Разработка системы Вирус Reporter гепатита B для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации

Резюме

Здесь мы опишем недавно разработанный вирус гепатита В (HBV) системы репортер контролировать ранние стадии жизненного цикла вируса гепатита. Эта упрощенная в пробирке системы поможет в скрининга агентов против HBV с использованием стратегии высокой пропускной способностью .

Аннотация

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Введение

Хроническая инфекция с вирусом гепатита В (HBV) является одним из основных факторов риска развития хронических заболеваний печени ^1. Хотя современные терапевтические стратегии основаны на нуклеотидных аналогов , которые ингибируют ВГВ функцию Pol и / или введение типа интерферона , который активирует иммунные реакции у инфицированных лиц, а также косвенно подавляя пролиферацию HBV посредством функций гена интерферона-стимулированной ^2, эти процедуры не могут устранить HBV ДНК полностью ^3. Кроме того, появление HBVs, устойчивых к анти-POL агентов вызывает беспокойство ^4. Введение комбинированных анти-вирусных агентов, непосредственно ориентированных на различные этапы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или вирус гепатита С (HCV) жизненного цикла было показано, чтобы успешно подавлять или уничтожать вирус (ы). Подобно этой идее, развитие анти-HBV агента (агентов), которые действуют непосредственно на различных этапах HBV жизненного цикла имеет важное значение для создания будущих методов лечения HBV.

В общем, создание простой в пробирке системы культуры целевого вируса способствует развитию антивирусных агентов. Тем не менее, есть по крайней мере два препятствия для развития в пробирке систем культивирования для скрининга агентов против HBV. Первым из них является отсутствие удобной системы культивирования клеток в пробирке для HBV - инфекции / пролиферации. В отличие от других вирусов, таких как ВИЧ и ВГС, которые распространяются в установленных клеточных линий, что трудно культивировать HBV в пробирке из - за ограничений , в том числе экспериментальных узком диапазоне хозяина. Использование специфических систем клеточных культур , таких , как клеточной линии гепатомы человека HepaRG, который восприимчив к инфекции HBV, ^{5, 6, 7,} были разработаны для преодоления этих проблем. Кроме того, PXB клетки, выделенные из урокиназы-тире активатор плазминогена трансгенный / SCID мышей , привитых первичных человеческих гепатоцитов (ФН), как было показано, быть восприимчивы к инфекции ВГВ и репликации ^8. Однако уровни репликации HBV в HepaRG зависят от состояния клеточной дифференцировки после культуры, что может привести к несогласованным и невоспроизводимые результаты уровней инфекции / репликации HBV. PXB обычно используется для экспериментов инфекции HBV, но ограничивается его доступностью. Тетрациклин индуцибельная HBV линии экспрессии в клетках, HepAD38, также широко используется для изучения репликации HBV, но эта система позволяет только оценку после транскрипции , а не на этапе входа HBV - инфекции ^9. В последнее время идентификация натрия таурохолат cotransporting полипептида (НПБТ) в качестве функционального рецептора для ВГВ позволило разработать системы ¹⁰ культуры переменная HBV. Действительно, выражение НПБТ в нечувствительных гепатокарциномы клетках, таких как HuH7 иHepG2 позволяет инфекции ВГВ ¹⁰ и , таким образом, выбор чувствительных клеточных линий HBV была расширена, решение многих экспериментальных ограничений. Вторая проблема заключается в отсутствии простой тест-системы для оценки HBV-инфекции и репликации. Оценка HBV-инфекции обычно проводится путем анализа ДНК HBV, РНК и белков. Тем не менее, количественное определение этих вирусных маркеров отнимает много времени, часто дорого и не всегда просто. Таким образом, разработка простой системы анализа, например, с использованием ген-репортер, возможно, преодолеть проблемы, связанные с системами ВГВ анализа.

Тем не менее, так как размер генома , которые могут быть упакованы в HBV капсида ограничено - менее 3,7 кб ¹¹ - размер гена - репортера должен быть как можно короче. Кроме того, наличие нескольких цис-элементов, рассеянных по всему геному, которые необходимы для репликации вируса, ограничивает позиции, доступные для в высказанное гена-репортера в геном. Несколько сообщений пытались ввести чужеродные гены, в том числе ВИЧ-1 Tat, зеленый флуоресцентный белок, и DsRed, в геноме HBV ^{11, 12, 13.} Тем не менее, эти рекомбинантные HBVs не являются полезными для скрининга HBV-инфекции / репликации, или для высокопроизводительного скрининга факторов, влияющих на HBV-инфекции / репликации. Это происходит главным образом из-за низкой производительности рекомбинантных вирусов и пониженной интенсивности экспрессии репортерного гена, вызванного неэффективного производства вируса.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы сконструировали репортер HBV с высоким выходом продукции вируса. Этот вирус очень чувствителен для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации HBV, от входа в транскрипции. Для достижения этой цели, NanoLuc (NL) был выбран в качестве гена-маркера, потому что это небольшой (171 аминокислот) инженерии люминесцентный репортеркласс = "Xref"> 14. Кроме того, NL примерно 150 раз ярче, чем светлячков или Renilla люциферазы, и реакция люминесцентный является АТФ-независимым, предполагая, что частота ложных хит будет низкой для высокопроизводительного скрининга. Эффективность производства рекомбинантного HBV составляет примерно 1/5 от родительского HBV, и похожи на уровни, представленных за предыдущие HBV рекомбинантных вирусов; Тем не менее, яркость NL преодолевает проблемы производительности вируса, поэтому он может быть использован для массового скрининга анти-HBV агентов.

Скрининг агентов против HBV с использованием первичных гепатоцитов, HepaRG, HepAD38 и НПБТ трансдуцированных гепатоцитов может быть полезным для скрининга агентов против HBV традиционным способом (ами). Тем не менее, система, описанная здесь, имеет различные преимущества, такие как простое управление, высокую чувствительность и низкая стоимость для скрининга. Эти преимущества являются подходящими для высокой пропускной способности анализов с целью разработки и выявления новых HBV агентов в терапевтических целях.

протокол

1. Получение рекомбинантного HBV Кодирование Reporter белка

1. Получение клеток HepG2
   1. Готовят среду для культивирования клеток (среда Игла в модификации Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 100 ед / мл заменимые аминокислоты).
   2. Пластина 4 х 10 ⁶ клеток HepG2 в 10-сантиметровом коллагеном покрытием блюдо в 10 мл культуральной среды , за день до трансфекции. Инкубируйте клетки HepG2 при 37 ° C в увлажненной 5% CO ₂ инкубаторе.
      Примечание: Когда примерно 4 х 10 ⁶ HepG2 клетки высевают в 10 см коллагеном покрытием чашку для препарата в 10 мл культуральной среды, они будут 70-90% сплошности на следующий день.
2. трансфекция
   1. Трансфекции клеток HepG2 5 мкг pUC1.2HBV дельта эпсилон ¹⁵ и 5 мкг pUC1.2HBV / NL ¹⁵ , используя трансфекциюреагента в соответствии с инструкциями изготовителя.
   2. На следующий день, удалить культуральной среды и добавляют 10 мл свежей культуральной среды.
   3. Через неделю после трансфекции, передачи культуральной среды, содержащей рекомбинантный вирус гепатита В в 50 мл трубки и перейти к этапу 1.3.1. Добавляют 10 мл свежей культуральной среды в чашке, содержащей трансфектированных клеток.
      Примечание: Получение рекомбинантного HBV сохраняется в течение 4-х недель. Носитель культуры, содержащей рекомбинантный вирус гепатита может храниться при температуре 4 ° С в течение 1 месяца.
3. Очистка рекомбинантных HBV
   1. Удалить остатков клеток от культуральной среды, содержащей рекомбинантный вирус гепатита центрифугированием (2300 х г в течение 5 мин).
   2. Пропускают супернатанта через мембранный фильтр 0,45 мкм.
   3. Добавить равный объем 26% PEG / 1,5 М NaCl (полиэтиленгликоль 6000: 130 г, NaCl, 49 г, 1 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0 и 5 мл 1 М HEPES рН 7,6 в 500 мл) в культуральной среде содержащий рекомбинантныйHBV и аккуратно перемешать. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
   4. Центрифуга при 2300 мкг в течение 20 мин при 4 ° С.
   5. Жидкость над осадком сливают и растворяют осадок в 0,5 мл ТНЭ (10 мМ Трис, 50 ​​мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА).
   6. Удалите мусор с помощью центрифугирования при 2300 мкг в течение 5 мин.
   7. Нагрузка 0,5 мл ТНЭ, содержащей рекомбинантный вирус гепатита на 0,8 мл 20% сахарозы в TNE.
   8. Центрифуга при 100000 × г в течение 3 ч при 15 ° С.
   9. Откажитесь, как большая часть надосадочной жидкости, как это возможно, и сохранить осадок. Ресуспендируют его в 1 мл бессывороточной среды DMEM на 40 мл культуральной среды, начиная.
   10. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
   11. Смесь фильтруют через фильтр 0,45 мкм. Приготовьте 0,5 мл аликвоты и хранят при -80 ° С.
       Примечание: Если наблюдается загрязнение репортер белка исходного образца вируса, очистить вирус с помощью градиента плотности ультрацентрифугированием 5-30% сахарозы в TNE при 100000 х г в течение 2 ч, или CsCl, плотность, уравновешенную центрифугирование сюдам 1,1-1,6 г / мл при 150000 мкг в течение 50 часов.

2. Заражение HBV рекомбинантного

1. Культура клеток HepG2 , стабильно экспрессирующие НПБТ (HepG2 / НПБТ) ^15, которые восприимчивы к инфекции ВГВ в среде DMEM , дополненной 10% FBS, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 250 мкг / мл G-418 и 100 Ед / мл заменимые аминокислоты при температуре 37 ° C в увлажненной 5% CO ₂ инкубаторе.
2. За один день до инфицирования, пластины приблизительно 5 х 10 ⁴ HepG2 / НПБТ клетки ¹⁴ в пластине с покрытием 96-луночных коллагена в 0,1 мл культуральной среды.
3. Оттепель рекомбинантный HBV в C водяной бане при 37 ° до тех пор, пока маленький кусочек оставшегося во флаконе льда.
4. Готовят среду для инфекции путем объединения следующих: по 10 мкл 40% PEG8000 в 1x фосфатном буферном солевом растворе (PBS), 2 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), 10 мкл рекомбинантного HBV и 78 мкл свежей культуральной средына лунку 96-луночного планшета.
5. Добавьте 100 мкл раствора рекомбинантного HBV в одну лунку 96-луночного планшета.
6. Через день после заражения, промойте инфицированные клетки 3 раза с 300 мкл PBS на лунку, чтобы удалить белок загрязняющий репортер из вирусной фракции.
7. Инкубируйте инфицированных клеток в 200 мкл культуральной среды, содержащей 2% ДМСО в течение одной недели или менее.

3. Анализ

1. Через неделю после заражения, промойте инфицированные клетки 3 раза PBS.
2. Добавьте 50 мкл буфера для лизиса в инфицированных клетках.
3. Rock Культуральный планшет в течение 5 мин, а затем центрифугировать при 2000 х г в течение 5 мин.
4. Добавьте 50 мкл субстрата репортера в фотометр пластину.
5. Добавьте 20 мкл лизата клеток в люминометра пластину, содержащую репортерный подложку. Смешайте встряхиванием кратко.
6. Поместите пластину в фотометр и начать чтение ^15.

Результаты

На рисунке 1 показана схема генома ВГВ, переписана РНК, вирусные белки и их кодирующей области на геном. Ген-репортер и его местоположение в геноме указаны также. На рисунке 2 показан репортер плазмиды и вспомогательной плазмиды ВГВ , содержащей ген - р...

Обсуждение

HBV геном имеет четыре основных открытых рамок считывания (ORF , ) , включая ядро, полимеразы, поверхностных и X ORF , (рисунок 1). Транскрипция из этих четырех HBV ORF , жестко регулируется четырьмя промоутеров: при регистрации precore / ядро промотора , содержащие энхансер II, S1 промотор, S2 пром...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent	Promega	N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution	Nacalai tesque	09367-34
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher Scientific	11140050
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
100 mm/collagen-coated dish	Iwaki	4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Polyethylene glycol (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
0.5 mol/L EDTA Solution	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter	Merck Millipore	SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Collagen coated 96-well plate	Corning	NO3585
Passive Lysis 5x Buffer	Promega	E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer	Promega	E6501
Sucrose	Nacalai tesque	30403-55
Luminometer plate	Greiner bio-one	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-	Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-	Reference 15
pUC1.2HBV/NL	-	-	Reference 15
50 ml tube	Violamo	1-3500-02
Anti-Myc antibody	Sigma-Aldrich	C3956
HBIG	Japan Blood Products Organization	-
IFN-β	Mochida Pharmaceutical	14987224005413
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393