Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

Özet

Burada HBV yaşam döngüsünün erken aşamalarında izlemek için yeni geliştirilmiş hepatit B virüsü (HBV) muhabiri sistemini açıklar. Vitro sistemde BASİTLEŞTİRİLMİŞ yüksek verimli bir strateji kullanılarak anti-HBV maddelerinin taranması yardımcı olacaktır.

Özet

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Giriş

Hepatit B virüsü (HBV) ile kronik enfeksiyon kronik karaciğer hastalıklarında ¹ için önemli bir risk faktörüdür. Mevcut tedavi stratejileri interferon uyarımlı gen fonksiyonlarının ² ile HBV pol fonksiyonu ve / veya enfekte olmuş bireylerde bağışıklık yanıtlarını aktive tip I interferon verilmesini de dolaylı bastırıcı HBV proliferasyonunu inhibe nükleotid analoglan dayanmasına rağmen, bu tedaviler HBV ortadan kaldırmaz DNA tamamen ^3. Ayrıca, bir anti-pol maddeler karşı dirençli olan HBVlerin çıkışı endişe ⁴ taşımaktadır. şirketinden insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV) veya hepatit C virüsü (HCV), yaşam döngüsünün farklı adımlarını hedefleme kombine anti-viral ajanlar uygulanması başarılı bastırmak ya da virüs (ler) ortadan kaldırmak için gösterilmiştir. Bu fikrin, H farklı aşamalarında doğrudan etki anti-HBV ajan (lar) gelişimine benzerBV yaşam döngüsü gelecek HBV terapileri kurulması için önemlidir.

Genel olarak, hedef virüs in vitro kültür sistemi basit bir kurulması anti-virüs maddelerinin geliştirilmesini kolaylaştırır. Bununla birlikte, anti-HBV maddeleri taramak için in vitro kültür sistemlerinin geliştirilmesi için en az iki engeller bulunmaktadır. İlk HBV enfeksiyonu / proliferasyonu için uygun bir in vitro hücre kültürü sisteminin olmamasıdır. Kurulan hücre hatlarında yayılır, HIV ve HCV gibi diğer virüsler, aksine, bunun nedeni, dar konukçu aralığının içeren deney sınırlamaları in vitro HBV yetiştirmek için zordur. Bu HBV enfeksiyonunun, ^{5, 6} karşı hassas olan, insan hepatoma hücre hattı HepaRG, belirli hücre kültür sistemlerinin ^{kullanılması, 7,} bu problemlerin üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. Ayrıca, ürokinaz ty izole PXB hücreleri,PE plazminojen aktivatör transjenik / primer insan hepatosit (Ph) ile aşılanır SCID fareleri, HBV enfeksiyonu ve çoğaltma ⁸ duyarlı olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, HepaRG HBV replikasyon seviyesi HBV enfeksiyonu / çoğaltma seviyelerinin tutarsız ve 'tekrarı sonuçlara neden olabilir kültürden sonra hücre farklılaşması durum, bağlıdır. PXB yaygın HBV enfeksiyonu deneyleri için kullanılan ama durumu ile sınırlıdır. Bir tetrasiklin uyanlabilir HBV sentezleme hücre soyu, HepAD38, aynı zamanda yaygın HBV replikasyonunu incelemek için kullanılmıştır, ama bu sistem, sadece, transkripsiyon sonrası olup, HBV enfeksiyonu ⁹ giriş adımında değerlendirme sağlar. Son zamanlarda, HBV için işlevsel bir reseptör olarak, sodyum taurokolat cotransporting polipeptidin tanımlanması (NTCP) değişken bir HBV kültürü sisteminin ¹⁰ geliştirilmesine imkan tanımıştır. Gerçekte, bu tür Huh7 olarak duyarlı olmayan hepatokarsinoma hücrelerinin NTCP ekspresyonu veHepG2 HBV enfeksiyonunun ¹⁰ sağlar ve bu nedenle, HBV hassas hücre hatlarının seçimi deney sınırlamaları birçok çözme genişletilmiştir. İkinci bir sorun, HBV enfeksiyonu ve çoğaltma değerlendirmek için basit bir deney sisteminin olmamasıdır. HBV enfeksiyonu değerlendirilmesi genellikle HBV DNA, RNA ve proteinler analiz ederek yapılır. Ancak, bu virüs belirteçlerinin ölçümü genellikle masraflı ve zaman basit değil zaman tüketen vardır. Bu nedenle, basit bir deney sisteminin geliştirilmesi, bir raportör gen kullanılarak, HBV deney sistemleri ile ortaya çıkan problemlerin üstesinden gelinebilir.

Bununla birlikte, bir HBV kapsid içinde paketlenebilir genom boyutu sınırlı olduğundan, - en az 3.7 kb ¹¹ - Bir raportör genin boyutu mümkün olduğu kadar kısa olması gerekir. Ayrıca, viral replikasyon için gerekli olan genom boyunca dağılmış birden çok cis elemanlarının varlığı bölgesi için uygun pozisyonlar sınırlar genomuna haberci genin yerleştirilmesine. Çeşitli raporlar, HBV genomunda ^{11, 12, 13} içine, HIV-1 Tat, yeşil floresan protein ve DsRed dahil olmak üzere yabancı genleri, eklemek için çalıştılar. Bununla birlikte, bu yeniden birleştirici HBVlerin HBV enfeksiyonu / çoğaltma ya da HBV enfeksiyonu / çoğaltma etkileyen faktörler yüksek verimli tarama taranması için kullanışlı değildir. Bu esas olarak bir araya getiren virüslerin, düşük verimlilik ve yetersiz virüs üretiminin neden raportör gen ekspresyonunun düşük yoğunluktadır.

Bu sorunları aşmak için, virüs üretiminin yüksek verim ile bir muhabir HBV inşa. Bu virüs girişinden transkripsiyonu için, HBV replikasyon döngüsünün erken aşamalarında izlenmesi için son derece duyarlıdır. Bu, küçük bir (171 amino asit) lüminesan raportör tasarlanmış olduğu için bu elde etmek için, NanoLuc (NL), bir işaretleyici gen olarak seçilmiştirclass = "xref"> 14. Ayrıca, NL ateşböceği ya Renilla lusiferaz daha parlak 150 kat yaklaşık ve lüminesan Reaksiyon yanlış isabet oranı yüksek verimli tarama düşük olacağını düşündürmektedir ATP'ye bağımsızdır. Rekombinant HBV üretim verimi yaklaşık 1/5 ebeveyn HBV bölgesinin ve önceki HBV yeniden birleştirici virüs rapor seviyelere benzer; anti-HBV maddelerinin kitlesel taranması için kullanılabilir ancak, NL parlaklığı virüsü verimliliği ilgili sorunların üstesinden gelmektedir.

Birincil hepatositleri kullanılarak anti-HBV maddelerinin taranması, HepaRG, HepAD38 ve NTCP-kalıt hepatositler, geleneksel yöntem (ler) anti-HBV maddelerinin taranması için yararlı olabilir. Ancak, burada açıklanan sistem, kolay kullanım, yüksek hassasiyet ve tarama için düşük maliyetli gibi çeşitli avantajlara sahiptir. Bu avantajlar, geliştirmek ve terapötik amaçlar için yeni HBV maddelerin belirlenmesi için kapsamlı incelemeler için uygundur.

Protokol

Reporter protein kodlayan rekombinant HBV 1. Üretim

1. HepG2 hücrelerinin hazırlanması
   1. Hücre kültürü ortamı hazırlayın (Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS ile takviye (DMEM)), 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 100 U / ml esansiyel olmayan amino asitler).
   2. Kültür ortamında 10 ml Transfeksiyondan bir önceki gün içinde 10 cm'lik bir kollajen kaplı tabak Plaka 4 x 10 ⁶ HepG2 hücreleri. Nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de, HepG2 hücreleri inkübe edin.
      Not: yaklaşık olarak 4 x 10 ⁶ HepG2 hücreleri kültür ortamında 10 ml, 10 cm kollajen kaplı tabak içinde plakalanır, bunlar% 70-90 konfluent ertesi gün olacaktır.
2. transfeksiyon
   1. PUC1.2HBV ö epsilon ¹⁵ 5 ug ve pUC1.2HBV / NL ¹⁵ 5 ug ile transfekt HepG2 hücreleri transfeksiyon kullanılaraküreticinin talimatlarına göre reaktif.
   2. Sonraki gün, kültür ortamı çıkarın ve taze kültür ortamı 10 ml.
   3. Bir hafta sonra transfeksiyon 50 ml tüp rekombinant HBV ihtiva eden kültür ortamı aktarmak 1.3.1 adıma devam edin. transfekte edilmiş hücreleri içeren plaka taze kültür ortamı 10 ml.
      Not: Rekombinant HBV üretimi 4 hafta süre ile muhafaza edilir. Rekombinant HBV ihtiva eden kültür ortamı 1 ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
3. Rekombinant HBV saflaştırılması
   1. santrifüj ile rekombinant HBV (5 dakika boyunca 2300 x g) ihtiva eden kültür ortamından hücre debrisini uzaklaştırmak.
   2. 0.45 um'lik bir membran filtresinden süpernatant geçirin.
   3. Kültür ortamına:% 26 PEG / 1.5M NaCI (130 g, NaCl, 49 g, 0.5 M EDTA, pH 8.0, 1 ml, 1 M HEPES pH 5 ml 7.6 500 ml polietilen glikol 6000) bir eşit hacmi ekleme ihtiva eden rekombinantHBV ve hafifçe karıştırın. 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir.
   4. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 2300 x g'de santrifüjleyin.
   5. Süpernatant atılır ve TNE 0.5 ml (10 mM Tris, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA) içinde pelet çözülür.
   6. 5 dakika için 2300 x g'de santrifüjleme ile çöpleri çıkarın.
   7. TNE içinde 0.8 ml% 20 sükroz üzerinde yük yeniden birleştirici HBV ihtiva TNE 0.5 mi.
   8. 15 ° C'de 3 saat boyunca 100,000 x g'de santrifüjleyin.
   9. mümkün olduğunca süpernatant kadar atmak ve pelet kaydedin. kültür ortamının başlangıç ​​40 ml başına serumsuz DMEM, 1 ml içinde süspanse edin.
   10. 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir.
   11. 0.45 um'lik bir filtre ile filtrelenir. -80 ° C de, 0.5 ml alikotları ve mağaza hazırlayın.
       Not: orijinal virüs numunenin raportör proteini kirlenme gözlenirse, 2 saat boyunca 100,000 x g'de TNE içinde% 5-30 sükroz yoğunluk gradyanı ile ultra santrifüj ile virüs arındırmak ya da ileri geri CsCI yoğunluk dengelenmiş santrifüj50 saat boyunca 150.000 x g'de m 1.1-1.6 g / ml olmuştur.

Rekombinant HBV 2. Enfeksiyon

1. % 10 FBS, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 250 ug / ml G-418 ve 100 U / ml ile takviye edilmiş DMEM içinde HBV enfeksiyonuna duyarlı olan stabil bir şekilde NTCP (HepG2 / NTCP) ^15'i ifade ^eden kültür HepG2 hücreleri nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de gerekli olmayan amino asitler,.
2. Enfeksiyondan bir gün önce, plaka yaklaşık 5 x 10 ⁴ HepG2 / kültür ortamına 0.1 ml, 96-çukurlu kollajen kaplı plaka NTCP hücreleri ^14.
3. 37 ° C su banyosu içinde çözülme rekombinant HBV şişede kalan buz küçük bir bit olana kadar.
4. Aşağıdaki birleştirerek bulaşmasına orta hazırlayın: 1X fosfat tamponlu salin (PBS), dimetil sülfoksit, 2 ul (DMSO),% 40 PEG8000 10 ul rekombinant HBV 10 ul ve taze kültür ortamına 78 ul96 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğu.
5. 96 gözlü plakanın bir oyuğuna rekombinant HBV çözeltisi 100 ul ekle.
6. Enfeksiyondan bir gün sonra, virüs fraksiyondan kirletici raportör proteinini çıkarmak için, göz başına 300 | il PBS ile enfekte edilmiş hücrelerde 3 kez yıkayın.
7. Bir hafta ya da daha az,% 2 DMSO içeren kültür ortamında 200 ul enfekte hücreler inkübe edin.

3. Analiz

1. Bir hafta sonra enfeksiyon, PBS ile enfekte edilmiş hücrelerde 3 kez yıkayın.
2. enfeksiyonlu hücrelere liziz tamponunda 50 ul ekle.
3. 5 dakika boyunca kültürü plakası sallayın, ve daha sonra 5 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüjlenir.
4. Luminometre plakasına haberci substratın 50 ul ekle.
5. raportör alt-tabakayı içeren bir luminometre plakasına hücre lizatının 20 ul ekle. kısaca vorteks ile karıştırın.
6. Luminometreye plaka koyun ve ¹⁵ okuma başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 genomu HBV genomu, transkribe edilmiş RNAlar, virüs proteinleri ve kodlama bölgesinin bir şemasını göstermektedir. genomunda raportör geni ve konumu da gösterilir. Şekil 2, raportör genini ihtiva eden HBV raportör plasmidi ve yardımcı plazmit gösterir. PUC1.2HBV / NL raportör pUC1.2HBV ¹⁶ prekor mRNA transkripsiyon başlatma sitesinden nükleotid pozisyonları 223-811 silme ve raportör geni sokulması ile...

Tartışmalar

HBV genomu çekirdeği, polimeraz, yüzey ve X ORF (Şekil 1) dahil olmak üzere dört ana açık okuma çerçevelerini (ORF) sahiptir. Bu dört HBV ORF transkripsiyon sıkıca dört rehberleri tarafından düzenlenir: prekor / çekirdek geliştirici arttırıcı II içeren, S1 promotör, S2 promotör ve X yükseltici zenginleştirici ¹⁸ I içeren. 3.5 kb ve 3.4 kb mRNA'ların sırasıyla prekor ve Core proteinler çevrilir. Büyük zarf proteini (L) en büyük alt-genomik mR...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent	Promega	N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution	Nacalai tesque	09367-34
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher Scientific	11140050
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
100 mm/collagen-coated dish	Iwaki	4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Polyethylene glycol (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
0.5 mol/L EDTA Solution	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter	Merck Millipore	SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Collagen coated 96-well plate	Corning	NO3585
Passive Lysis 5x Buffer	Promega	E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer	Promega	E6501
Sucrose	Nacalai tesque	30403-55
Luminometer plate	Greiner bio-one	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-	Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-	Reference 15
pUC1.2HBV/NL	-	-	Reference 15
50 ml tube	Violamo	1-3500-02
Anti-Myc antibody	Sigma-Aldrich	C3956
HBIG	Japan Blood Products Organization	-
IFN-β	Mochida Pharmaceutical	14987224005413
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393