Développement d'un système de virus de l'hépatite B Reporter pour surveiller les premiers stades du cycle de réplication

Résumé

Nous décrivons ici un virus nouvellement mis au point contre l'hépatite B (VHB) système rapporteur pour surveiller les premiers stades du cycle de vie du VHB. Cette simplifiée système in vitro aidera dans le criblage d'agents anti-VHB en utilisant une stratégie à haut débit.

Résumé

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Introduction

L' infection chronique par le virus de l' hépatite B (VHB) est un facteur de risque majeur pour les maladies chroniques du foie ^1. Bien que des stratégies thérapeutiques actuelles sont basées sur des analogues de nucléotides qui inhibent la fonction du VHB pol et / ou l'administration d'interféron de type I qui activent les réponses immunitaires chez les individus infectés, ainsi que la suppression indirectement la prolifération du VHB par les fonctions des gènes d' interféron stimulées ^2, ces traitements ne peuvent pas éliminer le VHB ADN complètement ^3. En outre, l'émergence de HBVs qui sont résistantes aux agents anti-pol est préoccupante ^4. L'administration d'agents anti-viraux combinés ciblant directement les différentes étapes du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) ou le virus de l'hépatite C (VHC) cycle de vie a été démontré avec succès pour supprimer ou éradiquer le virus (es). Semblable à cette idée, le développement d'un agent anti-VHB (s) qui agissent directement sur les différentes étapes du Hcycle de vie BV est important pour l'établissement de futures thérapies de HBV.

En général, la mise en place d'un simple système de culture in vitro du virus de la cible facilite le développement d'agents anti-viraux. Cependant, il existe au moins deux barrières au développement de systèmes in vitro de culture pour cribler des agents anti-VHB. La première est l'absence d'un système in vitro de la culture cellulaire convenable pour l' infection par le VHB / prolifération. Contrairement aux autres virus, comme le VIH et le VHC, qui se propagent dans des lignées cellulaires établies, il est difficile de cultiver le VHB in vitro en raison des limitations expérimentales , y compris une gamme d'hôtes étroite. L'utilisation de systèmes de culture de cellules spécifiques , telles que la lignée cellulaire d'hépatome humain HepaRG, qui est sensible à l' infection par le VHB, ^{5, 6, 7} ont été développées pour surmonter ces problèmes. En outre, les cellules PXB, isolées urokinase-type activateur du plasminogène transgénique / souris SCID inoculées avec primaire hépatocytes humains (PHH), ont été montrés pour être sensibles à l' infection HBV et la réplication ^8. Cependant, les niveaux de réplication du VHB dans HepaRG dépendent de l'état de différenciation cellulaire après la culture, ce qui peut provoquer des résultats incohérents et non reproductibles de HBV niveaux d'infection / de réplication. PXB est couramment utilisé pour le VHB expériences d'infection, mais est limitée par la disponibilité. Une lignée cellulaire d'expression inductible du VHB à la tetracycline, HepAD38, a également été largement utilisée pour étudier la réplication du VHB, mais ce système ne permet qu'une évaluation après la transcription , et non à l'étape d'infection par le VHB ⁹ d'entrée. Récemment, l'identification d' un polypeptide du taurocholate de sodium cotransporting (PNT) en tant que récepteur fonctionnel pour le VHB a permis le développement d'un système de culture de VHB ¹⁰ variables. En effet, l'expression NTCP dans les cellules d'hépatocarcinome non sensibles tels que Huh7 etHepG2 permet l' infection par le VHB ¹⁰ et , par conséquent, le choix du VHB lignées cellulaires sensibles a été étendue, résoudre un grand nombre des limitations expérimentales. Le deuxième problème est le manque d'un système de test simple pour évaluer l'infection par le VHB et la réplication. L'évaluation de l'infection par le HBV est habituellement effectuée en analysant l'ADN du VHB, l'ARN et les protéines. Cependant, la quantification de ces marqueurs de virus est consommatrice de temps, souvent coûteux et pas toujours simple. Par conséquent, le développement d'un système de dosage simple, par exemple en utilisant un gène rapporteur, peut surmonter les problèmes associés aux systèmes de dosage du VHB.

Cependant, parce que la taille du génome qui peut être emballé dans une capside du VHB est limitée - moins de 3,7 kb ¹¹ - la taille d'un gène rapporteur doit être aussi courte que possible. En outre, la présence de plusieurs éléments cis dispersés à travers le génome, qui sont essentielles à la réplication virale, limite les positions disponibles dans sertion du gène rapporteur dans le génome. Plusieurs rapports ont tenté d'insérer des gènes étrangers, y compris le VIH-1 Tat, la protéine fluorescente verte, et DsRed dans le génome du VHB ^{11, 12, 13.} Cependant, ces HBVs recombinants ne sont pas utiles pour le criblage de l'infection par le VHB / réplication ou pour le criblage à haut débit des facteurs qui influent sur l'infection par le VHB / réplication. Ceci est principalement en raison de la faible productivité des virus recombinants et de l'intensité de l'expression réduite du gène reporter provoquée par la production du virus inefficace.

Pour surmonter ces problèmes, nous avons construit un HBV rapporteur avec un rendement élevé de la production de virus. Ce virus est hautement sensible pour la surveillance des premiers stades du cycle de réplication du VHB, depuis l'entrée jusqu'à la transcription. Pour ce faire, NanoLuc (NL) a été choisi comme un gène marqueur, car il est un petit (171 acides aminés) conçus reporter luminescenteclass = "xref"> 14. De plus, NL est environ 150 fois plus brillante que luciole ou Renilla luciférase, et la réaction luminescente est ATP-indépendante, ce qui suggère que le taux de succès de faux sera faible pour le criblage à haut débit. L'efficacité de l'hépatite B recombinant de production est d'environ 1/5 du parent VHB et similaires aux taux indiqués pour les virus recombinants précédents du VHB; Cependant, la luminosité NL surmonte les problèmes de productivité du virus de sorte qu'il peut être utilisé pour le criblage de masse d'agents anti-VHB.

Dépistage des agents anti-VHB en utilisant des hépatocytes primaires, HepaRG, HepAD38 et hépatocytes NTCP-transduites pourrait être utile pour le criblage d'agents anti-VHB par la méthode (s) classique. Cependant, le système décrit ici présente divers avantages tels que la manipulation simple, une sensibilité élevée et un faible coût pour le dépistage. Ces avantages sont appropriés pour des essais à haut débit afin de développer et d'identifier de nouveaux agents de HBV à des fins thérapeutiques.

Protocole

1. Production recombinante de HBV codant pour la protéine reporter

1. Préparation des cellules HepG2
   1. Préparer un milieu de culture cellulaire (milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 100 U / ml d'acides aminés non essentiels).
   2. Plaques 4 x 10 ⁶ cellules HepG2 dans un plat revêtu de collagène de 10 cm dans 10 ml de milieu de culture le jour avant la transfection. Incuber les cellules HepG2 à 37 ° C dans un humidifiée de 5% de CO ₂ incubateur.
      REMARQUE: Lorsque environ 4 x 10 ⁶ cellules HepG2 sont étalées dans une boîte revêtue de collagène 10 cm dans 10 ml de milieu de culture, ils seront de 70 à 90% de confluence le jour suivant.
2. transfection
   1. Transfecter des cellules HepG2 avec 5 ug de pUC1.2HBV delta epsilon ¹⁵ et 5 pg de pUC1.2HBV / NL ¹⁵ en utilisant une transfectionRéactif selon les instructions du fabricant.
   2. Le lendemain, retirer le milieu de culture et ajouter 10 ml de milieu de culture frais.
   3. Une semaine après la transfection, le transfert du milieu de culture contenant le HBV recombinant à un tube de 50 ml-et passez à l'étape 1.3.1. Ajouter 10 ml de milieu de culture frais à la plaque contenant les cellules transfectées.
      REMARQUE: La production de l'hépatite B recombinant est maintenue pendant 4 semaines. Le milieu de culture contenant de l'hépatite B recombinant peut être conservé à 4 ° C pendant 1 mois.
3. Une purification du recombinant du VHB
   1. Éliminer les débris cellulaires à partir du milieu de culture contenant de l'hépatite B recombinant par centrifugation (2300 x g pendant 5 min).
   2. Passer le surnageant à travers un filtre de 0,45 um à membrane.
   3. Ajouter un volume égal de 26% de PEG / NaCl 1,5 M (polyéthylène glycol 6000: 130 g de NaCl, 49 g, 1 ml d'EDTA 0,5 M pH 8,0 et 5 ml de 1 M de HEPES, pH 7,6 dans 500 ml) au milieu de culture, contenant recombinantHBV et mélanger doucement. Incuber une nuit à 4 ° C.
   4. Centrifugeuse à 2.300 xg pendant 20 min à 4 ° C.
   5. Jeter le surnageant et on dissout le culot dans 0,5 ml de TNE (Tris 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM).
   6. Enlever les débris par centrifugation à 2300 g pendant 5 min.
   7. Charge 0,5 ml de TNE contenant HBV recombinant sur 0,8 ml de saccharose à 20% en TNE.
   8. Centrifugeuse à 100.000 x g pendant 3 heures à 15 ° C.
   9. Jeter autant de surnageant que possible, et enregistrer le culot. Remettre en suspension dans 1 ml de DMEM sans sérum par 40 ml de milieu de culture de départ.
   10. Incuber une nuit à 4 ° C.
   11. Filtrer à travers un filtre de 0,45 um. Préparer aliquotes de 0,5 ml et conserver à -80 ° C.
       REMARQUE: si la contamination de la protéine rapporteur de l'échantillon de virus d'origine est observée, purifier le virus en gradient de densité ultra-centrifugation de 5 à 30% de saccharose dans du TNE à 100 000 g pendant 2 h, soit une densité de CsCl en équilibre centrifugation from 1,1-1,6 g / ml à 150 000 xg pendant 50 h.

2. L'infection de HBV recombinant

1. La culture des cellules HepG2 exprimant de manière stable PNAT (HepG2 / PNT) ¹⁵ qui sont sensibles à l' infection par le VHB dans un milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 250 pg / ml de G-418 et 100 U / ml acides aminés non essentiels à 37 ° C dans un humidifiée de 5% de CO ₂ incubateur.
2. Un jour avant l' infection, la plaque d' environ 5 x 10 ⁴ HepG2 / cellules NTCP ¹⁴ dans une plaque revêtue de collagène de 96 puits dans 0,1 ml de milieu de culture.
3. HBV recombinant Thaw dans un bain d'eau C 37 ° jusqu'à ce que il y a un petit peu de glace restant dans le flacon.
4. Préparer le milieu de l'infection en combinant les éléments suivants: 10 pl de 40% de PEG8000 dans 1 x tampon phosphate salin (PBS), 2 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO), 10 ul de HBV recombinant et 78 pi de milieu de culture fraispar puits d'une plaque à 96 puits.
5. Ajouter 100 pi de solution de HBV recombinant à un puits de la plaque à 96 puits.
6. Un jour après l'infection, les cellules infectées par lavage 3 fois avec 300 ul de PBS par puits pour éliminer les protéines contaminantes de la fraction reporteur à partir du virus.
7. Incuber les cellules infectées dans 200 ul de milieu de culture contenant 2% de DMSO pendant une semaine ou moins.

3. Analyse

1. Une semaine après l'infection, les cellules infectées par lavage 3 fois avec du PBS.
2. Ajouter 50 ul de tampon de lyse des cellules infectées.
3. Rock the plaque de culture pendant 5 min, puis centrifuger à 2000 xg pendant 5 min.
4. Ajouter 50 ul du substrat reporter dans la plaque de luminomètre.
5. Ajouter 20 pi de lysat cellulaire à une plaque de luminomètre contenant le substrat rapporteur. Mélanger par vortex brièvement.
6. Placer la plaque dans le luminomètre et de lancer la lecture de ^15.

Résultats

La figure 1 montre une représentation schématique du génome du VHB, des ARN transcrits, protéines de virus et de leur région codante du génome. Le gène rapporteur et son emplacement dans le génome sont également indiqués. La figure 2 montre le plasmide rapporteur et un plasmide auxiliaire VHB contenant le gène rapporteur. Le pUC1.2HBV / NL reporteur a été construit en supprimant des positions de nucléotides 223-811 à partir du site d'i...

Discussion

Le génome du VHB a quatre trames primaires de lecture ouverts (ORF) , y compris le noyau, la polymerase, de surface et X ORFs (Figure 1). La transcription de ces ORFs quatre HBV est étroitement régulée par quatre promoteurs: le promoteur précore / noyau contenant activateur II, promoteur S1, S2 promoteur et X promoteur contenant activateur I ^18. Les 3,5 kb et 3,4 kb ARNm sont traduits en protéines Precore et Core, respectivement. La grande protéine d'enveloppe (L) est ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent	Promega	N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution	Nacalai tesque	09367-34
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher Scientific	11140050
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
100 mm/collagen-coated dish	Iwaki	4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Polyethylene glycol (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
0.5 mol/L EDTA Solution	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter	Merck Millipore	SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Collagen coated 96-well plate	Corning	NO3585
Passive Lysis 5x Buffer	Promega	E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer	Promega	E6501
Sucrose	Nacalai tesque	30403-55
Luminometer plate	Greiner bio-one	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-	Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-	Reference 15
pUC1.2HBV/NL	-	-	Reference 15
50 ml tube	Violamo	1-3500-02
Anti-Myc antibody	Sigma-Aldrich	C3956
HBIG	Japan Blood Products Organization	-
IFN-β	Mochida Pharmaceutical	14987224005413
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393