אֹרכִּי<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

Summary

כתב יד זה מתאר הליך לעקוב אחר השיפוץ של cerebrovasculature במהלך הצטברות פלאק עמילואיד in vivo באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ אורך. הכנה הגולגולת דליל מאפשר הדמיה של צבעי ניאון כדי להעריך את התקדמות הנזק כלי דם במוח במודל של עכברים של מחלת אלצהיימר.

Abstract

שיפוץ של כלי הדם במוח הוא תכונה נפוצה של פתולוגיות במוח. בשנת vivo טכניקות הדמיה הן יסוד לזהות פלסטיות כלי דם במוח או קר ניזק שעות נוספות ביחס פעילות עצבית או זרימת דם. במיקרוסקופיה שני הפוטונים vivo מאפשר לימוד של פלסטיות מבנית ותפקודית של יחידות סלולר גדולה המוח החי. בפרט, הכנת חלון הגולגולת הדלילה מאפשרת ההדמיה של אזורים בקליפת המוח של עניין (ROI) ללא גרימת דלקת מוח משמעותית. פגישות הדמיה חוזרות ונשנות של ROI קליפת המוח הן ריאליות, מתן האפיון של סימני היכר מחלה לאורך הזמן במהלך ההתקדמות של מחלות מערכת עצבים מרכזיות רבות. טכניקה זו גישת מבני pial בתוך 250 מיקרומטר של המוח מסתמכת על זיהוי של בדיקות ניאון המקודדים על ידי סמנים תאיים גנטיים ו / או צבעים חיוניים. האחרון (למשל, dextrans הניאון) משמש כדי למפות את לומיןתא אל מבני כלי דם במוח. רלוונטי הפרוטוקול המתואר במסמך זה שימוש סמן in vivo של פיקדונות עמילואיד, methoxy-O4, להעריך מחלת אלצהיימר התקדמות (AD). כמו כן, אנו מתארים את עיבוד תמונה שלאחר הרכישה להשתמש כדי לעקוב אחר שינויים בכלי דם תצהירים עמילואיד. תוך התמקדות כיום על מודל של מחלת אלצהיימר, פרוטוקול המתואר רלוונטי הפרעות CNS אחרים בהם שינויים מוחי פתולוגי להתרחש.

Introduction

בכלי הדם במוח הוא מבנה רב תאי, אשר מבחינה אנטומית והן מבחינה תפקודית מצמיד את הנוירונים. שיפוץ דינמי של כלי מתרחש לאורך התפתחות המוח במהלך ההתקדמות של פתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) ^1,2. מקובל כי נזק מוחי הוא סימן ההיכר של כמה מחלות של מערכת העצבים המרכזית, כולל אפילפסיה, מחלת אלצהיימר (AD), פגיעה מוחית טראומטית דלקת המוח ^3,4. לכן, מעקב אחר שינויי דם במוח in vivo הופך משמעותי כאשר דוגמנות מחלות מערכת עצבים מרכזיות, מהופעה ולתוך שלבים כרוניים. כמו שינויים דם במוח לעיתים קרובות להתקיים בו זמנית עם נזק עצבי או פלסטיות, הדמיה של כלי הדם-נוירו מייצג נקודת כניסה המפתח לפענח פתופיזיולוגיה מחלה של מערכת העצבים המרכזית.

פרוטוקול זה מתאר הליך שני פוטונים אורכי מבוסס לעקוב אחר השיפוץ של cerebrovasculature במודל של עכברים שללספירה, פתולוגיה מתקדמת בסימן פגמים כלי דם במוח על כלי קליבר גדולים וקטנים בשל בתצהיר פלאק amyloidogenic ^5-7. הליך זה מאפשר הדמיה של פיקדונות עמילואיד ומעקב על המצב וצמיחה שלהם ביחס שיפוץ העצבים וכלי הדם לאורך מהלך המחלה. צבעי ניאון ויטל מוזרקים לפני כל פגישה הדמיה הדמיה של הפלאק cerebrovasculature ו עמילואיד בעכברים לספירה מהונדס ^8. פגישות הדמיה חוזרות של ROI דרך חלון transcranial הגולגולת דליל אינן פולשני ואת שיטת הבחירה להעריך שיפוץ עצבים וכלי דם במוח עכבר חיים ^2,5,9,10.

ההליך שלהלן מתאר את הפרוטוקול כירורגית, רכישת תמונה ועיבוד. ההתקדמות מוקדם של angiopathy עמילואיד מוחות (CAA) בעיקר leptomeningeal הגדול arterioles חודר מאופיינת.

Protocol

עכברים מותר גישה כרצונך למזון, מים, ומתוחזק על מחזור אור כהה 12-hr. כל הנהלים הקשורים בחיות מעבדה תאמו לאומי וחוקים אירופיים אושרו על ידי משרד צרפתית לחינוך ולמחקר מדעי (CEEA-LR-00,651-01). בסך הכל מהונדס 6 5xFAD ו wildtype להמלטה 4 (WT) עכברים שליטים שמש לצורך הליך זה.

1. הכנה טרום ניתוחית

1. Intraperitoneally (IP) להזריק methoxy-X04 (10 מ"ג / ק"ג) 48 שעות לפני הניתוח לתייג פיקדונות Aβ ^11.
2. הכן מלאכותי הנוזל השדרתי סטרילי (aCSF) (120 mM NaCl, 26.2 מ"מ ₃ NaHCO, 2.5 KCl מ"מ, 1 מ"מ לאא _{2 4} PO, 1.3 מ"מ MgCl _2, 10 גלוקוז מ"מ; בועה עם 95% O _2/5% CO ₂ לפני הוספת 2.5 מ"מ CaCl _2).
3. לעקר כלים כירורגיים (מספריים, מלקחיים, סכין גילוח מקדח), באמצעות חיטוי או מעקר חרוז חם לפני ספטיתכִּירוּרגִיָה.
4. נקה את צלחת ספסל מיקרוסקופ כירורגי עם 70% אתנול ו מכסה במגבת סופגת נקיה.
5. להזריק קטמין / xylazine (75 מ"ג / ק"ג ו -10 מ"ג / ק"ג, בהתאמה) ואת ketoprofen כאבים IP (2.5 מ"ג / ק"ג).
6. בדוק את הרמה המתאימה של הרדמה בצביטות כפה או זנב.
7. החל משחת עיניים סטריליות לעיניים לגלח את הפרווה (אף לאוזניים) תוך הימנעות השפם. קרם מקריח יכול לשמש עוד הוא ואחריו שטיפה בזהירות במים על מנת למנוע גירוי בעור. לגלח את הפרווה הנותרים עם סכין גילוח. לעקר את העור עם פתרון חיטוי-יוד povidone.
8. מניחים את העכבר תחת מיקרוסקופ המשקפת ולעשות חתך בעור מהאוזניים אל האף. משוך את העור לצדדים לחשוף את הגולגולת. לחתוך את periosteum שוב ושוב לשטוף את הגולגולת עם aCSF סטרילי לעצור דימום אפשרי.

2. תיוג כלי הדם ואת דליל גולגולתהכנת חלונות (40 דקות)

1. הסר את משחת עיניים עם קצה כותנה. החל ירידה של הרדמת עיניים אקטואלית (tetracaine 1%) בעדינות ללחוץ על העור סביב ארובת העין כדי להשיג בליטה.
2. להזריק isothiocyanate והעמסת (FITC) מצומדות עם Dextran (70 KDA) (100 מ"ג / ק"ג או 50 μl של פתרון 50 מ"ג / מ"ל; מחט אינסולין תת עורי) בסינוס רטרו מסלולית הנוהל המתואר על ידי ירדני ועמיתיו ^12. החל משחת עיניים סטריליות לעיניים.
3. ודא כי העור הוא חזר בו הגולגולת היא נקיה ויבשה מסביב לאזור ההדמיה שנבחר. למרוח כמות קטנה של דבק cyanoacrylic סביב החלון של ראש מכשיר הר (מורכב להבים כתער מוערם, ראה איור 1), ודבק סביב אזור היעד הפעלה לחץ עדין במשך כמה שניות ^10.
4. משוך את הקצוות של העור אל קצה החלון של ראש מכשיר הר, מוודא את האזוריָבֵשׁ. אבטח את העור ואת קצה החלון עם כמות קטנה של דבק cyanoacrylic כיתת וטרינרים ולחכות עד יבש (איור 1).
5. Secure חיה בשלב השימוש בהתקן ראש ההר. לשטוף עם aCSF סטרילי ולהבטיח כי גם בין העור לבין התקן ראש ההר אטום לחלוטין. עוטף את העכבר בשמיכת הישרדות לשמור טמפרטורה נורמלית.
6. בצע דליל של הגולגולת בתמיסת aCSF כפי שתוארו לעיל ^10. ראוי לציין, כי הקרקפת לא הוסרה לחלוטין. באופן קבוע לשנות את aCSF כדי לנקות פסולת עצם כדי למנוע התחממות יתר של רקמות. כל פסולת עצם נותרת ניתן להסיר עם פחזניות אוויר קצרות. פתרון aCSF גם פוחת ויברציות שנוצרו על ידי קידוח.
   הערה: עכבר גולגולת העובי משתנה בין 80 ל 150 מיקרומטר בהתאם לגיל של החיה ואת האזור של עניין.
7. בעזרת מקדח שיניים (במהירות בינונית וכן בר 0.7 מ"מ) להתחיל לדלל את פני הגולגולת באזור 1.0 מ"מ קוטר באמצעות במקביל תנועה אנכי קבוע לגולגולת ולהסיר את רוב העצם הספוגי (ראשון 40 - 70 מיקרומטר). לזכור להחליף aCSF כל 20-30 שניות ולהגביל קידוח רצוף 3-4 שניות. שימו לב תפרי העצם קרוב vascularized מאוד. החל aCSF presoaked gelfoam לעצור דימום הסופי.
8. השתמש סכין microsurgical עיני הפנויה חד להמשיך עם הדילול של הגולגולת, נזהר שלא להפעיל לחץ מוגזם. האזור האחרון הוא של כ -0.5 מ"מ בקוטר בעובי של 20 - 35 מיקרומטר.
   הערה: בשל עצם לצמיחה מחודש וצלקות, יש צורך עוד דקת החלון בכל פגישת הדמיה.

שני פוטונים 3. מיקרוסקופי (45 דקות)

1. במידת הצורך, להזריק עם קטמין 19 מ"ג / ק"ג לשמור הרדמה נאותה.
2. מעבירים את העכבר (מקובע בשלב headmount) תחת מיקרוסקופ לייזר שני פוטונים. באמצעות obj טבילה במים 20Xective עם צמצם מספרי של 1.0, לאתר את חלון גולגולתי הדליל במרכז השדה האופטי באמצעות מנורת EPI-ניאון. ודא כי המטרה היא שקועה תמיד aCSF.
3. התחל סריקת לייזר עם לייזר פעמו נעול במצב (680-1040nm Ti-ספיר). גדר גל עירור ב 750 ננומטר לזהות את הקרינה הנפלטת של methoxy-XO4 ו FITC-dextran באפיקים הכחולים וירוקים בהתאמה.
   הערה: יש המיקרוסקופ שני מפצלי קרן ב 506 ננומטר ו 555 ננומטר. אור כחול הוא נתפס על ידי גלאי NDD המצוידת במסנן ננומטר 470 ± 12. אור ירוק הוא נתפס על ידי גלאי Gaasp רגישות גבוהה המצוידת במסנן ננומטר 525 ± 25. כוח הליזר המקסימאלי נפלט המטרה לא יעלה על 10 mW כדי למנוע ניזק לרקמות נגרם ליזר.
4. רוכש ערימה בהגדלה נמוכה (500 מיקרומטר x 500 מיקרומטר, 512 x 512 פיקסלים; 2 מיקרומטר צעד) בשעת זום מספרי 0.7x ליצור מפת 3D עבור relocalization המדויק של ROIב מאוחר יותר נקודות זמן.
5. רוכש פסיפס של 4 תמונות בהגדלה גבוהות דיגיטליות עם זום מספרי 2X (200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר, 512 x 512 פיקסלים; 1 מיקרומטר צעד). השימוש בתוכנת ההדמיה להזיז את החלון 200 מיקרומטר צעדים כדי ללכוד כל האזורים. עומק הערימות הוא בדרך כלל 250 מיקרומטר, החל משטח pial בכל תמונה של הפסיפס.
6. לפני הסרת העכבר המיקרוסקופ, לצלם תמונה או לעשות מפה 2D מצוירת ביד של כלי הדם pial עבור relocalization העתיד של בתחום ההדמיה.

שחזור 4. מחדש הדמיה

1. הסר את ההתקן הר הראש ידי החלת גרירה תוך כדי לחיצה על הגולגולת מתחת. אם כל דבק נשאר מחובר הגולגולת או העור, לגרד אותו בזהירות עם מלקחיים בסדר. לתפור את הקרקפת ומניח את העכבר בכלוב מחומם לפקח התאוששות מן ההרדמה לפני החזרתו לכלוב בבית. החל משחה אנטיביוטית אקטואלי תפר ולהזריק ketoprofen (2.5 מ"ג / ק"ג) אניP הבאה 2 ימים.
2. חזור על שלבי 1.1 כדי 2.5 עבור הפעלות הדמיה חוזרות ונשנות. במידת הצורך, לגלח את העצם עם להב microsurgical על מנת להבטיח איכות אופטימלית של התמונה.
   הערה: דילול נוסף עם מקדח השיניים עשויה להיות נחוצה כאשר המרווח בין פגישות הדמיה הוא יותר מחודש אחד.
3. מקם את העכבר מתחת למיקרוסקופ באמצעות אור epifluorescent לפי מפת 2D של כלי הדם pial שנלקחו במפגש הקודם (שלב 3.6).
4. התחל סריקת ליזר שני פוטונים ולהתאים במת מיקרוסקופ כדי להשיג יישור בקנה המידה מיקרומטר באמצעות מפת 3D שהושגה בשלב 3.4. המשך הדמיה מפורטת כמתואר בשלב 3.5.

5. לאחר רכישת ניתוח לשיקום תמונה תלת ממדי

1. השג שחזורים תלת ממדי של כלי הדם ואת תצהירים עמילואיד באמצעות תוכנת ניתוח תמונת 3D כגון Imaris (גרסה בשימוש 8.0 ו 7.7.2).
2. השתמש תוסף Layer לנרמל בתפריט עיבוד תמונת משנה שינוי בניגוד להשיג ניגודיות אידיאלי של שני הערוצים בעומק כולו ערימת התמונה.
3. פתח את התמונות מאותו האזור בכל נקודות הזמן בו זמנית תמיד לעבד אותם במקביל על מנת להשוות את בנקודות הזמן השונות.
4. כלי מעקב באמצעות מודול נותב נימה.
   1. הקש על סמל הנימה ליצור נימה חדשה, לדלג על נותב האוטומטי לבחור את השיטה האוטומטית הנתיב.
   2. הקפד הערוץ הנבחר תואם את תמונת כלי דם באמצעות הפונקציה הנבחרת של המצביע, לחץ על הסתעפות כלי שיט נשמרת ברחבי הפעלות ההדמיה תוך כדי הלחיצה על מקשי shift + בקרה כדי לקבוע נקודת התחלה. השתמש בפונקציה הנבחרת של המצביע ולחץ תוך החזקת מקש Shift כדי לבחור את נקודות הקצה של החוטים.
      הערה: השוואת obtaiשלדים נדים יציגו שינויים מבניים של כלי הדם.
5. בצע מטוס על ידי ניתוח מטוס כדי לעקוב אחר לוחות חדשים. החל מודול משטח לערוץ הכחול למעקב אחר את היווצרות הפלאק Aβ. הקש על סמל השטח כדי ליצור משטח חדש להמשיך ביצירת המשטח האוטומטית. השתמש בשיטת thresholding להגדיר ולחסר את אות הרקע. בתפריט הנתונים הסטטיסטיים מספק ביחס נתונים על פני השטח של פיקדונות עמילואיד הפרט.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר שיטה לדמיין את השעות הנוספות cerebrovasculature ופיקדונות עמילואיד. צבעי ניאון הוזרקו לתייג תצהירים עמילואיד (methoxy-XO4) ¹¹ וכדי למלא את לומן כלי דם במוח (FITC-dextran) ^1. מודולי תוכנה לניתוח תמונת 3D שמש כדי ליצור תמונות 3D של שדה קבוע מבט שנת...

Discussion

הטכניקה פתוחה הגולגולת עבור in vivo שני פוטונים במיקרוסקופ מציעה את היתרון של הפעלות הדמיה בלתי מוגבלות של שדות הדמיה גדולים ^13,14. עם זאת, הטכניקה הזו גם מייצרת דלקת באזור של עניין ^14, לעתים קרובות לא תואם או להשפיע נוירו-וסקולרית לקריאה פסקי ^15. תהפוך...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
methoxy-X04	tocris	4920	use 10 mg/kg
FITC-Dextran 70 Kda	sigma	46945	use 100 mg/kg
gelfoam/Bloxang	Bausch and Lomb
micorsurgical blade	surgistar	6900	must be sharp and not dented
povidone-iodine	betadine		antisceptic solution
binocular stereomicroscope	olympus	SX10	optimal image contrast is crucial for this procedure
2-photon microscope	zeiss		Zeiss LSM 710mp
fine scissors-toughcut	Fine science tools	14058-09	this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue