פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

Summary

כאן אנו מתארים מערכת הכתב החדש שפותח הפטיטיס B וירוס (HBV) לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור החיים HBV. זה פשוט יותר במערכת במבחנה יסייע ההקרנה של תרופות אנטי-HBV משתמש באסטרטגיה תפוקה גבוהה.

Abstract

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Introduction

זיהום כרוני בנגיף הפטיטיס B (HBV) מהווה גורם סיכון עיקרי למחלות כבדות כרונית ^1. למרות אסטרטגיות טיפוליות נוכחיות מבוססות על אנלוגים נוקלאוטיד המעכבות פונקצית pol HBV ו / או הממשל של אינטרפרון מסוג I שמפעיל מערכת חיסונית אצל אנשים נגועים וכן בעקיפין התפשטות HBV דיכוי באמצעות פונקציות גן מגורה אינטרפרון ^2, טיפולים אלה לא יכולים לחסל HBV DNA לחלוטין ^3. יתר על כן, הופעתה של HBVs כי הם עמידים בפני סוכני-Pol אנטי היא דאגה ^4. הממשל של תרופות אנטי-ויראליות בשילוב ישירות מיקוד השלבים השונים של וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) או הפטיטיס C וירוס מחזור החיים (HCV) הוצגה לדכא בהצלחה או למגר את הנגיף (es). דומה לרעיון זה, פיתוח חומר נוגד-HBV (ים) אשר פועל ישירות על השלבים השונים של Hמחזור החיים BV חשוב לביסוס טיפולים HBV בעתיד.

באופן כללי, הקמת פשוט במערכת התרבות חוץ גופית של הנגיף היעד מקל על הפיתוח של תרופות אנטי-וירוס. עם זאת, ישנם לפחות שני מחסומים לפיתוח מערכות תרבות במבחנה להקרין תרופות אנטי-HBV. הראשון הוא העדר מערכת תרבית תאים נוח במבחנה עבור זיהום HBV / התפשטות. שלא כמו וירוסים אחרים, כגון HIV HCV, אשר מופצים בשורות תאים הוקמו, קשה לטפח HBV במבחנה בשל מגבלות ניסוי כוללים מגוון מארח צר. השימוש במערכות תרבית תאים ספציפיות כגון שורת תאי hepatoma אדם HepaRG, שהוא רגיש לזיהום HBV, ^{5, 6, 7} פותחו כדי להתגבר על בעיות אלה. יתר על כן, תאי PXB, מבודדים מן-טאי האוריקינאזמהונדס activator plasminogen PE / עכברים SCID מחוסן עם hepatocyte אדם מן המעלה הראשונה (PHH), הוצגו להיות רגישים לזיהום HBV ושכפול ^8. עם זאת, רמות שכפולות HBV ב HepaRG תלויות מדינת ההתמיינות אחרי התרבות, אשר יכול לגרום לתוצאות עקביות irreproducible של רמות HBV זיהום / שכפול. PXB משמש בדרך כלל ניסויי זיהום HBV אך מוגבל בגלל זמינותו. שורת תאי ביטוי HBV מושרה טטרציקלין, HepAD38, גם נעשתה שימוש נרחב ללמוד שכפול HBV, אבל מערכת זו מאפשרת רק הערכה לאחר שעתוק ולא צעד כניסת HBV זיהום ^9. לאחרונה, זיהוי של פוליפפטיד cotransporting נתרן taurocholate (NTCP) כמו קולטן פונקציונלי עבור HBV אפשרה פיתוח של מערכת התרבות משתנה HBV ^10. אכן, ביטוי NTCP בתאי hepatocarcinoma שאינם רגישים כגון Huh7 וHepG2 מאפשרת זיהום HBV ¹⁰ וכך, הבחירה של שורות תאים רגישים HBV הורחבה, לפתרון רב מהמגבלות ניסיון. הבעיה השנייה היא חוסר מערכת assay פשוט להעריך זיהום HBV ושכפול. הערכת זיהום HBV מתבצעת לרוב על ידי ניתוח HBV DNA, RNA וחלבונים. עם זאת, כימות של סמנים אלה של הווירוס הוא גוזל זמן, לעתים קרובות יקר ולא תמיד פשוט. לכן, הפיתוח של מערכת assay פשוטה, כגון שימוש גן כתב, אולי להתגבר על בעיות הקשורות במערכות assay HBV.

עם זאת, מכיוון שהגודל הגנום כי ניתן לארוז לתוך קפסיד HBV מוגבל - פחות מ -3.7 kb ¹¹ - בגודל של גן כתב צריך להיות קצר ככל האפשר. יתר על כן, נוכחותם של אלמנטי ציס מרובים הפזורים לאורך הגנום, שחיוניים שכפול נגיפי, מגבילה את המשרות פנויות ב sertion של גן הכתב לתוך הגנום. כמה דיווחים ניסו להכניס גנים זרים, כולל HIV-1 טאט, חלבון פלואורסצנטי ירוק, DsRed, לתוך הגנום HBV ^{11, 12, 13.} עם זאת, HBVs רקומביננטי אלה אינם יעילים לסינון HBV זיהום / שכפול, או להקרנת התפוקה הגבוהה של גורמים המשפיעים HBV זיהום / שכפול. זאת בעיקר בגלל הפריון הנמוך של וירוסים רקומביננטי והעוצמת המופחתים של ביטוי גני כתב הנגרם על ידי ייצור וירוס יעיל.

כדי להתגבר על בעיות אלה, בנינו HBV כתב עם תשואה גבוהה של ייצור וירוס. וירוס זה רגיש מאוד לניטור בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול HBV, מן הכניסה שעתוק. כדי להשיג זאת, NanoLuc (NL) נבחר גן סמן בגלל זה הוא (חומצות אמינו 171) קטנות מהונדסות כתב זורחclass = "Xref"> 14. יתר על כן, NL הוא כ 150-לקפל בהירים יותר גחלילית או בלוציפראז Renilla, והתגובה הזורחת היא ATP-עצמאית, דבר המצביעה על כך אחוזי הצלחת השווא יהיו נמוכים להקרנת תפוקה גבוהה. יעילות הייצור של HBV רקומביננטי הוא כ 1/5 של ההורה HBV, ובדומה לרמות דיווחו לאיתור וירוסים הקודם רקומביננטי HBV; עם זאת, את הבהירות של NL מתגברת בעיות פריון וירוס, כך שהוא יכול לשמש להקרנה ההמונית של תרופות אנטי-HBV.

הקרנת חומרים אנטי-HBV באמצעות hepatocytes העיקרי, HepaRG, HepAD38 ו hepatocytes-transduced NTCP יכול להיות שימושי לצורך ההקרנה של תרופות אנטי-HBV ידי השיטה המקובלת (ים). עם זאת, המערכת המתוארת כאן יש יתרונות שונים כגון טיפול פשוט, רגישות גבוהה, ועלות נמוכה להקרנה. יתרונות אלה מתאימים מבחני תפוקה גבוהים לפתח אילו חומרי HBV חדשים למטרות טיפוליות.

Protocol

הפקה 1. של HBV רקומביננטי המקודד את החלבון Reporter

1. הכנת התאים HepG2
   1. כן בינוני תרבית תאים (הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עובר (FBS), 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו 100 U / ml חומצות אמינו חיוניות).
   2. פלייט 4 x 10 ⁶ תאים HepG2 בצלחת 10 ס"מ מצופה קולגן 10 מ"ל של מדיום תרבות יום לפני transfection. דגירת תאי HepG2 ב 37 מעלות צלזיוס CO ₂ באינקובטור humidified 5%.
      הערה: כאשר כ 4 x 10 ⁶ תאים HepG2 הם מצופה בצלחת 10 ס"מ מצופה קולגן 10 מ"ל של מדיום תרבות, הם יהיו ומחוברות% 70-90 למחרת.
2. transfection
   1. Transfect HepG2 תאים עם 5 מיקרוגרם של דלתא pUC1.2HBV אפסילון ¹⁵ ו -5 מיקרוגרם של pUC1.2HBV / NL ¹⁵ באמצעות transfectionמגיב בהתאם להוראות היצרן.
   2. למחרת, להסיר את המדיום התרבות ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום תרבות טריים.
   3. שבוע לאחר transfection, להעביר את המדיום תרבות המכיל את HBV רקומביננטי לצינור מ"ל-50 לבין המשך לשלב 1.3.1. הוסף 10 מ"ל של מדיום תרבות טרי לצלחת המכיל את התאים transfected.
      הערה: הפקה של HBV רקומביננטי נשמרת למשך 4 שבועות. מדיום התרבות המכיל HBV רקומביננטי יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 חודש.
3. טיהור של HBV רקומביננטי
   1. סור פסול תא ממדיום התרבות המכיל HBV רקומביננטי על ידי צנטריפוגה (2,300 XG במשך 5 דקות).
   2. להעביר את supernatant דרך פילטר קרום 0.45 מיקרומטר.
   3. הוסף נפח שווה של 26% PEG / 1.5 M NaCl (פוליאתילן גליקול 6000: 130 גרם, NaCl, 49 גרם, 1 מ"ל של 0.5 M EDTA pH 8.0 ו -5 מ"ל של 1 M HEPES pH 7.6 ב 500 מ"ל) עד ​​בינוני התרבות רקומביננטי המכילHBV ומערבבים בעדינות. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   4. צנטריפוגה ב 2,300 XG במשך 20 דקות ב 4 °.
   5. בטל supernatant ו לפזר את גלולה ב 0.5 מ"ל של TNE (10 מ"מ טריס, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
   6. הסר את הפסולת על ידי צנטריפוגה ב 2300 XG במשך 5 דקות.
   7. טען 0.5 מ"ל של TNE המכיל HBV רקומביננטי על סוכרוז 0.8 מ"ל של 20% ב TNE.
   8. צנטריפוגה ב 100,000 g × 3 שעות ב 15 מעלות צלזיוס.
   9. מחק כמה שיותר supernatant ככל האפשר, ולשמור גלולה. Resuspend זה ב 1 מ"ל של DMEM חופשית בסרום לכל 40 מ"ל של החל בינוני תרבות.
   10. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   11. סינון דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. הכן 0.5 מ"ל aliquots ולאחסן ב -80 ° C.
       הערה: אם זיהום חלבון הכתב של מדגם וירוס המקורי הוא ציין, לטהר את הנגיף על ידי צנטריפוגה אולטרה-שיפוע צפיפות של סוכרוז 5-30% TNE ב 100,000 XG במשך 2 שעות, או צנטריפוגה equilibrated צפיפות CsCl הלוך ושובמ 1.1-1.6 גרם / מ"ל ​​ב 150,000 XG במשך 50 שעות.

2. זיהום של HBV רקומביננטי

1. HepG2 תרבות תאים המבטאים NTCP ביציבות (HepG2 / NTCP) ¹⁵ כי הם רגישים לזיהום HBV DMEM בתוספת 10% FBS, 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 250 מיקרוגרם / מ"ל G-418 ו- 100 U / ml חומצות אמינו חיוניות על 37 מעלות צלזיוס חממת 5% CO ₂ humidified.
2. יום אחד לפני ההדבקה, צלחת כ 5 x 10 ⁴ HepG2 / תאים NTCP ¹⁴ לתוך צלחת מצופה 96-גם הקולגן 0.1 מ"ל של מדיום תרבות.
3. HBV רקומביננטי הפשרה באמבט מי 37 ° C עד שיש קצת קטן של קרח שנותר הבקבוקון.
4. הכן את המדיום עבור זיהום על ידי שילוב של הבאים: 10 μl של 40% PEG8000 ב בופר פוספט 1x (PBS), 2 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO), 10 μl של HBV רקומביננטי ו -78 μl של המדיום תרבות טרילכל גם צלחת 96-היטב.
5. הוספת 100 μl של פתרון HBV רקומביננטי כדי היטב אחד של הצלחת 96-היטב.
6. יום אחד לאחר ההדבקה, לשטוף את התאים הנגועים 3 פעמים עם 300 μl PBS לכל היטב כדי להסיר את חלבון הכתב המזהם מן שבר הווירוס.
7. דגירת תאים נגועים 200 μl של מדיום התרבות המכיל DMSO 2% למשך שבוע או פחות.

.3 ניתוח

1. שבוע לאחר ההדבקה, לשטוף את התאים הנגועים 3 פעמים עם PBS.
2. הוסף 50 μl של חיץ תמוגה אל התאים הנגועים.
3. רוק הצלחה התרבות במשך 5 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגות XG ב 2000 למשך 5 דקות.
4. הוסף 50 μl של המצע כתב לתוך צלחת luminometer.
5. הוסף 20 μl של lysate התא לצלחת luminometer המכיל את המצע הכתב. מערבבים על ידי vortexing בקצרה.
6. מניחים את הצלחת luminometer וליזום קריאה ^15.

תוצאות

איור 1 מציג סכמה של הגנום HBV, RNAs עבד, חלבוני וירוס ובאזור הקידוד שלהם על הגנום. גן הכתב ומיקומו בגנום מסומן גם. איור 2 מציג את פלסמיד כתב HBV ו עוזרים פלסמיד המכיל את הגן המדווח. כתב pUC1.2HBV / NL נבנה על ידי מחיקת עמדות נוקלאוטיד 223-811 מאתר ייז...

Discussion

הגנום HBV יש ארבע מסגרות קריאה פתוחות עיקריות (ORFs) כולל הליבה, פולימראז, המשטח ו- X ORFs (איור 1). תמלול של ארבעה HBV ORFs מוסדר בחוזקה על ידי ארבעה יזמים: אמרגן precore / ליבה המכילים שפר שני, אמרגן S1, אמרגן האמרגן ו- X S2 המכיל משפר לי ^18. תעתיקי 3.5 קילו ו 3.4 kb מתורגמ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent	Promega	N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution	Nacalai tesque	09367-34
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher Scientific	11140050
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
100 mm/collagen-coated dish	Iwaki	4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Polyethylene glycol (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
0.5 mol/L EDTA Solution	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter	Merck Millipore	SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Collagen coated 96-well plate	Corning	NO3585
Passive Lysis 5x Buffer	Promega	E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer	Promega	E6501
Sucrose	Nacalai tesque	30403-55
Luminometer plate	Greiner bio-one	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-	Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-	Reference 15
pUC1.2HBV/NL	-	-	Reference 15
50 ml tube	Violamo	1-3500-02
Anti-Myc antibody	Sigma-Aldrich	C3956
HBIG	Japan Blood Products Organization	-
IFN-β	Mochida Pharmaceutical	14987224005413
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393