продольный<em&gt; В Vivo</em&gt; Визуализация Cerebrovasculature: Актуальность для заболеваний ЦНС

Резюме

Эта рукопись описывает процедуру для отслеживания ремоделирование cerebrovasculature во время амилоидного накопления бляшек в естественных условиях с использованием продольной двухфотонного микроскопии. Препарат разреженных черепа позволяет визуализировать флуоресцентные красители для оценки прогрессирования цереброваскулярной повреждения в мышиной модели болезни Альцгеймера.

Аннотация

Ремоделирование сосудов головного мозга является общей чертой патологий головного мозга. В естественных условиях методы визуализации имеют основополагающее значение для выявления сосудов головного мозга или повреждение пластичности происходит сверхурочно и по отношению к активности нейронов или кровотока. В естественных условиях двухфотонного микроскопии позволяет исследовать структурно-функциональной пластичности крупных клеточных единиц в живом мозге. В частности, препарат в разреженных черепа окно позволяет визуализировать корковых областей интереса (ROI), не вызывая значительное воспаление мозга. Повторные сеансы визуализации коркового ROI осуществимы, обеспечивая характеристику признаков заболевания в течение долгого времени при прогрессировании многочисленных заболеваний ЦНС. Этот метод доступа к пиальные структур в пределах 250 мкм мозга опирается на обнаружение флуоресцентных зондов, закодированных с помощью генетических клеточных маркеров и / или жизненно важных красителей. Последние (например, флуоресцентные декстраны) используются для отображения Luminаль отделение цереброваскулярных структур. Germane с протоколом , описанным в данном документе является использование маркера в естественных условиях амилоидных отложений, метоксигруппы-O4, для оценки болезни Альцгеймера (AD) прогрессии. Мы также опишем процесс обработки изображений после приобретения используется для отслеживания изменений сосудистой и амилоидных отложений. Сосредоточив в настоящее время на модели AD, описанный протокол имеет отношение к другим расстройств ЦНС, где происходят патологические изменения сосудов головного мозга.

Введение

Сосудистая мозг является многоклеточным структура, которая анатомически и функционально связан с нейронами. Динамический ремоделирование сосудов происходит на протяжении развития мозга и во время прогрессирования патологии центральной нервной системы (ЦНС) , в ^1,2 раза . Широко распространено мнение , что цереброваскулярные повреждение является признаком ряда заболеваний ЦНС, включая эпилепсию, болезнь Альцгеймера (AD), черепно - мозговой травмой и энцефалит ^3,4. Таким образом, отслеживание изменений цереброваскулярных в естественных условиях становится существенным при моделировании заболеваний ЦНС, от начала и в хронической фазе. Как цереброваскулярные изменения часто происходят одновременно с нейронного повреждения или пластичность, визуализация нейро-сосудистую систему представляет ключевую точку входа расшифровывать ЦНС патофизиологии заболевания.

Этот протокол описывает продольную процедуру на основе двухфотонную для отслеживания ремоделирование cerebrovasculature в модели мышиAD, прогрессирующая патология характеризуется цереброваскулярных дефектов на больших и малых калибров сосудов из - за отложения зубного налета амилоидогенного ^5-7. Эта процедура позволяет для визуализации амилоидных отложений и отслеживание их положения и роста по отношению к нейрососудистых ремоделирования на протяжении всего течения заболевания. Vital флуоресцентные красители вводят перед каждой сессией визуализации для визуализации cerebrovasculature и амилоидных бляшек у трансгенных мышей AD ^8. Повторные сеансы формирования изображения ROI через утонченной окна черепа транскраниальной является неинвазивным и метод выбора для оценки нервно - сосудистого ремоделирования в мозге живой мыши ^2,5,9,10.

Ниже описана процедура описывает хирургический протокол, сбора и обработки изображений. Раннее прогрессирование церебральной амилоидной ангиопатии (CAA) в основном при больших лептоменингиальной и проникающих артериол характеризуется.

протокол

Мышей разрешен доступ к вволю пищи, воды, и поддерживается на свет-темнота цикла 12 ч. Все процедуры, связанные с лабораторных животных соответствовали национальным и европейским законодательством и были одобрены Министерством образования Франции и научных исследований (КДЭОС-LR-00651-01). В общей сложности 6 трансгенных 5xFAD и контрольных мышей 4 однопометница дикого типа (WT) были использованы для этой процедуры.

1. Предоперационная подготовка

1. Внутрибрюшинно (IP) , вводят Метокси-x04 (10 мг / кг) 48 ч до операции маркировать A & beta ; депозиты ^11.
2. Приготовьте стерильную искусственную спинномозговую жидкость (ACSF) (120 мМ NaCl, 26,2 мМ NaHCO _3, 2,5 мМ КСl, 1 мМ NaH ₂ PO _4, 1,3 мМ MgCl _2, 10 мМ глюкозы, пузырь с 95% O _2/5% CO ₂ до добавляя 2,5 мМ CaCl _2).
3. Стерилизовать хирургических инструментов (ножницы, пинцет, бритвенных лезвий и бурового долота), с использованием автоклава или горячий шарик стерилизатор перед асептическиххирургия.
4. Очистите хирургическую скамью и микроскопа пластину с 70% -ным этанолом и крышкой с чистой впитывающей тканью.
5. Вводят кетамин / ксилазин (75 мг / кг и 10 мг / кг, соответственно) и анальгезирующее кетопрофен (2,5 мг / кг) IP.
6. Проверьте соответствующий уровень анестезии с лапой или хвостом щепотки.
7. Применить стерильный глазной мази для глаз и сбрить мех (нос до ушей), избегая при этом бакенбарды. Депиляции крем может быть использован до тех пор, как она следует тщательно ополаскивают водой, чтобы предотвратить раздражение кожи. Бритье оставшийся мех с лезвием бритвы. Стерилизовать кожу с повидон-йода раствором антисептика.
8. Поместите мышь под бинокулярным микроскопом и сделать разрез кожи от ушей к носу. Потяните кожу в сторону, чтобы выставить череп. Надрезать надкостницу и неоднократно полоскать череп с стерильной ACSF, чтобы остановить возможное кровотечение.

2. васкулатура Этикетировочное и изреженные ЧерепПодготовка окна (40 мин)

1. Удалите глазная мазь с наконечником хлопка. Нанесите каплю местного офтальмологического анестетика (тетракаина 1%) и осторожно надавить на кожу вокруг глазницы для достижения выпячивание.
2. Вводят флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) , конъюгированный с декстрана (70 кДа) (100 мг / кг или 50 мкл 50 мг раствора / мл; иглы для подкожных инъекций инсулина) в ретро-орбитального синуса , следуя процедуре , описанной Yardeni и коллегами ^12. Применить стерильный глазной мази для глаз.
3. Убедитесь в том, что кожа втягивается и череп чистой и сухой вокруг выбранной области изображения. Нанесите небольшое количество клея цианакриловой вокруг окна головки смонтировать устройство (состоящее из сложенных бритвенных лезвий, см Рисунок 1), а клей вокруг целевой области применения мягкое давление в течение нескольких секунд ^10.
4. Потяните концы кожи к краю окна оголовье устройства, убедившись, что областьсухой. Зафиксируйте кожу и край окна с небольшим количеством ветеринарного сорта цианакриловой клея и ждать , пока сухой (рисунок 1).
5. Зафиксируйте животное на стадии с использованием устройства головной монтирования. Промыть стерильной ACSF и убедитесь, что хорошо между кожей и головной горе устройства полностью герметичным. Оберните мышь в одеяло выживания для поддержания нормотермию.
6. Выполните утончение черепа в ACSF растворе , как описано выше ^10. Обратите внимание, что кожа головы не удаляется полностью. Регулярно менять ACSF, чтобы очистить кости мусора и во избежание перегрева тканей. Любые оставшиеся кости твердые частицы могут быть удалены с помощью коротких воздушных затяжек. Решение ACSF также затухает вибрации, созданных путем сверления.
   Примечание: Толщина мыши черепа варьирует от 80 до 150 мкм в зависимости от возраста животного и области, представляющей интерес.
7. С помощью бормашины (при средней скорости и 0,7 мм заусенцев а) начать истончение поверхности черепа в районе 1.0 мм в диаметре с помощью обычного вертикального движения параллельно черепа и удалить большую часть губчатой ​​кости (первой 40 - 70 мкм). не забудьте заменить ACSF каждые 20-30 сек и ограничить непрерывное бурение до 3-4 сек. Обратите внимание, что кости рядом с швами весьма васкуляризованная. Применить ACSF замачивается Gelfoam, чтобы остановить возможное кровотечение.
8. Используйте острый одноразовый офтальмологические микрохирургические лезвия продолжать истончение черепа, соблюдая осторожность, чтобы не применять чрезмерное давление. Конечный участок составляет около 0,5 мм в диаметре и с толщиной 20 - 35 мкм.
   Примечание: В связи с костной отрастания и рубцевания, необходимо дополнительно тонкое окно на каждой сессии визуализации.

3. Двухфотонное Микроскопия (45 мин)

1. При необходимости вводят с 19 мг / кг кетамина для поддержания адекватной анестезии.
2. Перенесите мышь (крепится к стадии headmount) под двухфотонного лазерного микроскопа. Использование погружения OBJ 20X водыective с числовой апертурой 1,0, найти утонченную черепной окно в центре оптического поля с использованием эпи-флуоресцентной лампой. Убедитесь в том, что цель всегда погружен в ACSF.
3. Запустите лазерное сканирование с режимом заперта импульсного лазера (Ti-Sapphire 680-1040nm). Установка длины волны возбуждения при 750 нм для обнаружения излучаемого флуоресценции метокси-xO4 и FITC-декстрана в синих и зеленых каналов соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскоп имеет два разветвители пучка при 506 нм и 555 нм. Синий свет улавливается детектором NDD оборудованного нм фильтром 470 ± 12. Зеленый свет захвачен GaAsP детектором высокой чувствительности, снабженный нм фильтром 525 ± 25. Максимальная мощность лазера, излучаемый из объектива не должна превышать 10 мВт, чтобы избежать лазерного повреждения тканей.
4. Приобретать низкий стек увеличение (500 мкм × 500 мкм, 512 х 512 пикселей; 2 мкм шаг) при численном увеличении 0,7х для создания 3D-карты для точного перелокализации КОРОЛЯв более поздние моменты времени.
5. Приобретать мозаику из 4-х изображений с высоким цифровым увеличением с цифровым зумом 2X (200 мкм × 200 мкм, 512 х 512 пикселей; 1 мкм шаг). Использование программного обеспечения визуализации перемещения окна с шагом 200 мкм, чтобы охватить все регионы. Глубина стеки обычно составляет 250 мкм, начиная с пиальных поверхности в каждом изображении мозаики.
6. Перед удалением мышь с микроскопом, чтобы сделать снимок или сделать рукописную 2D карту пиальных сосудистую для будущего перелокализации области визуализации.

4. Восстановление и повторная визуализация

1. Удалите устройство головки монтажа путем применения тяги, держа череп под ним. Если какой-либо клей остается прикрепленной к черепу или кожей, царапать его тщательно с тонким пинцетом. Шовный кожу головы и поместите мышь в отапливаемом клетке, чтобы контролировать восстановление после анестезии перед возвращением его в дом клетке. Применить актуальные крем антибиотик к шву и вводят кетопрофен (2,5 мг / кг) ЯP следующие 2 дня.
2. Повторите шаги 1.1 до 2.5 для повторных сеансов визуализации. При необходимости брить кости с микрохирургической лезвием, чтобы обеспечить оптимальное качество изображения.
   Примечание: Дополнительное разбавление бормашины может быть необходимо, когда интервал между сеансами формирования изображения больше, чем один месяц.
3. Поместите мышь под микроскопом с использованием эпифлуоресцентной света в соответствии с 2D-карте пиальных сосудистую систему, взятой из предыдущей сессии (шаг 3.6).
4. Запустите двухфотонную лазерное сканирование и отрегулировать столик микроскопа для достижения выравнивания в масштабе микрометра с использованием 3D-карты, полученной на стадии 3.4. Перейдем к подробному визуализации, как описано в шаге 3.5.

5. после приобретения трехмерной реконструкции и анализа изображений

1. Получение трехмерных реконструкций и сосудистую амилоидные отложений с использованием программного обеспечения для анализа изображений, таких как 3D Imaris (используется версия 8.0 и 7.7.2).
2. Используйте Layer плагин Нормализовать в меню обработки изображений и подменю изменения контраста , чтобы получить идеальный контраст двух каналов на всю глубину стека изображения.
3. Открыть изображения из той же области во всех временных точках одновременно и всегда обрабатывать их параллельно , с тем чтобы сравнить различные моменты времени.
4. Микроэлементы сосуды с помощью модуля копира нити.
   1. Нажмите на иконку нити, чтобы создать новую нить, пропустите автоматический трассировщик и выбрать метод автоматического пути.
   2. Убедитесь, что выбранный канал соответствует сосудистому образу и с помощью выберите функцию указателя, нажмите на развилке сосуда, который сохраняется через сеансов визуализации, удерживая клавиши Shift + Control, чтобы определить начальную точку. Используйте функцию выбора из указателя и нажмите, удерживая клавишу переключения, чтобы выбрать конечные точки нитей.
      Примечание: Сравнение obtaiNED скелеты покажет структурные изменения сосудистой системы.
5. Выполните плоскость по плоскости анализа для отслеживания новых бляшек. Нанести поверхность модуля для синего канала для отслеживания роста A & beta; бляшек. Нажмите на иконку поверхности, чтобы создать новую поверхность и приступить к созданию автоматизированной поверхности. Используйте способ сегментации, чтобы установить и вычесть фоновый сигнал. Меню статистики предоставляет данные относительно поверхности отдельных амилоидных отложений.

Результаты

Этот протокол описывает метод для визуализации cerebrovasculature и амилоидных отложений сверхурочно. Флуоресцентные красители были введены для обозначения амилоидных отложений (метокси-xO4) ¹¹ и заполнить цереброваскулярных просвет (FITC-декстран) ^1. 3D-программные м?...

Обсуждение

Методика открытого черепа для в естественных условиях двухфотонного микроскопии предлагает преимущество неограниченного количества сеансов визуализации больших полей изображений ^13,14. Тем не менее, этот метод также производит воспаление в интересующей области ^14, ча?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
methoxy-X04	tocris	4920	use 10 mg/kg
FITC-Dextran 70 Kda	sigma	46945	use 100 mg/kg
gelfoam/Bloxang	Bausch and Lomb
micorsurgical blade	surgistar	6900	must be sharp and not dented
povidone-iodine	betadine		antisceptic solution
binocular stereomicroscope	olympus	SX10	optimal image contrast is crucial for this procedure
2-photon microscope	zeiss		Zeiss LSM 710mp
fine scissors-toughcut	Fine science tools	14058-09	this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue