纵<em&gt;在体内</em&gt;的Cerebrovasculature影像:相关性疾病CNS

摘要

该原稿描述的过程使用纵向双光子显微镜体内淀粉样蛋白斑积累期间跟踪cerebrovasculature的重塑。减薄头骨制备使荧光染料的可视化，以评估在阿尔茨海默氏病的小鼠模型中脑血管损伤的进展。

摘要

大脑脉管系统的重塑是脑病理学的一个共同特征。 体内成像技术是检测脑可塑性或损害的发生加班费和相对于神经元活性或血流的基础。 体内双光子显微镜允许在客厅大脑细胞大单位结构和功能可塑性的研究。特别是，减薄-颅骨窗制剂允许的感兴趣区域（ROI）的皮质区域的可视化而不诱导显著脑炎症。皮质的投资回报率的重复成像会议是可行的，许多中枢神经系统疾病的进展过程中提供疾病特点随时间变化的表征。这种技术在访问内250μm的大脑的软脑膜结构依赖于检测通过基因细胞标记和/或活体染料编码的荧光探针。后者（ 例如，荧光葡聚糖）被用于映射LUMIN脑结构的人舱。锗本文所述的协议是使用淀粉样蛋白沉积物的体内标记物，甲氧基O4，以评估阿尔茨海默氏病（AD）进展。我们还描述了用于跟踪血管变化和淀粉样沉积的采集后图像处理。虽然目前专注于AD模型，描述的协议是有关在那里发生的病理变化脑血管病其他中枢神经系统疾病。

引言

脑血管是一个多细胞结构，这是在解剖学和功能上耦合到神经元。船只的动态重构发生在整个大脑发育和中枢神经系统^（CNS）1,2的病状的进展期间。它已被广泛接受脑损伤是几种中枢神经系统疾病，包括癫痫，阿耳茨海默氏病（AD），创伤性脑损伤的一个标志和脑炎^3,4。因此， 在体内追踪脑血管变化建模中枢神经系统疾病时，从发病进入慢性期变得显著。由于脑血管修改常与神经元损伤或可塑性伴随发生时，神经血管成像是一个关键切入点破译CNS疾病的病理生理机制。

这个协议描述了一个纵向的双光子基于程序来跟踪cerebrovasculature的重构的小鼠模型AD，由于淀粉样蛋白斑块沉积^5-7的大，小口径血管脑血管缺陷标志着一个渐进的病理。此过程允许淀粉样蛋白沉积和其位置和生长的跟踪的可视化对于神经血管重塑整个病程。重要的荧光染料的cerebrovasculature和淀粉样蛋白斑在转基因小鼠公元⁸可视化每个成像会议召开前被注入。通过减薄头骨颅窗口ROI的重复成像会议是非侵入性的和选择的方法在活老鼠的大脑^2,5,9,10评估神经血管重塑。

下面的步骤概括了手术方案，图像采集和处理。淀粉样脑血管病（CAA）主要在软脑膜大与穿透性小动脉的早期发展的特点。

研究方案

小鼠被允许食物，水随意访问，并维持12小时光照-黑暗周期。所有涉及实验动物的程序符合国家和欧洲的法律和由法国教育部教育和科学研究（CEEA-LR-00651-01）的批准。共有6个转基因5xFAD和4个同窝野生型（WT）对照组小鼠被用于此过程。

1.手术前准备

1. 腹腔（IP）注射甲氧基X04（10毫克/千克）手术标记Aβ存款¹¹前48小时。
2. 制备无菌人工脑脊液（ACSF）（120mM氯化钠，26.2毫_碳酸氢钠 ，2.5mM的氯化钾，1mM的的NaH ₂ PO _4，1.3毫_氯化镁 ，10mM葡萄糖;气泡以95％ _的 O _{2/5％CO 2}的前加入2.5毫摩尔的CaCl _2）。
3. 消毒手术工具（剪刀，镊子，刀片和钻头），用高压灭菌或无菌之前热珠灭菌手术。
4. 请用70％的乙醇和覆盖手术台和显微镜板用干净的吸水布。
5. 注入氯胺酮/赛拉嗪（75毫克/公斤和10毫克/公斤，分别）和镇痛药酮洛芬（2.5毫克/千克）的IP。
6. 请与爪子或尾巴捏麻醉适当的水平。
7. 应用无菌眼药膏眼睛和刮皮毛（鼻耳），同时避免了胡须。因为它是接着用水，以防止皮肤刺激仔细漂洗脱毛乳膏可以用作长。刮剩下的皮毛用刀片。消毒用碘伏防腐剂溶液皮肤。
8. 将鼠标的双目显微镜下和从耳朵到鼻使皮肤切口。侧身拉出皮肤暴露颅骨。切开骨膜并反复冲洗用无菌学联头骨停止可能的出血。

2.血管系统标签和减薄的头骨窗口准备（40分钟）

1. 取出眼膏用棉签。应用局部眼用麻醉（地卡因1％）的下降，轻轻地压在皮肤周围的眼窝实现凸出。
2. 在眶后窦以下通过亚德尼和同事¹²中描述的方法;注入用葡聚糖（70 kDa）的缀合异硫氰酸荧光素（FITC）（皮下注射胰岛素针100毫克/千克或50微升50毫克/毫升溶液）。应用无菌眼药膏的眼睛。
3. 保证皮肤回缩，头骨是围绕选定成像区清洁和干燥。申请围绕头部的窗氰基丙烯酸胶少量贴装器件（包括层叠剃须刀刀片，参见图1），和胶周围施加温和的压力的目标区域几秒钟^10。
4. 皮肤的端部拉向头部的窗口的边缘安装器件，确保的区域是干。固定皮肤和兽医级氰基丙烯酸胶少量的窗口的边缘，并等待直至干燥（ 图1）。
5. 固定动物在使用头戴式设备阶段。用无菌脑脊液冲洗，并确保对皮肤和头戴式设备之间的井是完全密封的。包裹鼠标生存毯子，以保持正常体温。
6. 如前所述¹⁰学联解决方案执行颅骨变薄。注意，头皮未完全除去。定期更改学联清除骨屑，避免组织过热。任何剩余的骨骼碎片可以用简短的空气泡芙被删除。学联解决方案还通过衰减钻探产生的振动。
   注:小鼠头骨厚度取决于动物的年龄和感兴趣区域80 150之间，以微米而变化。
7. 使用牙钻（以中速和0.7mm的毛刺）开始在区域1变薄颅骨表面。0毫米直径利用垂直平行于头骨有规律的运动，并除去大部分的骨松质（第40 - 70微米）。记得更换学联每隔20-30秒，并限制不间断钻3-4秒。需要注意的是骨缝线附近是高度血管。学联应用明胶海绵预浸停止最终出血。
8. 用锋利的一次性眼科显微叶片继续与颅骨变薄，小心不要施加过大的压力。最后区域是大约0.5毫米，直径与厚度为20 - 35微米。
   注:由于骨再生和瘢痕形成，有必要在每个成像会话的窗口进一步变薄。

3.双光子显微镜（45分钟）

1. 如果有必要，用19毫克/千克氯胺酮注射以维持足够的麻醉。
2. 在双光子激光显微镜下传送鼠标（固定到头戴阶段）。使用20X水浸泡OBJ为1.0的数值孔径ective，在使用外延荧光灯的光场的中心定位的变薄颅窗口。确保目标始终沉浸在学联。
3. 与锁模脉冲激光（钛宝石680-1040nm）启动激光扫描。在750纳米设定激发波长分别检测甲氧基XO 4的发射的荧光和FITC-葡聚糖的蓝色和绿色通道。
   注:本显微镜具有在506 nm和555 nm的两个分束器。蓝色的光被配备有470±12纳米的过滤器的NDD检测器捕获。绿色光被配备有525±25纳米的过滤器具有高灵敏度的GaAsP检测器捕获。从物镜射出的最大激光功率不应超过10毫瓦，以避免激光诱导的组织损伤。
4. 获取低倍率栈（500微米×500微米，512×512像素; 2微米步骤）在0.7X变焦数值创造了3D地图的ROI的精确重新定位在稍后的时间点。
5. 获得高4数字放大图像的镶嵌有2倍数字变焦（200微米×200微米，512×512像素; 1微米步骤）。使用图像处理软件在200微米的步骤将窗口移动到捕获所有地区。堆栈的深度通常为250微米，从表面软脑膜镶嵌的每幅图像中开始。
6. 从显微镜取出鼠标之前，拍照，或对影像领域的未来重新定位的软脑膜血管的手绘2D地图。

4.回收和再成像

1. 通过施加牵引力而下方保持头骨移除头部安装设备。如果有任何胶水仍然连接到颅骨或皮肤，用细镊子仔细地刮它。缝合头皮和将鼠标在加热的笼返回给家笼之前并监控从麻醉中恢复。应用局部抗生素乳膏于缝线和注入酮洛芬（2.5毫克/千克）我P上的以下2天。
2. 重复步骤重复成像会议1.1至2.5。如果需要的话，剃骨用显微叶片，以确保图像的最佳质量。
   注意:当成像会话之间的时间间隔是超过一个月与牙钻附加变薄可能是必要的。
3. 根据从以前的会话（步骤3.6）所采取的软脑膜血管的2D地图使用啶光显微镜下鼠标位置。
4. 启动双光子激光扫描和调整显微镜阶段在使用在步骤3.4中得到的3D地图的微米尺度来实现对准。如步骤3.5所述进行详细的成像。

5.收购后三维重建与图像分析

1. 获得脉管的三维重建和使用3D图像分析软件如IMARIS淀粉样蛋白沉积（版本使用8.0和7.7.2）。
2. 使用图像处理菜单和对比度变化的子菜单上的正常化层插件，以获得在图像栈的整个深度的两个通道中的理想的对比度。
3. 在所有时间点同时打开来自同一区域的图像和总是处理它们并联 ，以比较不同时间点。
4. 使用长丝示踪模块跟踪船只。
   1. 点击图标长丝创建一个新的细丝，跳过自动追踪并选择自动路径法。
   2. 是确定所选信道对应的血管图像，并使用指针的选择功能，点击即在保持变速+对照键，以确定一个起点穿过成像会话保守脉管分叉。使用指针的选择功能，同时按住shift键来选择丝的终点单击。
      注:obtai的比较斯内德骨骼会显示出血管的结构变化。
5. 通过平面分析进行平面追踪新的斑块。应用面模块与蓝色通道用于跟踪的Aβ斑块的生长。点击图标面来创建一个新的表面，并与自动曲面创建进行。使用阈值法来设置和减去背景信号。统计数据菜单提供相对于个别淀粉样蛋白沉积的表面数据。

结果

本协议描述的可视化cerebrovasculature和淀粉样蛋白沉积加班的方法。荧光染料注射标记的淀粉样蛋白沉积（甲氧基XO ^4）11，以填充脑血管管腔（FITC-葡聚糖^）1。 3D图像分析软件模块用于创建视图的连续时间点拍摄的恒定场的3D图像。在5XFAD小鼠⁵表明大部分的Aβ沉积物出现月龄3和4之间，在软组织生长（ 图2）和围绕穿透血管（ 图3）?...

讨论

体内双光子显微镜开放式颅骨技术提供大量成像领域^13,14无限成像会议的优势。然而，该技术也是在感兴趣区域¹⁴产生炎症，经常不相容或影响神经血管读数^15。相反，减薄头骨颅技术不会导致神经炎症，使脑血管结构的可靠的成像和菌斑积累^10,14。通过这种技术提出的第二个优点是稀疏的颅骨窗口的成功率可达80％〜90％，对于有经验的操纵者。成功的重大?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
methoxy-X04	tocris	4920	use 10 mg/kg
FITC-Dextran 70 Kda	sigma	46945	use 100 mg/kg
gelfoam/Bloxang	Bausch and Lomb
micorsurgical blade	surgistar	6900	must be sharp and not dented
povidone-iodine	betadine		antisceptic solution
binocular stereomicroscope	olympus	SX10	optimal image contrast is crucial for this procedure
2-photon microscope	zeiss		Zeiss LSM 710mp
fine scissors-toughcut	Fine science tools	14058-09	this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue