Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Obtención de imágenes de la vasculatura cerebral: Importancia de las enfermedades del sistema nervioso central

Resumen

Este manuscrito describe un procedimiento para realizar un seguimiento de la remodelación de la vasculatura cerebral durante la acumulación de placa amiloide in vivo usando longitudinal microscopía de dos fotones. Una preparación-cráneo adelgazada permite la visualización de los tintes fluorescentes para evaluar la progresión del daño cerebrovascular en un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer.

Resumen

Remodelación de la vasculatura del cerebro es un rasgo común de las patologías cerebrales. In vivo técnicas de imagen son fundamentales para detectar la plasticidad cerebrovascular o daños que se produzcan las horas extraordinarias y en relación con la actividad neuronal o el flujo sanguíneo. In vivo microscopía de dos fotones permite el estudio de la plasticidad estructural y funcional de las grandes unidades celulares en el cerebro vivo. En particular, la preparación de ventana cráneo adelgazada permite la visualización de regiones corticales de interés (ROI) sin inducir inflamación significativa en el cerebro. sesiones de formación de imágenes repetitivas de ROI cortical son factibles, proporcionando la caracterización de características distintivas de la enfermedad con el tiempo durante la progresión de numerosas enfermedades del SNC. Esta técnica acceder a las estructuras pial dentro de 250 micras del cerebro se basa en la detección de sondas fluorescentes codificadas por marcadores celulares genéticos y / o colorantes vitales. Este último (por ejemplo, dextranos fluorescentes) se utilizan para mapear la Luminal compartimiento de las estructuras cerebrovasculares. Germane con el protocolo descrito en el presente documento es el uso de un marcador in vivo de depósitos de amiloide, metoxi-O4, para evaluar la enfermedad de Alzheimer progresión (AD). También se describe el tratamiento de la imagen posterior a la adquisición utilizado para realizar un seguimiento de los cambios vasculares y los depósitos amiloides. Aunque se centra actualmente en un modelo de AD, el protocolo descrito es relevante para otros trastornos del sistema nervioso central donde se producen cambios patológicos cerebrovasculares.

Introducción

La vasculatura del cerebro es una estructura multicelular, que está anatómicamente y funcionalmente acoplado a las neuronas. Una remodelación dinámica de los vasos se produce en todo el desarrollo del cerebro y durante la progresión de patologías del sistema nervioso central (CNS) ^1,2. Es ampliamente aceptado que el daño cerebrovascular es una característica de varias enfermedades del sistema nervioso central, incluyendo la epilepsia, la enfermedad de Alzheimer (EA), lesión cerebral traumática y la encefalitis de ^3,4. Por lo tanto, el seguimiento de los cambios cerebrovasculares en vivo se vuelve significativo cuando se modela enfermedades del SNC, desde el inicio y en fases crónicas. Como modificaciones cerebrovasculares ocurren a menudo en forma concomitante con el daño neuronal o plasticidad, la imagen de la neuro-vascular representa un punto de partida clave para descifrar SNC fisiopatología de la enfermedad.

Este protocolo describe un procedimiento basado en dos fotones longitudinal para realizar un seguimiento de la remodelación de la vasculatura cerebral en un modelo de ratón deAD, una patología progresiva caracterizada por defectos en los vasos cerebrovasculares calibre grandes y pequeñas, debido a la deposición de placas amiloidogénica ^5-7. Este procedimiento permite la visualización de los depósitos de amiloide y el seguimiento de su posición y el crecimiento con respecto a la remodelación neurovascular durante todo el curso de la enfermedad. Colorantes fluorescentes vitales se inyectan antes de cada sesión de formación de imágenes para la visualización de las placas de amiloide y vasculatura cerebral en ratones transgénicos AD ^8. Sesiones de formación de imágenes repetidas de un retorno de la inversión a través de una ventana cráneo transcraneal adelgazada es no invasivo y el método de elección para evaluar la remodelación neurovascular en el cerebro de ratón de estar ^2,5,9,10.

En el procedimiento siguiente se describe el protocolo quirúrgico, adquisición y procesamiento de imágenes. La progresión temprana de la angiopatía amiloide cerebral (CAA) en su mayoría en general leptomeníngeo y arteriolas penetrantes se caracteriza.

Protocolo

Los ratones se les permite el acceso ad libitum a la comida, el agua, y se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas. Todos los procedimientos con animales de laboratorio se ajustaban a las leyes nacionales y europeas y fueron aprobados por el Ministerio Francés de Educación e Investigación Científica (CEEA-LR-00651-01). Un total de 6 transgénico 5xFAD y ratones de control 4 camada de tipo salvaje (WT) se utilizaron para este procedimiento.

Preparación 1. Pre-operatorio

1. Por vía intraperitoneal (IP) inyectar metoxi-X04 (10 mg / kg) 48 horas antes de la cirugía para etiquetar depósitos Aß ^11.
2. Preparar fluido estéril cefalorraquídeo artificial (LCRa) (NaCl 120 mM, 26,2 mM NaHCO _3, KCl 2,5 mM, 1 mM NaH ₂ PO _4, 1,3 mM MgCl _2, glucosa 10 mM; burbuja con 95% _O2 / 5% de CO ₂ antes la adición de 2,5 mM CaCl _2).
3. Esterilizar instrumentos quirúrgicos (tijeras, pinzas, cuchillas de afeitar y la broca), utilizando un autoclave o esterilizador de cuentas caliente antes asépticacirugía.
4. Limpiar el banco y la placa de microscopio quirúrgico con 70% de etanol y cubierta con un paño absorbente limpio.
5. Inyectar ketamina / xilazina (75 mg / kg y 10 mg / kg, respectivamente) y el ketoprofeno analgésico (2,5 mg / kg) IP.
6. Comprobar el nivel apropiado de la anestesia con la pata o la cola pellizcos.
7. Aplique una pomada oftálmica estéril para los ojos y afeitar el pelo (nariz para los oídos), evitando los bigotes. Una crema depilatoria se puede utilizar siempre que es seguido de un enjuague con agua cuidadosamente para evitar la irritación de la piel. Afeitarse el pelo sobrante con una cuchilla de afeitar. Esterilizar la piel con una solución antiséptica de povidona yodada.
8. Coloque el ratón bajo el microscopio binocular y hacer una incisión en la piel de las orejas a la nariz. Tire de la piel hacia los lados para exponer el cráneo. Incisión en el periostio y enjuagar varias veces el cráneo con ACSF estéril para detener el sangrado sea posible.

2. El etiquetado y la vasculatura del cráneo DiluidoPreparación de la ventana (40 min)

1. Retire el ungüento oftálmico con una punta de algodón. Aplicar una gota de anestésico tópico oftálmico (tetracaína al 1%) y presionar suavemente la piel alrededor de la cuenca del ojo para lograr la protrusión.
2. Inyectar isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con dextrano (70 kDa) (100 mg / kg o 50 l de una solución 50 mg / ml; insulina aguja hipodérmica) en el seno retro-orbital siguiendo el procedimiento descrito por Yardeni y colegas ^12. Aplique una pomada oftálmica estéril para los ojos.
3. Asegúrese de que la piel se retrae y el cráneo esté limpio y seco en todo el área de imagen seleccionada. Aplicar una pequeña cantidad de pegamento cianoacrılico alrededor de la ventana de la cabeza dispositivo de montaje (que consiste en hojas de afeitar apilados, véase la figura 1), y el pegamento alrededor de la región de destino aplicando una presión suave durante varios segundos ^10.
4. Tire de los extremos de la piel hasta el borde de la ventana de la cabeza dispositivo de montaje, asegurándose de que la zona estáseco. Asegure la piel y el borde de la ventana con una pequeña cantidad de pegamento veterinaria cianoacrılico grado y esperar hasta que se seque (Figura 1).
5. Asegure el animal en la etapa de utilizar el dispositivo de montaje en la cabeza. Enjuague con ACSF estéril y asegurar que el pozo entre la piel y el dispositivo de la cabeza de montaje está perfectamente sellados. Envolver el ratón en una manta de supervivencia para mantener la normotermia.
6. Realizar adelgazamiento del cráneo en solución LCRa como se describió anteriormente ^10. Tenga en cuenta que el cuero cabelludo no se elimina completamente. Cambiar regularmente las ACSF para limpiar restos de hueso y tejido para evitar el sobrecalentamiento. Cualquier restos de hueso restante se puede quitar con soplos de aire breves. La solución LCRa también atenúa las vibraciones creadas por la perforación.
   NOTA: El espesor del cráneo del ratón varía entre 80 a 150 micras dependiendo de la edad del animal y la región de interés.
7. Usando un taladro dental (a velocidad media y 0,7 mm rebabas) inicia el adelgazamiento de la superficie del cráneo en una zona 1.0 mm de diámetro utilizando un movimiento regular vertical paralelo al cráneo y eliminar la mayoría del hueso esponjoso (primero 40 - 70 micras). recuerde que debe sustituir a ACSF cada 20-30 segundos y limitar la perforación ininterrumpido a 3-4 seg. Tenga en cuenta que el hueso cerca de suturas es altamente vascularizado. Aplicar LCRa remojado previamente espuma de gel para detener un eventual sangrado.
8. Utilice una hoja de microcirugía oftálmica desechable afilado para continuar con el adelgazamiento del cráneo, teniendo cuidado de no aplicar demasiada presión. La región final es de alrededor de 0,5 mm de diámetro y con un espesor de 20 - 35 micras.
   NOTA: Debido a la regeneración del hueso y la cicatrización, es necesario más delgada la ventana en cada sesión de imágenes.

3. microscopía de dos fotones (45 min)

1. Si es necesario, inyectar con 19 mg de ketamina / kg para mantener la anestesia adecuada.
2. Transferir el ratón (fijo a la etapa headmount) bajo el microscopio de láser de dos fotones. El uso de un obj inmersión 20X aguareflexivo con una apertura numérica de 1,0, ubicar la ventana craneal adelgazada en el centro del campo óptico usando la lámpara de epi-fluorescencia. Asegúrese de que el objetivo siempre está inmerso en ACSF.
3. Iniciar el escaneado láser con un láser pulsado modo bloqueado (Ti-zafiro 680-1040nm). Ajuste de longitud de onda de excitación a 750 nm para detectar la fluorescencia emitida de la metoxi-xO4 y FITC-dextrano en los canales azul y verde, respectivamente.
   NOTA: El microscopio tiene dos divisores de haz en 506 nm y 555 nm. La luz azul es capturado por un detector de NDD equipado con un filtro de 470 ± 12 nm. La luz verde es capturado por un detector de alta sensibilidad GaAsP equipado con un filtro de 525 ± 25 nm. La potencia del láser máxima emitida por el objetivo no debe ser superior a 10 mW para evitar el daño tisular inducido por láser.
4. Adquirir una pila bajo aumento (500 m x 500 m, 512 x 512 píxeles; 2 micras paso) a la de zoom numérico 0.7X para crear un mapa en 3D para la relocalización precisa del retorno de la inversiónen puntos de tiempo posteriores.
5. Adquirir un mosaico de 4 imágenes de alta amplificación digital con un zoom de 2X numérica (200 m x 200 m, 512 x 512 píxeles; 1 micra paso). Usando el software de imágenes mover la ventana en 200 micras pasos para capturar todas las regiones. Profundidad de pilas es típicamente 250 m, a partir de la superficie pial en cada imagen del mosaico.
6. Antes de retirar el ratón del microscopio, tomar una foto o hacer un mapa 2D dibujado a mano de la vasculatura pial para la futura relocalización del campo de la imagen.

4. Recuperación y reconstrucción de imagen

1. Retire el dispositivo de la cabeza de montaje aplicando tracción mientras sostiene el cráneo debajo. Si el pegamento permanece unida al cráneo o de la piel, raspar cuidadosamente con unas pinzas finas. Suturar el cuero cabelludo y colocar el ratón en una jaula calienta a seguimiento de la recuperación de la anestesia antes de devolverlo a la jaula de alojamiento. Aplicar crema antibiótica tópica a la sutura e inyectar ketoprofeno (/ kg 2,5 mg) IP los siguientes 2 días.
2. Repita los pasos 1,1 a 2,5 para las sesiones de formación de imágenes repetidas. Si es necesario, afeitar el hueso con una cuchilla microquirúrgica para asegurar una calidad óptima de la imagen.
   NOTA: adelgazamiento adicional con el taladro dental puede ser necesaria cuando el intervalo entre las sesiones de formación de imágenes es más de un mes.
3. Coloque el ratón debajo del microscopio de epifluorescencia usando luz de acuerdo con el mapa en 2D de la vasculatura pial tomada de la sesión anterior (paso 3.6).
4. Iniciar el escaneo láser de dos fotones y ajustar platina del microscopio para lograr la alineación en la escala del micrómetro usando el mapa 3D obtenida en el paso 3.4. Proceder a la imagen detallada como se describe en el paso 3.5.

5. posteriores a la adquisición de tres dimensiones-Reconstrucción y Análisis de Imágenes

1. Obtener reconstrucciones tridimensionales de la vasculatura y las deposiciones de amiloide utilizando el software de análisis de imágenes 3D como Imaris (versión 8.0 y utiliza 7.7.2).
2. Utilizar el plugin de capa Normalizar en el menú de procesamiento de imágenes y el submenú cambiar el contraste para obtener el contraste ideal de los dos canales en toda la profundidad de la pila de imágenes.
3. Abrir las imágenes de la misma región en todos los puntos de forma simultánea y siempre les procesar en paralelo con el fin de comparar los diferentes puntos de tiempo.
4. vasos traza utilizando el módulo de trazador de filamento.
   1. Haga clic en el icono de filamentos para crear un nuevo filamento, omita el trazador automático y elegir el método de auto-ruta.
   2. Asegúrese de que el canal seleccionado se corresponde con la imagen vascular y el uso de la función de selección del puntero, haga clic en una bifurcación buque que se conserva a través de las sesiones de formación de imágenes, mientras que la celebración de las teclas shift + control para determinar un punto de partida. Utilice la función de selección del puntero y haga clic mientras mantiene pulsada la tecla de mayúsculas para seleccionar los puntos extremos de los filamentos.
      NOTA: La comparación de la obteesqueletos nidas mostrarán los cambios estructurales de la vasculatura.
5. Realizar plano por análisis de avión para realizar un seguimiento de nuevas placas. Aplicar módulo de superficie para el canal azul para el seguimiento del crecimiento de las placas de Aß. Haga clic en el icono de la superficie para crear una nueva superficie y proceder a la creación de superficies automatizado. Utilice el método de umbral para establecer y restar la señal de fondo. El menú de estadísticas proporciona datos respecto a la superficie de los depósitos de amiloide individuales.

Resultados

Este protocolo describe un método para la visualización de la vasculatura cerebral y los depósitos de amiloide horas extras. Se inyectaron tintes fluorescentes para etiquetar las deposiciones de amiloide (metoxi-xO4) ¹¹ y para llenar el lumen cerebrovasculares (FITC-dextrano) ^1. módulos de software de análisis de imágenes 3D se utilizan para crear imágenes en 3D de un campo constante de vista capturado en los puntos de tiempo consecutivos. Imágenes represent...

Discusión

La técnica y el cráneo abierto para microscopía in vivo de dos fotones ofrece la ventaja de las sesiones de formación de imágenes ilimitadas de grandes campos de imagen ^13,14. Sin embargo, esta técnica también produce inflamación en la región de interés ^14, a menudo incompatibles o impactar neuro-vascular ¹⁵ salidas lectura. Por el contrario, la técnica de cráneo transcraneal adelgazada no resulta en neuro-inflamación, lo que permite de imagen fiable de las estructu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
methoxy-X04	tocris	4920	use 10 mg/kg
FITC-Dextran 70 Kda	sigma	46945	use 100 mg/kg
gelfoam/Bloxang	Bausch and Lomb
micorsurgical blade	surgistar	6900	must be sharp and not dented
povidone-iodine	betadine		antisceptic solution
binocular stereomicroscope	olympus	SX10	optimal image contrast is crucial for this procedure
2-photon microscope	zeiss		Zeiss LSM 710mp
fine scissors-toughcut	Fine science tools	14058-09	this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue