşlarını tutarken görüntüleme oturumları arasında muhafaza edilir bir gemi bifürkasyonunda tıklayın. işaretçi seçme işlevini kullanın ve filamentler bitiş noktalarını seçmek için shift tuşuna basılı tutarken tıklatın.
      Not: obtai karşılaştırılmasıned iskeletler damarların yapısal değişiklikler gösterecektir.
5. Yeni plaklar izlemek için uçak analizi ile uçağı gerçekleştirin. Aβ plaklar büyümesini izlemek için mavi kanala yüzey modülünü uygulayın. Yeni bir yüzey oluşturmak ve otomatik yüzey oluşturma ile devam etmek yüzey simgesini tıklayın. ayarlamak ve arka plan sinyalini çıkarmak için eşikleme yöntemi kullanın. istatistik menüsü bireysel amiloid birikintilerinin yüzeyine veri göreli sağlar.

Sonuçlar

Bu protokol, cerebrovasculature ve amiloid birikintileri mesai görüntülenmesi için bir yöntemi tarif etmektedir. Floresan boyalar amiloid birikimlerinin (metoksi-XO4) ¹¹ etiketlemek için ve serebrovasküler lümen (FITC Dextran) ¹ doldurmak için enjekte edildi. 3D görüntü analiz yazılım modülleri ardışık zaman noktalarında çekilen görünümü sabit bir alanının 3D görüntüler oluşturmak için kullanıldı. Temsilcisi görüntüleri 5XFAD fare...

Tartışmalar

In vivo iki foton mikroskopi için açık kafatası tekniği büyük görüntüleme alanları ^13,14 sınırsız görüntüleme oturumları avantajı sunuyor. Ancak, bu teknik, aynı zamanda ilgi ¹⁴ bölgede inflamasyon üreten, genellikle uyumsuz ya da etkileyen nöro-vasküler okuma-çıkışları ^15. Aksine, inceltilmiş kafatası transkraniyal tekniği güvenilir serebrovasküler yapıların görüntüleme ve plak birikimini ^10,14 sağlayan nöro-inflamasyon ile so...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
methoxy-X04	tocris	4920	use 10 mg/kg
FITC-Dextran 70 Kda	sigma	46945	use 100 mg/kg
gelfoam/Bloxang	Bausch and Lomb
micorsurgical blade	surgistar	6900	must be sharp and not dented
povidone-iodine	betadine		antisceptic solution
binocular stereomicroscope	olympus	SX10	optimal image contrast is crucial for this procedure
2-photon microscope	zeiss		Zeiss LSM 710mp
fine scissors-toughcut	Fine science tools	14058-09	this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue