JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

Abstract

الضوئية الحرارية الزاوي تشتت الضوء (PT-AS) هو أسلوب بصري رواية لقياس تركيز الهيموجلوبين ([هب]) من عينات الدم. على أساس الاستجابة ضوئي؛ ضوحراري الجوهرية للجزيئات الهيموغلوبين، واستشعار تمكن ذات حساسية عالية، وقياس خالية من المواد الكيميائية من [هب]. [هب] القدرة على الكشف مع حد من 0.12 غ / دل على نطاق 0.35 - وقد تجلى 17.9 غ / دل سابقا. يمكن تنفيذها على طريقة بسهولة باستخدام الأجهزة الالكترونية الاستهلاكية غير مكلفة مثل مؤشر ليزر وكاميرا ويب. استخدام أنبوب شعري الصغرى باعتبارها حاوية الدم يمكن أيضا فحص الهيموجلوبين مع حجم الدم نانولتر النطاق وتكلفة التشغيل المنخفضة. هنا، يتم عرض تعليمات مفصلة لإجراءات معالجة الإعداد PT-AS الضوئية والإشارات. وتقدم البروتوكولات التجريبية ونتائج ممثلة لعينات الدم في ظروف فقر الدم ([هب] = 5.3، 7.5، و 9.9 غ / دل) أيضا، وتتم مقارنة القياسات مع تلك جيئة وذهاباأماه أمراض الدم محلل. البساطة في التنفيذ والتشغيل يجب تمكين اعتماد على نطاق واسع في المختبرات السريرية والمناطق ذات الموارد المحدودة.

Introduction

يتم تنفيذ اختبار الدم عادة لتقييم صحة الإنسان العامة والكشف عن المؤشرات الحيوية المرتبطة بأمراض معينة. على سبيل المثال، وتركيز الكولسترول في الدم بمثابة معيار لفرط شحميات الدم، والذي يرتبط ارتباطا وثيقا أمراض القلب والشرايين والتهاب البنكرياس. ينبغي قياس محتويات السكر في الدم بشكل متكرر، كما يرتبط مستوى الجلوكوز مع مضاعفات مثل الحماض الكيتوني السكري، ومتلازمة فرط فرط سكر الدم. يتم تشخيص أمراض خطيرة مثل الملاريا وفيروس نقص المناعة البشرية ومتلازمة نقص المناعة المكتسبة عن طريق الامتحانات الدم، وتقدير حجم مكونات الدم بما في ذلك خلايا الدم الحمراء، thrombocytes، والكريات البيض يمكن فحص البنكرياس وأمراض الكلى.

خضاب الدم (الهيموغلوبين)، وهو عنصر حاسم في الدم، تشكل حوالي 96٪ من الكريات الحمراء، وينقل الأكسجين إلى الأعضاء البشرية. تغيير كبير في تركيز كتلة لها ([هب]) قد يشير ليالتغييرات tabolic وأمراض الكبدية الصفراوية، والعصبية، القلب والأوعية الدموية والغدد الصماء اضطرابات 1. ولذلك [هب] تقاس بشكل روتيني في اختبارات الدم. ولا سيما، مرضى فقر الدم، ومرضى غسيل الكلى، والنساء الحوامل وينصح بشدة لمراقبة [هب] كمهمة الحيوية 2.

وهكذا فقد تم تطوير العديد من طرق الكشف [هب]. طريقة الهيموجلوبين السيانيد، واحدة من التقنيات الأكثر شيوعا ل[هب] الكمي، يستخدم سيانيد البوتاسيوم (KCN) لتدمير طبقة ثنائية المادة الدهنية من الكريات الحمراء 3. الهيموغلوبين السيانيد التي تنتجها المعروضات الكيميائية امتصاص عالية حول 540 نانومتر. بالتالي، [هب] القياسات يمكن أن يتم عن طريق تحليل اللونية. يعمل هذا الأسلوب على نطاق واسع نظرا لبساطته، ولكن المواد الكيميائية المستخدمة (على سبيل المثال، KCN وأكسيد dimethyllaurylamine) هي مواد سامة للإنسان والبيئة. مخطط الهيماتوكريت يقيس نسبة حجم خلايا الدم الحمراء بالمقارنة مع مجموع المجلد الدمأوميا خلال الفصل بالطرد المركزي. ومع ذلك فإنه يتطلب حجم الدم كبير نسبيا (50-100 ميكرولتر) 4. الطيفي طرق قياس [هب] على وجه التحديد دون أي مواد كيميائية، ولكن القياسات في موجات متعددة وحجم الدم كبير يطلب 5،6. وبالمثل، فقد تم اقتراح عدة وسائل بصرية لقياس [هب] بما في ذلك طرق الكشف على أساس تشتت الضوء، ولكن دقتها قياسها يعتمد بقوة على دقة النموذج الدم النظري.

للتغلب على هذه القيود، وقد تم مؤخرا اقترح [هب] طرق الكشف على أساس تأثير ضوئي؛ ضوحراري (PT) من هب 7. الهيموغلوبين، الذي يتكون أساسا من أكاسيد الحديد، تمتص الضوء في 532 نانومتر، وتحويل الطاقة الضوئية إلى حرارة 8-10. هذه الزيادة في درجة الحرارة PT يمكن أن يتم الكشف عن بصريا من خلال قياس التغير في معامل الانكسار (RI) من عينات الدم. ييم وآخرون. العاملين الطيفية المجال التماسك البصري reflectometrذ لقياس التغير البصرية مسار بطول PT في غرفة التي تحتوي على الدم 11. على الرغم من أن طريقة تمكن خالية من المواد الكيميائية ومباشر [هب] قياس، واستخدام مطياف وترتيب التداخل قد تعيق تصغيرها ل. قدمنا مؤخرا طريقة الكشف عن بديل [هب]، ووصف الزاوي تشتت الضوء (PT-AS) الاستشعار الضوئية الحرارية، الذي هو أكثر ملاءمة لتصغير الجهاز 12. أجهزة الاستشعار PT-AS يستغل حساسية RI عالية من التداخل-نثر الظهر (BSI) لقياس التغيرات PT في ري لعينة الدم داخل الأنابيب الشعرية. وقد استخدمت BSI لقياس RI من مختلف الحلول 13-15 ورصد التفاعلات الكيميائية الحيوية في حل الحرة 16. أجهزة الاستشعار PT-AS توظف ترتيب البصرية مماثلة كما هو الحال في BSI، ولكن يجمع بين الإعداد الإثارة ضوئي؛ ضوحراري لقياس زيادة PT من RI في عينات الدم. ووصف المبادئ التشغيلية للBSI وأجهزة الاستشعار PT-AS بالتفصيل في مكان آخر 12،15. أظهر PT-AS استشعار عالية الحساسية [هب] قياس مدى اكتشاف مجموعة واسعة (0،35-17،9 غ / دل)، وقادر على العمل مع وحدات التخزين عينة من <100 نيكولا لانغ. لا يلزم شروط مسبقة من عينة الدم، وقياس الوقت هو فقط ~ 5 ثانية. هنا، يتم وصف الإعداد التجريبية وبروتوكول قياس مفصلة. وتقدم ممثل PT-AS النتائج باستخدام عينات دم من مرضى فقر الدم، وتتم مقارنة النتائج ضد أولئك من محلل أمراض الدم لتقييم دقة أجهزة الاستشعار PT-AS.

Protocol

وقد أجريت تجارب على عينات الدم في الامتثال للقوانين ذات الصلة والمبادئ التوجيهية المؤسسية. وكانت عينات من عينات الدم المتبقية التي تم الحصول عليها ومعالجتها في الاختبارات السريرية في المؤسسة.

1. PT-AS إعداد البصري

ملاحظة: يمكن للمرء استخدام أنبوب الدقيقة الشعرية فارغة لإعداد أولي PT-AS.

  1. جبل أنبوب الدقيقة الشعرية فارغة بأقطار الداخلية والخارجية من 200 و 330 ميكرون، على التوالي، ويبلغ طوله أكبر من ~ 5 سم على لاعبا اساسيا الأنابيب الشعرية. تركيبات الألياف المتاحة تجاريا يمكن أن تستخدم لاعبا اساسيا أنبوب.
  2. آمن ترسيخ مؤشر ليزر 650 نانومتر، أي تحقيق في مصدر الضوء، لإلقاء الضوء على الأنابيب الشعرية. يجب أن يكون شعاع تحقيق أكبر من الأنابيب الشعرية. وضع الشاشة (على سبيل المثال، ورقة بيضاء) وراء الأنابيب الشعرية لمراقبة نمط الدوري الزاوي.
  3. بالنسبة للجزء الكشف وإزالة أي العدسات في الكاميرا لالتقاط مباشرة scattتعافي النمط. ضع الكاميرا خلف الأنابيب الشعرية في زاوية من 25-35 درجة بالنسبة للاتجاه التحقيق شعاع. تأكد من أن نمط الدوري الزاوي التي تنتجها الأنابيب الشعرية يمكن قياس مع كاشف (الشكل 1). مراقبة نمط الدوري الزاوي في منتصف صورة الاستشعار عندما يتم وضع صورة الاستشعار بشكل صحيح.
  4. وضع مصدر ضوء PT الإثارة 532 نانومتر لإلقاء الضوء على الأنابيب الشعرية. وضع مصدر الضوء PT في أي زاوية، طالما يتراكب ضوء PT الإثارة مع شعاع التحقيق في الأنابيب الشعرية ولا تصل إلى كاشف مباشرة. PT الإثارة من عينات الدم باستخدام الطاقة الضوئية عالية وعادة ما يحسن PT-AS حساسية، لأنه يؤدي إلى تغيير كبير في ري.
    1. استخدام أعلى الطاقة الضوئية من مصدر الضوء الإثارة PT المستخدمة. وبالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن الضوء PT الإثارة يتراكب ضوء التحقيق في الأنابيب الشعرية. استخدام حجم شعاع من ضوء الإثارة PTعلى الأقل مرتين من ضوء التحقيق لتسخين حجم التحقيق بأكمله.
  5. وضع مرشح تمريرة طويلة في الجبهة من كاشف لمنع الضوء من 532 نانومتر، وقياس فقط ضوء التحقيق 650 نانومتر.
  6. تثبيت المروحية البصرية في مسار ضوء الإثارة PT قبل إلقاء الضوء على الأنابيب الشعرية. يعمل فيها المروحية البصرية لتعديل كثافة PT الإثارة ضوء.

إعداد نموذج 2. الدم

  1. رسم 6 مل من الدم الطازج كامل في حالة فقر الدم إلى ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل أنابيب اخذ عينات من الدم، ومزج العينات جيدا. لا يلزم معالجة أخرى.
  2. قياس عينات الدم باستخدام جهاز استشعار PT-AS خلال 24 ساعة من استخراج لمنع تجلط الدم.

3. PT-AS بروتوكولات القياس

  1. تحميل أنبوب الشعرية الدقيقة مع عينة من الدم لقياس. ملء الأنابيب الشعرية مع الدم من خلال العمل الشعري من خلال وضع أنبوب في دموافرة. يتم تحديد حجم العينة الحد الأدنى المطلوب للقياس من قبل القطر الداخلي للأنبوب شعري وحجم المسبار شعاع.
    1. توظيف أنبوب مع قطرها الداخلي 200 ميكرون. وكان حجم المسبار شعاع 2 مم في نتائج تمثيلية، مما يدل على أن القياس لا يمكن أن يؤديها مع حجم عينة من> 63 نيكولا لانغ.
  2. تركيب الأنابيب الشعرية في موقف معين في المباراة.
  3. بدوره على التحقيق ليزر 650 نانومتر لإلقاء الضوء على أنبوب الدقيقة الشعرية محملة الدم. ينبغي مراعاة نمط الدوري الزاوي مع كاميرا ويب.
  4. تشغيل 532 نانومتر PT الإثارة ليزر لإلقاء الضوء على أنبوب.
  5. تشغيل المروحية البصرية لتعديل شدة الضوء الإثارة PT في 2 هرتز.
    ملاحظة: مبررات اختيار هذا الشرط التشغيل يوصف في مناقشة وكيم وآخرون. 12.
    1. جبل عجلة المروحية في التجمع رئيس المحركات المروحية البصريةنظام.
    2. بدوره على السيطرة على المربع المروحية، واستخدام مفتاح التحكم في وحدة تحكم لتعيين تضمين التردد.
    3. تشغيل المروحية باستخدام مفتاح التحكم.
  6. تسجيل نمط نثر تذبذب خلال الكاميرا لمدة 5 ثانية في MPEG-4 صيغة (MP4).

4. معالجة الإشارات

ملاحظة: PT-AS معالجة الإشارات أجريت باستخدام رمز MATLAB نموا المختبر.

  1. تحميل ملف فيديو لاستخراج الصور. لكل صورة [انظر الشكل 2 (أ) للحصول على صورة تمثيلية]، يجب الحصول على نمط تناثر المتوسط عن طريق حساب متوسط القيم بكسل على طول الاتجاه الرأسي [الشكل 2 (ب، ج)].
  2. تقييم تحويل فورييه من نمط نثر المتوسط، وحساب المرحلة على التردد المكاني ذروة. تنفيذ هذه العمليات لجميع الأطر من جميع الصور المسجلة.
  3. باستخدام القيم المرحلة التي تم الحصول عليها من جميع الصور، رسم المرحلة الزمنيةتذبذب [الشكل 2 (د)]. لاحظ أن المرحلة يتقلب على التردد PT تعديل. خذ تحويل فورييه من تذبذب المرحلة في المجال الزمني، والحصول على قوته في تضمين التردد. ويشار إلى هذا إشارة إلى أنه PT-AS إشارة [الشكل 2 (ه)].
  4. قياس [هب] من عينة من الدم عن طريق تحويل PT-AS اشارة الى المقابلة [هب] باستخدام منحنى المعايرة التي يتم الحصول عليها في بروتوكول 5.

5. PT-AS المعايرة

  1. تحضير عينات الدم، وكان [هب] القيم التي يتم توزيعها بشكل موحد في نطاق الكشف عن PT-AS أجهزة الاستشعار (على سبيل المثال، 0-18 غ / دل).
  2. قبل معايرة وقياس القيم [هب] من العينات باستخدام محلل إشارة الدم. قياس PT-AS إشارات من العينات.
  3. اشتقاق منحنى المعايرة المتعلقة [هب] إلى إشارة PT-AS عن طريق إجراء خطي المربعات الصغرى تناسب، [هب] = A [PT-AS الإشارة] + B، من experimentaالنتائج لتر. لظروف التشغيل المحددة في الجدول رقم 1، تم العثور على العلاقة بين [هب] وإشارة PT-AS أن يكون [هب] = 5.13 [PT-AS إشارة] - 0.09. استخدام رمز MATLAB لأداء تناسب خطي.

النتائج

تم إجراء فحص خضاب الدم باستخدام جهاز استشعار PT-AS، وتمت مقارنة القياسات مع تلك من محلل أمراض الدم. وقد أجريت التجربة مع شدة الضوء PT الإثارة من 1.4 واط / سم 2، PT تضمين التردد من 2 هرتز، وقياس الزمن من 5 ثانية. ويلخص الجدول 1 الظروف التجريبية. و...

Discussion

يمثل جهاز استشعار PT-AS سيلة جميع البصرية قادرة على القياس المباشر [هب] من عينات الدم غير المجهزة. يقيس طريقة [هب] في الدم باستخدام استجابة PT الجوهرية للجزيئات الهيموغلوبين في كريات الدم الحمراء. تحت إضاءة التي كتبها ضوء 532 نانومتر، جزيئات الهيموغلوبين تمتص الطاقة الضوئ...

Disclosures

No conflict of interest is declared.

Acknowledgements

This research was supported by the research programs of the National Research Foundation of Korea (NRF) (NRF-2015R1A1A1A05001548 and NRF-2015R1A5A1037668).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
650 nm laser pointerLASMACLED-1Probe light
Hollow round glass capillariesVitroComCV2033Blood sample container
WebcamLogitechC525CMOS optical sensor
Optical chopper systemThorlabsMC2000-ECOptical chopper
Plastic long-pass filterEdmund Optics#43-942To reject 532-nm PT excitation light
Fiber clampThorlabsSM1F1-250Capillary tube fixture
EDTA coated blood sampling tubeGreiner Bio-OneVACUETTE 454217Blood sampling & anticoagulating
Hematology analyzerSiemens AGADVIA 2120iReference hematology analyzer

References

  1. Mokken, F. C., Kedaria, M., Henny, C. P., Hardeman, M., Gelb, A. The clinical importance of erythrocyte deformability, a hemorrheological parameter. Ann. Hematol. 64 (3), 113-122 (1992).
  2. Rosenblit, J., et al. Evaluation of three methods for hemoglobin measurement in a blood donor setting. Sao Paulo Medical Journal. 117 (3), 108-112 (1999).
  3. Van Kampen, E., Zijlstra, W. Standardization of hemoglobinometry II. The hemiglobincyanide method. Clin. Chim. Acta. 6 (4), 538-544 (1961).
  4. Billett, H. H. Hemoglobin and hematocrit. Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations. 3, (1990).
  5. Kuenstner, J. T., Norris, K. H., McCarthy, W. F. Measurement of hemoglobin in unlysed blood by near-infrared spectroscopy. Appl. Spectrosc. 48 (4), 484-488 (1994).
  6. Zwart, A., et al. A multi-wavelength spectrophotometric method for the simultaneous determination of five haemoglobin derivatives. Clin. Chem. Lab. Med. 19 (7), 457-464 (1981).
  7. Kwak, B. S., et al. Direct measurement of the in vitro hemoglobin content of erythrocytes using the photo-thermal effect of the heme group. Analyst. 135 (9), 2365-2371 (2010).
  8. Lapotko, D., Lukianova, E. Laser-induced micro-bubbles in cells. International Journal of Heat Mass Transfer. 48 (1), 227-234 (2005).
  9. Lapotko, D. O. Laser-induced bubbles in living cells. Lasers in surgery and medicine. 38 (3), 240-248 (2006).
  10. Lapotko, D. O., Romanovskaya, T. y. R., Shnip, A., Zharov, V. P. Photothermal time-resolved imaging of living cells. Lasers in surgery and medicine. 31 (1), 53-63 (2002).
  11. Yim, J., et al. Photothermal spectral-domain optical coherence reflectometry for direct measurement of hemoglobin concentration of erythrocytes. Biosens. Bioelectron. 57, 59-64 (2014).
  12. Kim, U., et al. Capillary-scale direct measurement of hemoglobin concentration of erythrocytes using photothermal angular light scattering. Biosens. Bioelectron. 74, 469-475 (2015).
  13. Sørensen, H. S., Larsen, N. B., Latham, J. C., Bornhop, D. J., Andersen, P. E. Highly sensitive biosensing based on interference from light scattering in capillary tubes. Appl. Phys. Lett. 89 (15), 151108 (2006).
  14. Swinney, K., Markov, D., Bornhop, D. J. Ultrasmall volume refractive index detection using microinterferometry. Rev. Sci. Instrum. 71 (7), 2684-2692 (2000).
  15. Tarigan, H. J., Neill, P., Kenmore, C. K., Bornhop, D. J. Capillary-scale refractive index detection by interferometric backscatter. Anal. Chem. 68 (10), 1762-1770 (1996).
  16. Bornhop, D. J., et al. Free-solution, label-free molecular interactions studied by back-scattering interferometry. science. 317 (5845), 1732-1736 (2007).
  17. Yang, X., et al. Simple paper-based test for measuring blood hemoglobin concentration in resource-limited settings. Clin. Chem. 59 (10), 1506-1513 (2013).
  18. Zhu, H., et al. Cost-effective and rapid blood analysis on a cell-phone. Lab Chip. 13 (7), 1282-1288 (2013).
  19. Pogačnik, L., Franko, M. Detection of organophosphate and carbamate pesticides in vegetable samples by a photothermal biosensor. Biosens. Bioelectron. 18 (1), 1-9 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

118

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved