JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن هنا وصف وضعت حديثا فيروس التهاب الكبد B (HBV) نظام مراسل لمراقبة مراحل مبكرة من دورة حياة الالتهاب الكبدي الوبائي. وهذا مبسطة في نظام المختبر مساعدة في فحص وكلاء مكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي باستخدام استراتيجية عالية الإنتاجية.

Abstract

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Introduction

عدوى مزمنة بفيروس التهاب الكبد B (HBV) هو عامل خطر رئيسي لأمراض الكبد المزمنة 1. وعلى الرغم من الاستراتيجيات العلاجية الحالية القائمة على النظير النوكليوتيدات التي تمنع الالتهاب الكبدي الوبائي وظيفة بول و / أو إدارة من النوع الأول الإنترفيرون الذي ينشط الاستجابات المناعية عند الأفراد المصابين وكذلك قمع غير مباشرة انتشار الالتهاب الكبدي الوبائي من خلال حفز الانترفيرون وظائف الجينات 2، ويمكن لهذه العلاجات لا يلغي الالتهاب الكبدي الوبائي الحمض النووي تماما 3. وعلاوة على ذلك، فإن ظهور HBVs التي تقاوم عوامل مضادة للبول هو من القلق 4. وقد أظهرت إدارة جنبا إلى جنب العوامل المضادة للفيروسات التي تستهدف بشكل مباشر على الخطوات المختلفة لفيروس نقص المناعة البشري (HIV) أو التهاب الكبد الوبائي (سي) دورة الحياة لقمع بنجاح أو القضاء على فيروس (الخانات). مشابهة لهذه الفكرة، ووضع مكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي وكيل (ق) التي تعمل مباشرة على مراحل مختلفة من Hدورة الحياة BV مهمة لتأسيس العلاجات الالتهاب الكبدي الوبائي في المستقبل.

بشكل عام، وإنشاء بسيط في نظام الثقافة المختبر من الفيروس هدف يسهل تطوير عوامل مضادة للفيروس. ومع ذلك، هناك اثنين على الاقل من الحواجز التي تحول دون تطوير نظم الاستزراع في المختبر لفحص عوامل مضادة للالتهاب الكبد البائي. الأول هو عدم وجود نظام في المختبر زراعة الخلايا مناسب لفيروس التهاب الكبد B عدوى / انتشار الأسلحة النووية. على عكس غيره من الفيروسات، مثل فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد الوبائي، والتي تم نشرها في خطوط الخلايا المعمول بها، فإنه من الصعب زراعة الالتهاب الكبدي الوبائي في المختبر بسبب القيود التجريبية بما في ذلك مجموعة المضيف ضيق. استخدام نظم محددة ثقافة الخلية مثل خط خلية الكبدي البشري HepaRG، الذي هو عرضة للعدوى الالتهاب الكبدي الوبائي، 5، 6، وقد وضعت 7 إلى التغلب على هذه المشاكل. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا PXB، معزولة عن يوروكيناز-تايالمؤسسة العامة المنشط plasminogen المعدلة وراثيا / الفئران SCID تلقيح مع الكبدية الإنسان الأساسية (PHH) عرضت، لتكون عرضة للعدوى الالتهاب الكبدي الوبائي وتكرار 8. ومع ذلك، مستويات تكرار الالتهاب الكبدي الوبائي في HepaRG تعتمد على حالة التمايز الخلوي بعد والثقافة، والذي يمكن أن يسبب نتائج غير متناسقة وirreproducible من مستويات العدوى / تكرار الالتهاب الكبدي الوبائي. يستخدم PXB عادة للتجارب العدوى ولكن محدودة بسبب توافره. والالتهاب الكبدي الوبائي محرض خط خلية التعبير التتراسيكلين، HepAD38، كما تم استخدامها على نطاق واسع لدراسة تكرار الالتهاب الكبدي الوبائي، ولكن هذا النظام يسمح فقط تقييم بعد النسخ وليس في خطوة دخول العدوى 9. في الآونة الأخيرة، سمحت تحديد ببتيد الصوديوم توروكولات cotransporting (NTCP) بمثابة مستقبلات وظيفية لHBV تطوير نظام الثقافة HBV متغير 10. في الواقع، NTCP التعبير في خلايا سرطانة الكبد غير عرضة مثل Huh7 وHepG2 تمكن عدوى الالتهاب الكبدي الوبائي (10) وبالتالي، تم توسيع وتنويع اختياراتك في خطوط الخلايا عرضة HBV، وحل العديد من القيود التجريبية. المشكلة الثانية هي عدم وجود نظام فحص بسيط لتقييم العدوى والتكرار. وعادة ما يتم إجراء تقييم العدوى عن طريق تحليل HBV DNA و RNA والبروتينات. ومع ذلك، وتحديد حجم هذه العلامات الفيروس هو مضيعة للوقت، في كثير من الأحيان مكلفا وليس بسيطا دائما. لذلك، وتطوير نظام فحص بسيط، مثل استخدام الجينات المراسل، قد تغلب على المشاكل المرتبطة بنظم HBV فحص.

ومع ذلك، لأن حجم الجينوم التي يمكن تعبئتها إلى القفيصة HBV محدودة - أقل من 3.7 كيلو بايت 11 - حجم الجين مراسل يجب أن تكون قصيرة قدر الإمكان. وعلاوة على ذلك، فإن وجود عناصر رابطة الدول المستقلة المتعددة المنتشرة في جميع أنحاء الجينوم، التي تعتبر ضرورية لتكاثر الفيروس، يحد من الوظائف المتاحة لفي sertion من الجين مراسل في الجينوم. وقد حاول العديد من التقارير لادخال الجينات الغريبة، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية-1 تات والأخضر بروتين فلوري، وعن dsRed، في جينوم فيروس الالتهاب الكبدى ب 11 و 12 و 13. ومع ذلك، هذه HBVs المؤتلف ليست مفيدة لفحص الالتهاب الكبدي الوبائي عدوى / التكرار، أو لفحص عالية الإنتاجية من العوامل التي تؤثر عدوى الالتهاب الكبدي الوبائي / النسخ المتماثل. هذا هو السبب الرئيسي لانخفاض الإنتاجية من الفيروسات المؤتلف وانخفاض كثافة التعبير مراسل الجينات التي تسببها إنتاج فيروس فعالة.

للتغلب على هذه القضايا، فإننا شيدت HBV مراسل مع ارتفاع العائد من إنتاج فيروس. هذا الفيروس حساس للغاية لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل HBV، من الدخول إلى النسخ. ولتحقيق ذلك، تم اختيار NanoLuc (NL) باسم الجينات علامة لأنه هو صغير (171 الأحماض الأمينية) هندستها مراسل الانارةالطبقة = "XREF"> 14. وعلاوة على ذلك، NL ما يقرب من 150 أضعاف أكثر إشراقا من يراعة أو Renilla وسيفيراز، وردود الفعل الانارة هو ATP مستقل، مما يشير إلى أن معدل ضرب كاذبة سوف تكون منخفضة للكشف عن الإنتاجية العالية. كفاءة إنتاج HBV المؤتلف حوالي 1/5 من الوالد الالتهاب الكبدي الوبائي، وتشبه إلى مستويات ذكرت بحثا عن الفيروسات المؤتلف HBV السابقة؛ ومع ذلك، فإن سطوع NL يتغلب على قضايا الإنتاجية فيروس لذلك يمكن استخدامها لفحص كتلة من عوامل مضادة للالتهاب الكبد البائي.

فحص وكلاء مكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي باستخدام خلايا الكبد الأولية، قد يكون HepaRG، HepAD38 وخلايا الكبد NTCP-transduced مفيدة لفحص وكلاء مكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي من الطريقة التقليدية (ق). ومع ذلك، فإن النظام المذكور هنا له مزايا عديدة مثل معالجة بسيطة، وحساسية عالية، والتكلفة المنخفضة للفحص. هذه المزايا هي مناسبة لفحوصات إنتاجية عالية لتطوير وتحديد عوامل الالتهاب الكبدي الوبائي الجديد لأغراض علاجية.

Protocol

1. إنتاج المؤتلف HBV ترميز البروتين مراسل

  1. إعداد الخلايا HepG2
    1. إعداد خلية ثقافة المتوسط ​​(متوسطة تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 100 U / مل الأحماض الأمينية غير الأساسية).
    2. لوحة 4 × 10 6 خلايا HepG2 في طبق المغلفة الكولاجين 10 سم في 10 مل من مستنبت قبل يوم واحد ترنسفكأيشن. احتضان خلايا HepG2 عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة.
      ملاحظة: عندما يتم مطلي 4 × 10 6 خلايا HepG2 تقريبا في صحن 10 سم المغلفة الكولاجين في 10 مل من مستنبت، وأنها ستكون 70-90٪ متكدسة في اليوم التالي.
  2. ترنسفكأيشن
    1. خلايا Transfect HepG2 مع 5 ميكروغرام من pUC1.2HBV دلتا إبسيلون 15 و 5 ميكروغرام من pUC1.2HBV / NL 15 باستخدام ترنسفكأيشنكاشف حسب تعليمات الشركة الصانعة.
    2. في اليوم التالي، وإزالة مستنبت وإضافة 10 مل من مستنبت الطازجة.
    3. أسبوع واحد بعد ترنسفكأيشن، ونقل ثقافة المتوسط ​​تحتوي على فيروس التهاب الكبد B المؤتلف إلى مل أنبوب 50 وانتقل إلى الخطوة 1.3.1. إضافة 10 مل من مستنبت الطازجة إلى لوحة تحتوي على خلايا transfected.
      ملاحظة: يتم الحفاظ على الإنتاج من الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف لمدة 4 أسابيع. مستنبت تحتوي على الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 1 شهر.
  3. تنقية HBV المؤتلف
    1. إزالة الحطام خلية من مستنبت تحتوي على الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف بواسطة الطرد المركزي (2300 x ج لمدة 5 دقائق).
    2. تمرير طاف من خلال مرشح 0.45 ميكرون الغشاء.
    3. إضافة حجم مساو من 26٪ PEG / 1.5 M كلوريد الصوديوم (البولي ايثيلين جلايكول 6000: 130 غ، كلوريد الصوديوم، و 49 غرام، 1 مل من 0.5 M EDTA ودرجة الحموضة 8.0 و 5 مل من 1 M HEPES الرقم الهيدروجيني 7.6 في 500 مل) إلى مستنبت تحتوي المؤتلفالالتهاب الكبدي الوبائي وتخلط بلطف. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 2300 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    5. تجاهل وطاف حل بيليه في 0.5 مل من TNE (10 ملي تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA).
    6. إزالة الحطام بواسطة الطرد المركزي في 2300 x ج لمدة 5 دقائق.
    7. تحميل 0.5 مل من TNE تحتوي على الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف على 0.8 مل من السكروز 20٪ في TNE.
    8. أجهزة الطرد المركزي في 100000 × ز لمدة 3 ساعة على 15 درجة مئوية.
    9. تجاهل أكبر قدر من طاف وقت ممكن، وحفظ بيليه. و resuspend في 1 مل من DMEM مجانا المصل لكل 40 مل من بدء مستنبت.
    10. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    11. تصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرون. إعداد 0.5 مل قسامات وتخزينها في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا لوحظ تلوث البروتين مراسل من عينة الفيروس الأصلي، وتنقية الفيروس عن طريق كثافة التدرج فائقة الطرد المركزي من 5-30٪ سكروز في TNE في 100000 x ج لمدة 2 ساعة، أو CSCL كثافة معايرتها الطرد المركزي جيئة وذهابام 1،1-1،6 غ / مل في 150000 x ج لمدة 50 ساعة.

2. العدوى من فيروس التهاب الكبد B المؤتلف

  1. ثقافة الخلايا HepG2 التعبير عن مستقر NTCP (HepG2 / NTCP) 15 التي هي عرضة للعدوى الالتهاب الكبدي الوبائي في DMEM تستكمل مع FBS 10٪، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 250 ميكروغرام / مل G-418 و 100 U / مل الأحماض الأمينية غير الأساسية عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة.
  2. قبل يوم واحد من العدوى، لوحة ما يقرب من 5 × 10 4 HepG2 / خلايا NTCP 14 في لوحة المغلفة 96-جيدا الكولاجين في 0.1 مل من مستنبت.
  3. HBV المؤتلف ذوبان في 37 ° C حمام الماء حتى هناك قطعة صغيرة من الثلج المتبقي في القنينة.
  4. إعداد المتوسطة للعدوى عن طريق الجمع بين ما يلي: 10 ميكرولتر من 40٪ PEG8000 في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 2 ميكرولتر من سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس])، و 10 ميكرولتر من الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف و 78 ميكرولتر من مستنبت الطازجةلكل بئر من لوحة 96-جيدا.
  5. إضافة 100 ميكرولتر من حل HBV المؤتلف إلى جانب واحد من لوحة 96-جيدا.
  6. بعد يوم واحد من العدوى، وغسل الخلايا المصابة 3 مرات مع 300 ميكرولتر PBS لكل بئر لإزالة البروتين مراسل فاسد من جزء الفيروس.
  7. احتضان الخلايا المصابة في 200 ميكرولتر من مستنبت تحتوي على 2٪ DMSO لمدة أسبوع واحد أو أقل.

3. تحليل

  1. بعد أسبوع واحد العدوى، وغسل الخلايا المصابة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من تحلل العازلة للخلايا المصابة.
  3. موسيقى الروك لوحة الثقافة لمدة 5 دقائق، ثم الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من الركيزة مراسل في لوحة luminometer.
  5. إضافة 20 ميكرولتر من المحللة الخلية إلى لوحة luminometer تحتوي على الركيزة المراسل. مزيج من قبل vortexing لفترة وجيزة.
  6. وضع لوحة في luminometer وبدء القراءة 15.

النتائج

ويبين الشكل 1 تخطيطي للجينوم فيروس التهاب الكبد B، الرنا كتب والبروتينات الفيروس والمنطقة الترميز على الجينوم. وأشار أيضا الجين مراسل وموقعها في الجينوم. ويبين الشكل 2 HBV البلازميد مراسل ومساعد البلازميد التي تحتوي على الجين المرا...

Discussion

الجينوم HBV أربعة إطارات الابتدائية مفتوحة القراءة (ORFS) بما في ذلك النواة، البلمرة، السطحية وX ORFS (الشكل 1). وينظم النسخ من هذه ORFS أربعة HBV بإحكام من قبل أربعة مروجين: المروج precore / الأساسية التي تحتوي على محسن الثاني، S1 المروج، والمروج S2 وX المروج التي تحتوي على م?...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported in part by the Research Program on Hepatitis from Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) and by Grants-in-Aids for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Nano-Glo Luciferase Assay RegentPromegaN1110
Penicillin-Streptomycin Mixed SolutionNacalai tesque09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids SolutionThermo Fisher Scientific11140050
DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070
100 mm/collagen-coated dishIwaki4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermo Fisher ScientificL3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000 Sigma-Aldrich81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000 Sigma-Aldrich89510
NaClNacalai tesque31319-45 
0.5 mol/L EDTA SolutionNacalai tesque06894-14
Tris-HClNacalai tesque35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filterMerck MilliporeSLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Collagen coated 96-well plateCorningNO3585
Passive Lysis 5x BufferPromegaE1941
GloMax 96 Microplate LuminometerPromegaE6501
SucroseNacalai tesque30403-55
Luminometer plateGreiner bio-one655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22--Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon--Reference 15
pUC1.2HBV/NL--Reference 15
50 ml tubeViolamo1-3500-02
Anti-Myc antibodySigma-AldrichC3956
HBIGJapan Blood Products Organization-
IFN-βMochida Pharmaceutical14987224005413
HeparinSigma-AldrichH3393

References

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W., Knipe, D., Howley, P. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. , 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42 (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

120 B DNA NTCP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved