الوسيطة اللحمية خلية الثقافة و التوصيل في حالة ذاتي: مقاربة ذكية لتطبيقات العظام

Summary

زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية الإنسان (hMSCs) مع مصل ذاتي، ويقلل من مخاطر رفض المواد xenogeneic والآثار السلبية الأخرى. كما يسمح لاسترداد مجموعة فرعية من الأسلاف أرومية متوسطة، الذي يمكن أن يحقق hMSCs جديدة. تضمين hMSCs في تجلط الليفين ذاتي يتيح سهولة التعامل وغرس الجراحي الفعال.

Abstract

الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية الإنسان (hMSCs) يتم تربيتها في المختبر مع وسائل الإعلام المختلفة. قيود على استخدامها في المرافق الصحية، ومع ذلك، تعتمد أساسا على مخاطر بيولوجية والتهاب محتملة من قبل العناصر الغذائية xenogeneic لثقافتهم المبذولة. المشتقات الإنسان أو مواد المؤتلفة هي المرشحين الخيار الأول للحد من هذه التفاعلات. لذلك، وملاحق والمواد من أصل ذاتي الثقافة تمثل أفضل المواد الغذائية والمنتجات الأكثر أمانا.

هنا، نحن تصف بروتوكول جديد للعزلة وثقافة hMSCs نخاع العظام في ظروف ذاتي - أي مصل المستمدة من المريض بمثابة تكملة لمستنبت والفيبرين بمثابة سقالة لإدارة hMSC. في الواقع، يمكن أن يكون hMSC بنيات / الفيبرين تجلط مفيد للغاية في العديد من التطبيقات السريرية. على وجه الخصوص، ونحن نركز على استخدامها في جراحة العظام، حيث جلطة الفيبرين المشتقة من الدم المتبرع نفسه سمحتتسليم خلية فعالة والمغذيات / النفايات التبادلات. لضمان شروط السلامة المثلى، فإنه من الأهمية بمكان لتجنب مخاطر hMSC التحول وفرط الأنسجة. لهذه الأسباب، فإن النهج الوارد وصفها في هذه الورقة يشير أيضا خارج الحي hMSC التوسع الحد الأدنى، للحد من الشيخوخة الخلوية والتغييرات الشكلية، وعلى المدى القصير أستيو تمايز قبل الزرع، للحث على مواصفات النسب المكونة للعظم، مما يخفض من خطر الإصابة اللاحقة غير المنضبط تكاثر.

Introduction

خلايا الإنسان الجذعية الوسيطة اللحمية (hMSCs) تمثل واحدة من أفضل مصادر الخلايا لاستخدامها في هندسة الأنسجة لتعزيز تكون العظم ^1،2. يتم عزل أنهم بسهولة من نخاع العظام والأنسجة الكبار الآخرين، والتعبير عن علامات سطح نموذجية مثل CD90، CD105، CD73 ^1. وعلاوة على ذلك، فإنها يمكن أن تفرق في عدة أنواع الخلايا، مثل بانيات، غضروفية والخلايا الشحمية ^3. وتعزى الآثار العلاجية لالتجدد وممتلكاتهم الغذائية ^(4). ويمكن استخدام hMSCs في جراحة العظام، وكذلك في التطبيقات السريرية التجدد أخرى. وقد تم الجمع بينها ويفضل مع السقالات، من أجل تحسين النتائج السريرية ^5.

بالمقارنة مع غيرها من المواد، ويظهر هلام الليفين العقارات المميزة مثل الإلتصاق، ارتشاف ونقل فعالة من المواد المغذية، مما يجعلها مفيدة للغاية لمجموعة متنوعة من التطبيقات هندسة الأنسجة ^6،7.

معشوقة = "jove_content"> ويتمثل التحدي الرئيسي في ترجمة نهج هندسة الأنسجة في التطبيقات السريرية والحصول على سقالة بالكامل حيويا وBIOSAFE والمتوسطة ثقافة خالية من XENO أن يتجنب أي تأثير عدوى أو رد الفعل.

في أسلوبنا، هلام الليفين، والمستمدة من دم المريض نفسه، ومصل ذاتي، لفي المختبر hMSCs الثقافة، كانوا يعملون كحل علاجي ممكن في مجال جراحة العظام ^8.

لأغراض السريرية، وتدار hMSCs عادة عن طريق إجراءين رئيسيين: (ط) "خطوة واحدة" الإجراء (أي الحد الأدنى التلاعب)، الذي يسمح للزرع السيارات من نخاع العظم، إما كليا أو مركزة (أي الخلايا وحيدات النوى)، أثناء الجراحة. و (ثانيا) "خطوتين" الإجراء (أي تلاعب واسع)، والتي تقوم على التوسع المجراة سابقا من hMSCs لزيادة انتاجها قبل الزرع، ويتطلب Gمرافق النائب ^9. ومن المثير للاهتمام، زراعة الخلايا مع المصل الكبار البشري بدلا من مصل العجل البقري يسمح للانتعاش، جنبا إلى جنب مع hMSCs، من مجموعة فرعية من الخلايا (1-10٪ في الثقافات وحيدات النوى) تسمى خلايا أرومية متوسطة السلف (البلدان المتوسطية الشريكة)، قادرة على التمايز في المختبر إلى طازجة hMSCs ^10،11. وبالتالي، قد hMPCs تلعب دورا هاما في عملية التجدد بالمقارنة مع hMSCs وحدها ^12،13. وأخيرا، على المدى القصير أستيو الاستقراء يدفع hMSCs لبدء المفاضلة الخاصة بهم في النسب عظمي المنشأ دون أن تفقد التكاثري إمكاناتهم وقدرتها على البقاء ^12. هذه النتائج تؤكد الدراسات السابقة التي أبلغت المعززة في تكوين العظام المجراة من قبل hMSCs، تليها preculture في المتوسط عظمي المنشأ ^14. وعلاوة على ذلك، وهو تجلط البلازما ذاتي كما سقالة لتسليم خلية يمكن التلاعب بها بسهولة من قبل الجراح ومصبوب لتناسب شكل العظام تجويف ^13.

عشرerefore، يمكن أن يكون هذا الأسلوب مفيدا للغاية بالنسبة لأولئك الباحثين والأطباء الذين يهدفون إلى ترجمة علاجهم استنادا hMSC-من مقاعد البدلاء إلى السرير في تطبيقات العظام.

Protocol

وقد تم تطوير هذا البروتوكول وفقا للإعلان الرابطة الطبية العالمية هلسنكي بشأن السلوك الأخلاقي للإنسان الأبحاث التي تجرى. تم الموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية لAZIENDA Ospedaliero-يونيفرسيتاريا مركز مدينة بيزا.

ملاحظة:
تم الحصول على نخاع العظام من المرضى الذين يخضعون الروتينية مجموع جراحة استبدال مفصل الورك (وفقا إلى الخطوة 1.1) ^15؛ تم الحصول على البلازما لإعداد جلطة من الدم المحيطي ذاتي ^13؛ مصل ذاتي، بمثابة تكملة لمستنبت، تم جمعها من ذاتي فصادة كامل الدم. وتلقى جميع المرضى معلومات مفصلة حول الإجراء ووقع على استمارة الموافقة الخطية.

1. جمع عينة نخاع العظم

1. جمع نخاع العظم من القناة النخاعية الفخذ بعد ما مجموعه جراحة استبدال مفصل الورك (لالبحوث والدراسات). لفترة وجيزة، أثناء إعداد العمليات الجراحية في القناة النخاعية إلى h[أوس] الساق الاصطناعية، وجمع الدم نخاع التي تفيض (حوالي 10 - 15 مل، اعتمادا على حجم بدلة) ^15.
   أو
2. جمع نخاع العظام نضح من العرف الحرقفي تحت التخدير الموضعي، وبعد الإجراء القياسي الدموية حول 20-30 د مقدما (للتطبيقات السريرية) ^16.
   ملاحظة: في كلتا الحالتين heparinized المحاقن (لمنع تشكيل جلطة) يجب أن تستخدم لتحقيق الانتعاش نخاع العظام.

2. إعداد ذاتي البلازما

1. جمع 20 مل من الدم المحيطي من المريض في أنابيب جمع الدم فراغ تحتوي على K3 EDTA (5.4 ملغ في 3 مل أنابيب) وأجهزة الطرد المركزي في 2400 × ز لمدة 15 دقيقة.
2. نضح المكون البلازما في أنبوب 15 مل وتجميد في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. إعداد ذاتي المصل

1. نقل وحدة بلازما في كيس النقل باستخدام مسمار. قطع الحقيبة يشغلها اللحام وweigح الحقيبة لحساب حجم البلازما (الشكل 1A).
2. تخثر البلازما الذاتي عن طريق حقن غلوكونات الكالسيوم 100 ملغ / مل في 10٪ ث / ت من خلال موصل منفذ (الشكل 1B). بعد خلط كيس، وضعه في 4 درجات CO / N دون أن تهتز لتسهيل تشكيل الجلطة.
3. الطرد المركزي حقيبة في 4900 × ز لمدة 15 دقيقة في RT. خذ دلو الطرد المركزي من أجهزة الطرد المركزي وإزالة كيس بعناية (اتبع إرشادات الشركة المصنعة لإعداد المحللة الصفائح الدموية) (الشكل 1C).
4. عزل تجلط فقط فوق المشبك لتسهيل الترشيح. توصيل عدة الترشيح لحقيبة النقل باستخدام مسمار وضعت في منفذ منفذ لعدة الترشيح.
5. شنق كيس وفتح المشبك الأزرق للسماح تدفق الدم عن طريق الجاذبية. لا ممارسة الضغط على فلتر لتجنب نقل الليفين في الكيس. بعد الترشيح، وختم الأنبوب وإزالة كيس (اتبع انتاجالمبادئ التوجيهية turer لإعداد المحللة الصفائح الدموية).
6. ربط خط مخصص لحقيبة ونقل النهائي المصل إلى 50 مل أنابيب تحت مقعد تدفق الصفحي لتجنب التلوث الميكروبي.
7. أخذ عينة مع حقنة لاختبار غياب الفيزيولوجية، وإجراء اختبار العقم للثقافات البكتيرية الهوائية واللاهوائية ^17. تسمية أنابيب مناسب وتجميدها في - 20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4. إعداد متوسطة التوسع

1. إعداد 500 مل من المتوسط ​​الانتشار الكامل. لDulbecco لتعديل النسر متوسطة - منخفضة الجلوكوز (DMEM-LG)، إضافة المصل 10٪ ذاتي (تم الحصول عليها كما هو موضح في القسم 3)، الجلوتامين 2 مم، حل المضادات الحيوية 1٪ ومحلول مضاد فطري 1٪. معقم التصفية المتوسطة الانتشار الكامل.

5. عزل hMSCs من ونخاع العظم و

1. نقل عينة نخاع العظم (5-10 مل) من الحقنة إلى 50 مل المخروطية توأن تكون وتمييع مع ملحي معقم (نسبة 1: 4). دوامة أنبوب 50 مل لمدة 30 ثانية إلى تفصيل مجموعات الخلايا.
2. تدفئة التدرج الكثافة (كثافة 1.077 غرام / لتر، وانظر جدول المواد) إلى RT قبل الاستخدام وطبقة نخاع العظام المخفف بلطف (لمنع خلط كل من طبقات) على درجة الكثافة وذلك بإضافة 20 مل من العينة إلى 15 مل من كثافة التدرج لكل 50 مل أنبوب (الشكل 2A).
3. أجهزة الطرد المركزي في 400 × ز دون الفرامل عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم جمع الكسر وحيدات النوى في واجهة السائل السائل ونقله إلى الجديد 50 مل أنبوب باستخدام معقمة 5 مل ماصة.
4. غسل جزء وحيدات النوى التي تم جمعها مرتين مع متوسط ​​الانتشار الكامل وأنابيب الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقيقة عند 25 درجة مئوية للحصول على الكريات الخلية.
5. تجاهل طاف و resuspend بلطف كل بيليه خلية في 5 مل من المتوسط ​​الانتشار الكامل. تمييع في نسبة 1: 100 لعد الخلايا.
6. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات بعد التخفيف 1: 1 مع تلطيخ التريبان الأزرق لتقييم سلامة الخلية.

6. ثقافة hMSCs في وجود ذاتي المصل

1. ملء اثنين أو أكثر من 75 سم ² نسيج الثقافة (TC) قوارير مع 15 مل من المتوسط الانتشار الكامل الطازجة ونقلها إلى حاضنة الثقافة خلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ حتى الاستخدام.
2. البذور 0.3   - 0.5 × 10 ⁶ خلية / سم ² (37.5 × 10 ⁶ خلايا / 15 مل من المتوسط الانتشار الكامل الطازج)، واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 48 ساعة.
3. في الوقت نفسه، وبذور 1 × 10 ⁶ خلايا في 25 سم قارورة ² TC مع 5 مل من المتوسط انتشار كامل جديد لوحدة تشكيل مستعمرة - الخلايا الليفية (كفو-F) فحص. الثقافة لمدة 2 أسابيع (على أن يستمر في المادة 12).
4. تجاهل المتوسطة وغسل بلطف قوارير من الخطوة 6.2 مع متوسط ​​انتشار كامل لعينياوفه خلايا غير ملتصق والحطام. إضافة متوسطة جديدة للقوارير واستبدال نصفها مرتين في الأسبوع، حتى 70-80٪ confluency (ثقافة الأولية، مرور 0 (P0)) (الشكل 2B).
5. استرداد الخلايا باستخدام حيوان المؤتلف البروتيني مجانا محدد (انظر جدول المواد، واستخدام 3 مل من محلول في قارورة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة)، واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 10 دقيقة. إضافة 6 مل من المتوسط ​​الانتشار الكامل في قارورة وجمع في واحدة أنبوب 50 مل. كرر الخطوة 5.6.
   ملاحظة: هام: استخدام هذا الأنزيم البروتيني بدلا من التربسين تسمح استعادة بعض خلايا أرومية متوسطة أسلاف (البلدان المتوسطية الشريكة) موجودة في الثقافة، التي التربسين مقاومة.
6. لمزيد من التوسع، replate تعليق الخلية في 2000 - 3000 خلية / سم ² في الجديد 75 سم ² TC قوارير (P1) (الشكل 2C).
7. استخدام aliquots من الخلايا لتقييم إمكانات التفريق بين اللجان الدائمةنحو المكونة للعظم، مكون الشحم والأنساب المولدة للغضروف. أداء المقايسات التمايز بناء على توصيات الشركة المصنعة (الشكل 2D).
   ملاحظة: مختلفة أساليب تلطيخ يمكن استخدامها لتقييم التمايز multilineage.

7. إعداد والمتوسطة المكونة للعظم مع ملاحق الدوائية

1. تخفيف محلول حمض الاسكوربيك (الحل 1A: حمض الاسكوربيك 200 ملغ / مل (انظر جدول المواد) 01:10 مع DMEM-LG، للحصول على / مل حل 20 ملغ (الحل 1B، حل العمل) قسامات المالية من حلول 1A و 1B في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. و resuspend 1 غرام الهيدروكورتيزون في 10 مل من الماء المعقم (الحل 2A: الهيدروكورتيزون 100 ملغ / مل (انظر الجدول المواد) تمييع الحل 2A في 1: 1000 مع DMEM-LG للحصول على حل / مل 100 ميكروغرام (الحل 2B، والعمل الحل). قسامات المالية من حلول 2A و 2B في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. على استخدام صrepare المتوسطة مولدة للعظم جديد كما يلي: إضافة DMEM-LG مع مصل ذاتي 10٪ و 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك و 0.4 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون. معقم مرشح المتوسط ​​عظمي المنشأ.

8. عظمية قبل الاستقراء واسترداد hMSCs

1. تماما إزالة المتوسطة الانتشار وإضافة المكونة للعظم المتوسطة 96 ساعة قبل الحصاد خلية (أي 80 - وصلت 90٪ التقاء عادة في 7 د). توفير تغيير المتوسطة عظمي المنشأ إضافي 24 ساعة قبل الحصاد الخلية.
2. فصل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 6.5 و resuspend بلطف بيليه بإضافة 2 مل من المتوسط ​​الانتشار الكامل في أنبوب 50 مل.
   ربما يتم تخفيض بقاء الخلية (حوالي 10٪) نتيجة لosteoinduction: ملاحظة. المجاميع الخلوية يمكن ملاحظتها.
3. بعد الفرز، وغسل الخلايا مع كامل المتوسطة انتشار الأسلحة النووية وأجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق. resuspend الكرية بلطف في 1-2 × 10 ⁶ خلايا قابلة للحياة / 2مل من البلازما الذاتي (انظر القسم 2) في أنبوب 50 مل.

9. إعداد hMSC / الفيبرين الجلطة التركيبات

1. إضافة 150 ميكرولتر من غلوكونات الكالسيوم في 100 ملغ / مل لكل أنبوب 50 مل تم الحصول عليها من الخطوة 8.3. وresuspend الخلايا تحت الهز لطيف.
2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ ل15-30 دقيقة للحصول على hMSC / الليفين يبني تجلط (الشكل 3A). إعداد تجلط الليفين بناء دون الخلايا لاستخدامها كعنصر تحكم.
   ملاحظة: هام: من المفضل أن إعداد هذه السيطرة تجلط 2 ساعة على الأقل قبل الفحص بقاء الخلية، حيث يستغرق 30 دقيقة أو أكثر لتشعبي.

10. خلية الجدوى الفحص

1. إزالة السائل من 50 مل أنابيب وإضافة 1 مل من المتوسط انتشار كامل تحتوي على 10٪ ت / ت خلية الجدوى كاشف (AB، انظر الجدول المواد)، وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة.
2. احتضان عشرأنابيب البريد عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 3 ساعات. قياس الامتصاصية في 570 نانومتر مع الطول الموجي إشارة من 600 نانومتر (AB في وقت 0؛ T0).
3. تجاهل طاف وإضافة 2 مل من المتوسط ​​الانتشار الكامل الطازج. احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ O / N. في اليوم التالي (AB في وقت 24 ساعة، T24)، كرر الخطوات من 10،1-10،3 (الشكل 3B).

11. نسيجية تقييم سلامة الخلية وترسب الكالسيوم داخل تجلط الليفين التركيبات

1. إصلاح / الليفين يبني تجلط hMSC في 4٪ ث / ت محايد يا مخزنة الفورمالين / N عند 4 درجات مئوية. غسل 4X في مد برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة وتخزينها في 70٪ من الإيثانول.
2. يذوى العينات عند 40 درجة مئوية في سلسلة من الإيثانول متدرج: 80٪ مرة واحدة لمدة 30 دقيقة، و 95٪ مرتين لمدة 45 دقيقة و3X 100٪ لمدة 1 ساعة. توضيح مرتين في الزيلين لمدة 45 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
3. شطف عينات في البارافين السائل عند 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة وتضمينها. خفض كتلة البارافين مع مشراح وجبل رانه أقسام (5 ميكرون) على الشرائح الزجاجية.
4. وصمة عار على أقسام deparaffinized باستخدام معيار الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) طريقة (الشكل 3C).
5. أداء فون كوسا تلطيخ عن طريق التعامل مع المقاطع مع نترات الفضة 1٪ لمدة 15 دقيقة، و 0.5٪ بيروغالول لمدة 2 دقيقة، و 5٪ وحمض الصوديوم لمدة 2 دقيقة. مباين الأقسام بنسبة 0.1٪ أحمر سريع النووي المخفف في محلول يحتوي على 5 غرام من كبريتات الألومنيوم لمدة 5 دقائق ويشطف لهم في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق. جبل الأقسام مع وكيل المتزايدة.
6. تقييم ترسب المعادن على شكل حبيبات سوداء تحت ضوء المجهر (400X التكبير) (الشكل 3D).

12. كفو-F الفحص

1. غسل القارورة 25 سم ² (من الخطوة 6.3) مع مد برنامج تلفزيوني. وصمة عار باستخدام أسلوب مايو جرونوالد / بالغيمزا القياسية. تحديد بصريا عدد hMSC بتسجيله المستعمرات الفردية (الشكل 4) تحت المجهر الضوئي.
   ملاحظة: إذا كانيتم أخذ النخاع العظمي كما في الخطوة 1.2. والأقسام 2-9 يتم تنفيذها في ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) مع موافقة الجهات التنظيمية اللازمة، وhMSC / الليفين يبني جلطة يمكن زرعها لتطبيقات العظام.

النتائج

إعداد مصل ذاتي

البلازما تجلط الدم، التي يؤديها مضيفا غلوكونات الكالسيوم لحقيبة النقل، يسمح للانتعاش من مصل ذاتي بكميات كبيرة، كما هو مطلوب للثقافة hMSC. في الواقع، مع هذه التقنية، فمن الممكن لتحقيق ما يصل إلى 200 مل من مصل الدم (الشكل 1).

HMSC العزلة والثقافة والتمايز باستخدام مصل ذاتي

يتم عزل العظم خلايا نخاع وحيدات النوى باستخدام التدرج الكثافة، والذي يؤدي إلى طبقة حلقة وسيطة (الشكل 2A). بواسطة طلاء هذه الخلايا وإزالة تلك غير ملتصق مع الغسيل، فمن الممكن لعزل hMSCs (الشكل 2B). في ظل ظروف ثقافة ذاتي، تم الكشف عن مجموعة فرعية من الخلايا، ودعا البلدان المتوسطية الشريكة، في P0 وبنسب تصل ر س 10٪، حسب تقلب المريض (الشكل 2B). البلدان المتوسطية الشريكة لا تزال موجودة بعد replating (أي P1) إذا تم استخدام البروتيني للخلية الركض (الشكل 2C). hMSCs معزولة ومثقف في جو ذاتي الحفاظ على قدرتها على تمييز تجاه الأنساب أرومية متوسطة معروفة ثلاثة (المكونة للعظم، مكون الشحم، ومكون للغضروف). وأجريت فحوصات التمايز مقارنة هوية السكان hMSC مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام معيار (nonautologous) الظروف والثقافة. كما تم اختيار وظيفة المقايسات لهذا البروتوكول، فون كوسا تلطيخ، الأوسيميوم رباعي أكسيد تلطيخ، وتلطيخ الألسيان الأزرق في درجة الحموضة 1 بدلا من تلك المقترحة من قبل الشركة المصنعة وسائل الإعلام التمايز (انظر الجدول المواد) (الشكل 2D).

إعداد، والسلامة وتوصيف نسيجية من MSC / الليفين يبني تجلط

together.within الصفحات = "1"> وفرقت hMSCs في البلازما، وهو عبر ربط بواسطة غلوكونات الكالسيوم في أنبوب 50 مل، مما يؤدي إلى تشكيل القرص هلام محاطة طاف بها (الشكل 3A). داخل هذه الجلطات البلازما، وhMSCs قابلة للبقاء، كما يدل على ذلك تغيير لون الصبغة T24 بقاء الخلية من الزرقاء (السيطرة من دون الخلايا) إلى الوردي (جلطة cellularized) (الشكل 3B). ويؤكد بقاء الخلية داخل الجلطة عن طريق تلطيخ H & E، مما يدل على خلية التشكل الحفاظ عليها جيدا (الشكل 3C). علاوة على ذلك، osteoinduction الحد الأدنى فقط قبل موسم الحصاد خلية الثاني يثير ترسب الكالسيوم الأولي التي كتبها hMSCs حفز (الشكل 3D).

وحدة تشكيل مستعمرة

ويظهر وجود المستعمرات hMSC بعد 2 أسابيع في الثقافة عن طريق فحص كفو-F (الشكل 4).

الصورة = "jove_step" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> تطبيق MSC / تجلط الليفين بناء في غير الاتحاد العظام

طبقت يبني HMSC / الفيبرين الجلطة التي تم الحصول عليها كما هو موضح في هذه الطريقة (الخطوة 1.1) بنجاح لعلاج شديدة nonunions الطرف العلوي في 8 حالات إنسانية ^(13). على المدى الطويل (بحد أقصى 7.6 أشهر) تقييم أكدت النتائج السريرية وظيفية ناجحة لجميع المرضى، دون وجود أدلة من فرط الأنسجة أو تشكيل الورم.

الشكل 1. إعداد ذاتي المصل.
ونقلت (A) وحدة بلازما في كيس النقل باستخدام مسمار. (ب) ومتخثر البلازما عن طريق حقن غلوكونات الكالسيوم من خلال موصل منفذ. يستخدم (ج) وأجهزة الطرد المركزي الدم حقيبة لفصل المصل./files/ftp_upload/54845/54845fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. hMSC العزلة والثقافة والتمايز باستخدام ذاتي المصل.
(A) وطبقة الخلايا وحيدة النواة (في إطار الخط الأزرق) تم الحصول عليها بعد نخاع العظام الطرد المركزي مع التدرج الكثافة. (ب) زراعة الخلايا كما يظهر في P1. (ج) خلية ثقافة كما يظهر في P0 (ثقافة الأولية)؛ (B - C) السهام تبين وجود البلدان المتوسطية الشريكة في الثقافة MSC. شريط المقياس هو 100 ميكرون. (D) عن نتائج هستوكيميائيه من المقايسات التمايز multilineage. يظهر التمايز المكونة للعظم وتقييمها باستخدام فون كوسا تلطيخ لترسب مصفوفة المعدنية في الأسود، والتمايز مكون الشحم التي كتبها جود فجوات الدهنية، ملطخة باللون الأسود من قبل tetroxi الأوسيميوميتم عرض دي، والتمايز المولدة للغضروف من خلال وجود الجليكوسامينوجليكان مكبرت، التي هي ملطخة في السماوي من تلطيخ الأزرق الألسيان في درجة الحموضة 1. مقياس شريط 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. إعداد والجدوى ونسيجية توصيف MSC / الفيبرين الجلطة التركيبات.
(أ) hMSC / تجلط الليفين بناء كما يبدو بعد عبر ربط. (ب) نتائج AB الفحص: في اللجان الدائمة قابلة للحياة داخل جلطة الفيبرين، كما يدل على ذلك تغيير لون الصبغة بقاء الخلية (T24)، من الأزرق (السيطرة من دون الخلايا، على اليمين) إلى الوردي (جلطة cellularized، على اليسار). (C - D) النتائج هستوكيميائيه من hMSC / الليفين يبني تجلط. شريط المقياس هو 50 ميكرون. (C) الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ تظهر خلايا قابلة للحياة جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الفيبرين. (D) المصفوفة المعدنية ترسب ملطخة باللون الأسود بواسطة فون كوسا تلطيخ، مما يؤكد على تكون العظم الأولي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4. كفو-F الفحص.
صورة لقارورة مثقف مع hMSCs الملون بطريقة مايو جرونوالد / بالغيمزا. منطقة التكبير في على بعد مجهرية ضوئية تبين مورفولوجية مستعمرة hMSC. شريط المقياس هو 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

= "1">
الشكل 5. تطبيق hMSC / الفيبرين الجلطة بناء في العظام غير النقابيين.
(أ) الأشعة السينية من الطرف العلوي للمريض يتأثر المفصل الموهم. (ب) hMSC / تجلط الليفين بناء قبل الزرع. (ج) تطبيق الجراحي للتجلط بناء hMSC / الفيبرين. (D) الأشعة السينية من الطرف العلوي من نفس المريض بعد 5 سنوات. ونشر هذا الرقم من Giannotti S. وآخرون. مع الحد الأدنى من التعديلات ^13. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الخطوات الحاسمة من هذا القلق البروتوكول استخدام مصل الكبار البشري والبروتيني، والتي تسمح للحصول على BIOSAFE hMSC العلاج. على وجه الخصوص، ومصل الكبار البشري يمكن العزلة والصيانة، في حين البروتيني يضمن الحصاد، من البلدان المتوسطية الشريكة. هذه هي خلايا غير ناضجة الموجودة في نخاع العظام التي يمكن أن تؤدي إلى hMSCs جديدة، وبالتالي ضمان خزان hMSCs قابلة للحياة على طول الوقت ثقافة. ليست كل البلدان المتوسطية الشريكة التي يمكن جمعها، لأن زيادة فترة التعرض لنشاط الأنزيم البروتيني غير ضارة لبقاء hMSC. لهذا السبب، تم اختيار البروتيني حضانة 10 دقيقة كما سطا الأمثل بين الانتعاش من البلدان المتوسطية الشريكة وصلاحية hMSCs. خطوة حاسمة أخرى هي المرة osteodifferentiation. في الواقع، فإن وجود واسعة النطاق في osteodifferentiation المختبر لحد كبير بقاء الخلية، مما يؤثر على تكوين العظام النهائي في الجسم الحي. الخطوة الأخيرة الفاصلة تتمثل في النفع من سقالة bioresorbable ذاتي، حركتييتم الحصول على ساعة عن طريق دمج الخلايا (hMSCs والبلدان المتوسطية الشريكة) في جل الليفين من تخثر البلازما.

خطوة رئيسية لتعزيز العائد من البلدان المتوسطية الشريكة هي البذور خلايا وحيدة النواة في التركيز العالي. باستخدام إجراءات فصل مكونات الدم للحصول على البلازما والتعامل معها مع غلوكونات الكالسيوم يجعل من الممكن لتحقيق مصل ذاتي في كميات كبيرة. وقد لوحظ أن المصل البشري كمكمل المتوسط ​​يماثل الجنين مصل بقري (FBS) في الثقافات hMSC. ومع ذلك، في تجربتنا، والمتوسطة كاملة تستكمل مع FBS يساهم في الشيخوخة أسرع من مصل الكبار البشري. خطوة هامة هي أن المتمثلة في إدارة osteoinduction الحد الأدنى لhMSCs. في الواقع، وهذا العلاج يؤدي الخلايا التفريق بسهولة نحو النسب عظمي المنشأ، وبالتالي كونها مفيدة لتجنب المزيد من تحول الخلايا في الجسم الحي. للحفاظ على استمرارية جيدة من hMSCs osteoinduced الحد الأدنى، فمن المستحسن أن تتبع بدقة توصيات موضح في الخطوات 6.5. لد 8.2، بما في ذلك التعامل، الطرد المركزي وكميات متوسطة إلى أن تضاف. إذا كان الإجراء فصادة غير متوفر، فإنه لا يزال من الممكن تنفيذ هذا البروتوكول عن طريق أداء الدم عدة مرات توجه للمريض، أو في البديل، من خلال شراء المجمعة AB الأمصال. من الواضح، من أجل تحقيق هذا البروتوكول من السرير مقاعد البدلاء ل، وهو إلزامي لدينا مصانع خلية برنامج الرصد العالمي، أو ما يعادلها، والمتاحة.

قيود على تطبيق هذه التقنية القلق فقر الدم، أمراض الدم، الأورام ومرضى العظام المتضررة من التهاب العظم والنقي.، رسم كميات كبيرة من الدم من مرضى فقر الدم، وينبغي تجنبها. في المرضى الذين يعانون الأورام، ونوعية العينات خلية تتأثر العلاج الكيماوي، بينما في المرضى الذين يعانون التهاب العظم والنقي العدوى يمكن أن تؤثر على النتيجة النهائية. في جميع الحالات التي يكون فيها المصل ذاتي غير كاف أو غير مناسب، ذكر المجمعة AB الأمصال تمثل بديلا جيدا.

باستخدام خلية / الفيبرين اومهر يبني لالتطبيقات السريرية المحتملة هي حاسمة للافراج عن العلاج بالخلايا ذاتي تماما، والتي يمكن أن يكون من السهل التعامل معها والعفن أثناء الجراحة، مما أدى إلى نتائج ممتازة لعلاج العظام غير ^{النقابات-13.} لأغراض السريرية، وعادة ما تدار hMSCs عبر إجراءين رئيسيين: الحد الأدنى من التلاعب والتلاعب واسعة النطاق ^9. للتغلب على المشاكل المتعلقة ثقافة واسعة خارج الجسم، مثل تشوهات في شكل الخلية وحجم ^18، أجرينا وقت قصير فيفو السابقين توسيع الخلايا وأستيو تمايز (4 د فقط).

بروتوكول خالية من XENO صفها في هذه الورقة، جنبا إلى جنب مع توسيع الخلية وosteodifferentiation أوقات قصيرة، أثبتت أن تكون ذات صلة في العيادات من أجل الحصول على إنتاج العظام سريع في الجسم الحي، دون وجود أدلة من فرط الأنسجة والتحول، مما يؤكد فعالية ومنذ فترة طويلة سلامة الاجل في إصلاح العظام (الشكل 5) ^13.

وتهدف هذه المنهجية الواردة في هذا التقرير في مما يدل على فعالية وسلامة hMSC في توسيع المختبر في ظروف ذاتي لاستخدامها المحتمل في جراحة العظام. يستخدم هذا البروتوكول hMSCs معزولة عن نخاع العظام والمثقف في المتوسط ​​تستكمل مع مصل ذاتي وجزءا لا يتجزأ من جلطة الفيبرين ذاتي، وبالتالي ضمان العلاج بالخلايا ذاتي تماما. تحريض عظمي المنشأ شقين، قبل مفرزة الثانية، ويحسن hMSC القدرة على التمايز إلى خلايا بناء العظم. ونتيجة لذلك، فإن هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة للتطبيقات في عيوب العظام، لأنه لا يقتصر على المفصل الموهم. يمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية المحتملة الكيس الكاحل وإدارة فقدان العظام.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triple Select (1x)	GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES	12563-029	cell culture
Trypan blue stain	GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES	15250061	cell culture
DMEM-LG, no glutamine, no phenol red	GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES	11880-028	cell culture
Glutamax (100x)	Gibco, Life Technologies	35050038	cell culture
Penicillin/Streptomycin sol.	Gibco, Life Technologies	15140122	cell culture
Alamar Blue (AB)	Gibco, Life Technologies	DAL1025	proliferation/viability assay
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-14440-02	cell culture
D-PBS	Gibco, Life Technologies	14190-094	cell culture
StemMACS AdipoDiff Media	Miltenyi Biotech	130-091-677	cell culture
StemMACS ChondroDiff Media	Miltenyi Biotech	130-091-679	cell culture
hMSC Osteogenicdiff BulletKit	Euroclone	LOPT3002	cell culture
Vitamin C (ascorbic acid)	Bayer	ATC Code: A11GA01	Pharmaceutical grade drug
Flebocortid Richter (hydrocortisone)	Aventis Pharma	ATC Code: H02AB09	Pharmaceutical grade drug
Victor X3, reader	PerkinElmer	2030 multilabel reader	proliferation/viability assay
Silver nitrate	Sigma Aldrich	209139	histological assay
Pyrogallol	Sigma Aldrich	16040	histological assay
Sodium Thiosulphate	Sigma Aldrich	S8503	histological assay
Histoplast LP	Thermo Scientific	8332	histological assay
Methanol	Sigma Aldrich	32213	histological assay
Ethanol	Sigma Aldrich	2860	histological assay
Nuclear fast red	Sigma Aldrich	60700	histological assay
Formalin	Bio-optica	05-K01009-X40	histological assay
Eosin B	Sigma Aldrich	45260	histological assay
DPX	Sigma Aldrich	6522	histological assay
Haematoxylin	Sigma Aldrich	H3136	histological assay
Aluminium Sulphate	Sigma Aldrich	202614	histological assay
Xylol	Sigma Aldrich	534056	histological assay
Microtome	Leika		histological assay
May Grunwald	Sigma Aldrich	MG1L-1L	histological assay
Giemsa	Sigma Aldrich	32884-250ML	histological assay
Transfer bag	Biomérieux	BC0300031	cell culture
Filtration kit	Macopharma	BC0800010	cell culture
Calcium Gluconate	Galenica Senese		Pharmaceutical grade drug
Bact Alert	Biomérieux	259790 anaerobic	microbiological assay
Bact Alert	Biomérieux	259789 aerobic	microbiological assay
Steryle Luer-Lok Syringe 50 mL	BD Plastipak	300865	cell processing
Heraeus Cryofuge 6000i	Thermo Scientific		blood bag centrifuging
SL16R Centrifuge	Thermo Scientific		blood tube centrifuging