Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen

Zusammenfassung

Hier haben wir eine neu entwickelte Hepatitis B-Virus (HBV) Reportersystem beschreiben, die frühen Stadien des HBV-Lebenszyklus zu überwachen. Dieses in vitro System vereinfacht wird in das Screening von anti-HBV - Agenten unterstützen , eine Hochdurchsatz - Strategie.

Zusammenfassung

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Einleitung

Chronische Infektion mit dem Hepatitis - B - Virus (HBV) ist ein wichtiger Risikofaktor für chronische Lebererkrankungen ^1. Obwohl die derzeitigen therapeutischen Strategien auf Nukleotid - Analoga basieren, die HBV - pol Funktion und / oder die Verabreichung von Typ - I - Interferon hemmen , die diese Behandlungen können HBV nicht beseitigen Immunantworten bei infizierten Personen sowie indirekt Unterdrückung der HBV - Proliferation durch, ² Funktionen Interferon-stimulierte Gen aktiviert DNA vollständig ^3. Die Entstehung von HBVs Darüber hinaus, die Mittel anti-pol resistent sind von Belang ist ^4. Die Verabreichung der kombinierten antiviralen Mitteln direkt die verschiedenen Schritte des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) oder Hepatitis-C-Virus (HCV) Lebenszyklus wurde Targeting gezeigt, erfolgreich zu unterdrücken oder den Virus (es) zu beseitigen. Ähnlich wie diese Idee, die Entwicklung von anti-HBV-Mittel (n), die direkt auf den verschiedenen Stufen des H handelnBV Lebenszyklus ist wichtig für die Zukunft HBV Therapien zu etablieren.

Im Allgemeinen erleichtert die Schaffung eines einfachen in vitro - Kultursystem des Zielvirus die Entwicklung von Antivirusmitteln. Es gibt jedoch mindestens zwei Hindernisse für die Entwicklung von in vitro Kultursystemen anti-HBV - Mittel zu screenen. Die erste ist das Fehlen einer geeigneten in vitro - Zellkultursystem für die HBV - Infektion / Proliferation. Im Gegensatz zu anderen Viren, wie HIV und HCV, die in etablierten Zelllinien vermehrt werden, ist es schwierig , HBV in vitro zu kultivieren , da der experimentellen Beschränkungen einschließlich einer engen Wirtsbereich. Die Verwendung von spezifischen Zellkultursystemen wie dem menschlichen Hepatom - Zelllinie HepaRG, die HBV - Infektion empfänglich ist, ^{5, 6, 7} wurden , um diese Probleme zu überwinden , entwickelt. Darüber hinaus PXB Zellen, isoliert von Urokinase-type - Plasminogen - Aktivator transgenen / SCID - Mäuse mit primären humanen Hepatozyten (PHH) geimpft wurden zu einer HBV - Infektion und Replikation ⁸ bis anfällig gezeigt. HBV-Replikationsniveaus in HepaRG sind jedoch abhängig von dem zellulären Differenzierungszustand nach der Kultur, die inkonsistente und nicht reproduzierbare Ergebnisse der HBV-Infektion / Replikation Niveaus führen kann. PXB wird häufig für HBV-Infektion Experimenten verwendet, sondern wird durch die Verfügbarkeit begrenzt. Ein Tetracyclin induzierbare Expressions HBV Zellinie HepAD38, wurde ebenfalls weit verbreitet HBV - Replikation zu untersuchen, aber dieses System erlaubt nur Auswertung nach der Transkription und nicht am Eingang Schritt des HBV - Infektion ^9. Vor kurzem hat die Identifizierung von Natriumtaurocholat cotransporting Polypeptid (NTCP) als funktioneller Rezeptor für HBV ¹⁰ die Entwicklung einer Variablen HBV Kultursystem erlaubt. Tatsächlich NTCP Expression in nicht-empfindlichen hepatocarcinoma Zellen wie Huh7 undHepG2 ermöglicht HBV - Infektion ¹⁰ und somit die Wahl der HBV empfänglichen Zelllinien expandiert wurde, sind viele der experimentellen Beschränkungen lösen. Das zweite Problem ist das Fehlen eines einfachen Testsystems HBV-Infektion und Replikation zu bewerten. Bewertung der HBV-Infektion wird in der Regel durch die Analyse von HBV-DNA, RNA und Proteinen durchgeführt. Allerdings Quantifizierung dieser Virusmarker ist zeitraubend, oft teuer und nicht immer einfach. Daher kann die Entwicklung eines einfachen Testsystems, wie beispielsweise ein Reporter-Gen verwendet, Probleme mit dem HBV-Assay-Systeme assoziiert überwinden.

Da jedoch die Genomgröße, die in einer HBV - Kapsid verpackt werden kann , ist begrenzt - weniger als 3,7 kb ¹¹ - die Größe eines Reportergens sollte so kurz wie möglich sein. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von mehreren cis-Elemente über das Genom verstreut sind, die für die virale Replikation essentiell sind, begrenzt die verfügbaren Positionen in Einsetzen des Reportergens in das Genom. Mehrere Berichte haben fremde Gene einzuführen versucht, einschließlich HIV-1 Tat, grün fluoreszierendes Protein und DsRed, in das HBV - Genom ^{11, 12, 13.} Jedoch sind diese rekombinanten HBVs nicht nützlich für das Screening von HBV-Infektion / Replikation, oder der Hochdurchsatz-Screening von Faktoren HBV-Infektion / Replikation zu beeinflussen. Dies ist vor allem wegen der geringen Produktivität von rekombinanten Viren und die reduzierte Intensität der Reportergenexpression durch ineffiziente Virusproduktion verursacht.

Um diese Probleme zu überwinden, bauten wir einen Reporter HBV mit einer hohen Ausbeute an Virusproduktion. Dieses Virus ist sehr empfindlich für die Überwachung der frühen Phasen des HBV-Replikationszyklus von der Eingabe auf die Transkription. Um dies zu erreichen, wurde NanoLuc (NL) als Marker-Gen ausgewählt, weil es eine kleine (171 Aminosäuren) wurde entwickelt, lumineszente reporterclass = "xref"> 14. Außerdem ist NL etwa 150-fach heller als firefly oder Renilla-Luciferase und die Lumineszenzreaktion ist ATP-unabhängig, was darauf hindeutet, dass die falsche Trefferrate niedrig sein wird für die Hochdurchsatz-Screening. Die Produktionseffizienz des rekombinanten HBV beträgt etwa 1/5 der Mutter HBV und ähnliche Ebenen für frühere HBV rekombinanten Viren berichtet; jedoch überwindet die Helligkeit NL Virus Produktivitätsprobleme, so dass es für das Massenscreening von anti-HBV-Mittel verwendet werden.

Screening von anti-HBV-Mittel unter Verwendung von primären Hepatozyten, HepaRG, HepAD38 und NTCP transduzierten Hepatozyten können für das Screening von anti-HBV-Mittel durch herkömmliche Verfahren (n) nützlich sein. Jedoch das hier beschriebene System hat verschiedene Vorteile, wie einfache Handhabung, hohe Empfindlichkeit und geringe Kosten für das Screening. Diese Vorteile sind für Hochdurchsatz-Assays zu entwickeln und neue HBV Mittel für therapeutische Zwecke zu identifizieren.

Protokoll

1. Herstellung von rekombinanten HBV die Reporter-Protein kodiert

1. Herstellung von HepG2 - Zellen
   1. Bereiten Zellkulturmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 100 U / ml nicht-essentiellen Aminosäuren).
   2. Platte 4 x 10 ⁶ HepG2 - Zellen in einer 10-cm kollagenbeschichtete Schale in 10 ml des Kulturmediums am Tag vor der Transfektion. Inkubieren HepG2 - Zellen bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO ₂ -Inkubator.
      HINWEIS: Bei ca. 4 x 10 ⁶ HepG2 - Zellen in einem 10 cm Kollagen-beschichtete Schale in 10 ml Kulturmedium plattiert sind, werden sie 70-90% konfluent am nächsten Tag.
2. Transfection
   1. Transfizieren HepG2 - Zellen mit 5 ug pUC1.2HBV delta epsilon ¹⁵ und 5 ug pUC1.2HBV / NL ¹⁵ eine Transfektion unter Verwendung vonReagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Am nächsten Tag, entfernen Sie das Kulturmedium und 10 ml frisches Kulturmedium hinzuzufügen.
   3. Eine Woche nach der Transfektion übertragen das Kulturmedium, das rekombinante HBV in ein 50 ml-Röhrchen mit und gehen zu Schritt 1.3.1. 10 ml frisches Kulturmedium auf die Platte, die transfizierte Zellen enthalten.
      HINWEIS: Die Produktion des rekombinanten HBV wird 4 Wochen aufrechterhalten. Das Kulturmedium rekombinanter HBV enthält, kann für 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden.
3. Reinigung rekombinanter HBV
   1. Entfernen Zelltrümmer aus dem Kulturmedium rekombinanter HBV durch Zentrifugation (2.300 × g für 5 min) enthält.
   2. Führen Sie den Überstand durch ein 0,45 um Membranfilter.
   3. Ein gleiches Volumen von 26% PEG / 1,5 M NaCl (Polyethylenglykol 6000: 130 g NaCl, 49 g, 1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 und 5 ml 1 M HEPES, pH 7,6 in 500 ml) zu dem Kulturmedium enthaltend rekombinantesanft HBV und mischen. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
   4. Zentrifuge bei 2.300 xg für 20 min bei 4 ° C.
   5. Überstand verwerfen und lösen Sie das Pellet in 0,5 ml TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
   6. Entfernen der Trümmer durch Zentrifugation bei 2.300 xg für 5 min.
   7. Belastung 0,5 ml TNE rekombinanten HBV auf 0,8 ml 20% Saccharose in TNE enthält.
   8. Zentrifuge bei 100.000 × g für 3 Stunden bei 15 ° C.
   9. Verwerfen, so viel von dem Überstand wie möglich, und das Pellet speichern. Resuspendieren in 1 ml serumfreiem DMEM pro 40 ml Kulturmedium zu starten.
   10. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
   11. Man filtriert durch ein 0,45 um-Filter. Bereiten Sie 0,5 ml Aliquots und bei -80 ° C.
       HINWEIS: Wenn Reporterprotein Kontamination des ursprünglichen Virusprobe beobachtet wird, reinigen das Virus durch Dichtegradientenzentrifugation Ultrazentrifugation von 5-30% Saccharose in TNE bei 100.000 × g für 2 Stunden, oder CsCl Dichte ins Gleichgewicht gebracht Zentrifugation from 1,1-1,6 g / ml bei 150.000 xg für 50 Std.

2. Infektion von rekombinanten HBV

1. Kultur HepG2 - Zellen stabil exprimieren NTCP (HepG2 / NTCP) ¹⁵ , das mit 10% FBS ergänzt HBV - Infektion in DMEM anfällig sind, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 250 ug / ml G-418 und 100 U / ml nicht - essentielle Aminosäuren bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO ₂ -Inkubator.
2. Einen Tag vor der Infektion, Platte ca. 5 x 10 ⁴ HepG2 / NTCP Zellen ¹⁴ in eine 96-Well - Kollagen - beschichtete Platte in 0,1 ml Kulturmedium.
3. Thaw rekombinante HBV in einem 37 ° C Wasserbad, bis ein kleines Stück Eis in der Flasche bleiben.
4. Vorbereiten des Mediums für eine Infektion durch Vereinigen der folgenden: 10 & mgr; l von 40% PEG8000 in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 2 & mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO), 10 ul rekombinanter HBV und 78 & mgr; l frisches Kulturmediumpro Well einer 96-Well-Platte.
5. 100 l rekombinanten HBV-Lösung in eine Vertiefung der 96-Well-Platte.
6. Einen Tag nach der Infektion, waschen Sie die infizierten Zellen 3-mal mit 300 & mgr; l PBS pro Vertiefung der verunreinigenden Reporterprotein aus der Virusfraktion zu entfernen.
7. Inkubieren infizierten Zellen in 200 ul Kulturmedium, das 2% DMSO für eine Woche oder weniger.

3. Analyse

1. Eine Woche nach der Infektion, waschen Sie die infizierten Zellen 3 mal mit PBS.
2. Zugabe von 50 & mgr; l Lysepuffer zu den infizierten Zellen.
3. Rock the Kulturplatte für 5 Minuten, und dann Zentrifuge bei 2000 xg für 5 min.
4. In 50 ul des Reportersubstrat in das Luminometer Platte.
5. In 20 ul Zelllysat zu einem Luminometer Platte das Reportersubstrat enthält. Mischen Sie durch kurzes Vortexen.
6. Die Platte wird in das Luminometer und initiieren ¹⁵ zu lesen.

Ergebnisse

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung des HBV - Genoms transkribiert RNAs, Virusproteine und deren codierende Region auf dem Genom. Das Reportergen und seine Position in dem Genom sind ebenfalls angegeben. Abbildung 2 zeigt die HBV - Reporterplasmid und Helferplasmid das Reportergen enthält. Die pUC1.2HBV / NL Reporter wurde durch Deletieren Nukleotidpositionen 223-811 konstruiert von der Transkriptionsinitiationsstelle des precore mRNA von pUC1.2...

Diskussion

Das HBV - Genom hat vier primäre offene Leserahmen (ORFs) , einschließlich des Kerns, Polymerase, Oberflächen und X ORFs (Abbildung 1). Die Transkription dieser vier HBV ORFs dicht durch vier Promotoren reguliert wird: die Precore / Kern - Promotor - Enhancer enthält , II, S1 - Promotor, S2 Promotor und X - Promotor enthält Enhancer I ^18. Die 3,5 kb und 3,4 kb mRNAs werden in Precore und Core Proteine ​​übersetzt sind. Die große Hüllprotein (L) von der größten subge...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent	Promega	N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution	Nacalai tesque	09367-34
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher Scientific	11140050
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
100 mm/collagen-coated dish	Iwaki	4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Polyethylene glycol (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
0.5 mol/L EDTA Solution	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter	Merck Millipore	SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Collagen coated 96-well plate	Corning	NO3585
Passive Lysis 5x Buffer	Promega	E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer	Promega	E6501
Sucrose	Nacalai tesque	30403-55
Luminometer plate	Greiner bio-one	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-	Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-	Reference 15
pUC1.2HBV/NL	-	-	Reference 15
50 ml tube	Violamo	1-3500-02
Anti-Myc antibody	Sigma-Aldrich	C3956
HBIG	Japan Blood Products Organization	-
IFN-β	Mochida Pharmaceutical	14987224005413
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393