光熱角度光散乱ラピッド・化学・フリーヘモグロビンアッセイ

要約

A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

要約

光熱角度光散乱（PT-AS）は、血液サンプルのヘモグロビン濃度（[Hbの]）を測定するための新規な光学的方法です。ヘモグロビン分子の固有光熱応答に基づいて、センサは高感度、[Hbの]の無農薬の測定を可能にします。 [ヘモグロビン] 0.35の範囲にわたって0.12グラム/ dlでの限界と検出能力 - 17.9グラム/ dlが以前に実証されています。この方法は、容易に、レーザポインタやウェブカメラなどの安価な消費者電子デバイスを使用して実施することができます。血液容器としてのマイクロキャピラリーチューブの使用はまた、ナノリットルスケールの血液量と低運転コストでヘモグロビン分析を可能にします。ここで、PT-AS光学装置と信号処理手順の詳細については、提示されています。実験プロトコルおよび貧血状態の血液サンプルについての代表的な結果（[ヘモグロビン] = 5.3、7.5、9.9グラム/デシリットル）も提供され、そして測定があちこちと比較しますミリアンペアの血液分析装置。実装と運用におけるそのシンプルさは、臨床検査室やリソースが制限された設定で、広い採用を有効にする必要があります。

概要

血液検査は、一般的に全体的な人間の健康を評価し、特定の疾患に関連するバイオマーカーを検出するために行われます。例えば、血液中のコレステロール濃度は、密接に、心血管疾患および膵炎に関連する高脂血症のための基準として機能します。グルコースレベルは、糖尿病性ケトアシドーシス及び高血糖高浸透圧症候群などの合併症に関連付けられているように、血糖の内容は、頻繁に測定すべきです。例えばマラリア、ヒト免疫不全ウイルスおよび後天性免疫不全症候群などの深刻な病気は、血液検査によって診断され、赤血球、血小板、および白血球を含む血液成分の定量化は、膵臓及び腎臓疾患のスクリーニングを可能にしています。

ヘモグロビン（Hb）は、血液の重要な成分は、赤血球の約96％を占め、そして人間の臓器に酸素を輸送します。その質量濃度（[ヘモグロビン]）の有意な変化は、私を指示することができますtabolic変化、肝胆道疾患、および神経、心血管および内分泌疾患^1。 【ヘモグロビン従って日常の血液検査で測定されます。特に、貧血患者、透析患者、および妊娠中の女性は強く重要なタスク²として[ヘモグロビン]を監視することをお勧めします。

様々な[ヘモグロビン]の検出方法は、このように開発されています。ヘモグロビンシアン化方法、[ヘモグロビン]定量化のための最も一般的な技術の一つは、赤血球³の脂質二重層を破壊するためにシアン化カリウム（KCN）を用います。 540 nmの周りの化学展示高い吸収によって生成されるシアン化ヘモグロビン;従って、[ヘモグロビン]測定は、比色分析を介して行うことができます。この方法は、広くそのシンプルさのため採用したが、採用化学物質（ 例えば 、KCNおよびジメチルラウリルアミンオキシド）は、ヒトや環境への毒性がありますさ。ヘマトクリットスキームは、全血の体積に比べて赤血球の体積比を測定します梅の遠心分離を介して、しかし、それは比較的大きな血液量（50-100μl）を^4が必要です。分光測光法は、[ヘモグロビン]正確に任意の化学物質なしで測定したが、複数の波長と大きな血液量で測定が^5,6を必要としています。同様に、[ヘモグロビン]測定するためのいくつかの光学的方法は、光散乱に基づく検出方法を含む提案されてきたが、その測定精度は、理論的な血液モデルの精度に強く依存します。

光熱（PT）に基づいて、これらの制限を克服するために、[ヘモグロビン]検出方法Hbの効果は、最近^7に提案されています。主に酸化鉄から構成さHbは、532 nmの光を吸収し熱^8-10に光エネルギーに変換します。このPTの温度上昇は、血液サンプルの屈折率（RI）の変化を測定することによって光学的に検出することができます。イムら。就業スペクトルドメイン光コヒーレンスreflectometryは血液収容室¹¹内のPT光路長の変化を測定します。この方法は、無農薬やダイレクト[Hbの]測定を可能にしているが、分光計および干渉計構成の使用は、その小型化の妨げとなる場合があります。我々は最近、代替[ヘモグロビン]検出方法を提示し、デバイスの微細化¹²に適している光熱角度光散乱（PT-AS）センサーを、と呼ばれます。 PT-ASセンサは、毛細管内部の血液試料のRIにおけるPTの変化を測定するために後方散乱干渉（BSI）の高RI感度を利用します。 BSIは、様々なソリューション^13-15のRIを測定し、自由溶液¹⁶中の生化学的相互作用をモニターするために利用されてきました。 PT-ASセンサはBSIと同様の光学配置を採用したが、血液試料中のRIのPTの上昇を測定する光熱励起設定を組み合わせます。 BSIおよびPT-ASセンサの動作原理は、他の場所で詳細に記載されています ^{12,15。 PT-ASセンサは、広い検出範囲（0.35から17.9までグラム/デシリットル）で高感度[ヘモグロビン]測定値を示し、<100nlのサンプル容量で動作することができます。血液サンプルのないプレコンディショニングを必要とせず、測定時間は、約5秒です。ここでは、実験と詳細な測定手順について説明します。代表的なPT-ASの結果は、貧血患者から血液サンプルを使用して提供され、その結果は、PT-ASセンサの精度を評価するための血液分析器からのものと比較されます。}

プロトコル

血液サンプルを用いた実験では、関連する法律や制度のガイドラインに準拠して行きました。サンプルを取得し、教育機関での臨床試験で処理されていた残留血液サンプルでした。

1. PT-AS光のセットアップ

注：一つは初期PT-ASのセットアップのための空のマイクロキャピラリーチューブを使用することができます。

1. それぞれ、200および330ミクロンの内径と外径と空のマイクロキャピラリーチューブをマウントし、毛細管器具に大きな5〜cm以上の長さ。市販のファイバ固定具は、チューブ固定具として使用することができます。
2. しっかりと650 nmのレーザーポインターを固定、 すなわち 、プローブ光源、毛細管を照明します。プローブビームは、毛細管よりも大きくする必要があります。角度の周期パターンを観察するために毛細管の背後にある画面（ 例えば 、ホワイトペーパー）を配置します。
3. 検出部は、直接scattをキャプチャするウェブカメラのいずれかのレンズをはずしてパターンをering。プローブビーム方向に対して25から35°の角度で毛細管の背後にあるウェブカメラを置きます。毛細管によって生成される角度の周期パターンが検出器（ 図1）を用いて測定することができることを確認してください。イメージセンサが適切に配置されたときに、イメージセンサの途中で角度周期パターンを観察します。
4. 毛細管を照明する位置532nmのPTの励起光源。限りPT励起光が毛細管のプローブビームと重複し、直接検出器に到達しないように任意の角度で位置PT光源を、。それはRIより大きな変化をもたらすように、通常、高い光パワーを用いて、血液サンプルのPTの励起は、PT-AS感度を向上させます。
   1. 採用PT励起光源の最も高い光パワーを使用してください。また、PTの励起光はキャピラリチューブにプローブ光と重なることを確認してください。 PT励起光のビームサイズを使用少なくとも2倍、そのプローブ光の全プローブ体積を加熱します。
5. 532 nmの光を遮断し、唯一650 nmのプローブ光を測定する検出器の前にロングパスフィルタを置きます。
6. 毛細管を照射する前に、PTの励起光の経路内に光チョッパをインストールします。光チョッパは、PTの励起光強度を変調するために使用されます。

2.血液サンプルの調製

1. エチレンジアミン四酢酸採血管に貧血状態で、新鮮な全血の6ミリリットルを描き、よくサンプルを混ぜます。他の処理は必要ありません。
2. 凝固を防ぐために、抽出の24時間以内にPT-ASセンサを用いて血液試料を測定します。

3. PT-AS測定プロトコル

1. 測定するために血液サンプルを用いて、マイクロキャピラリーチューブをロードします。血液の中にチューブを配置することにより、毛細管現象を介して血液と毛細管を埋めます十分な。測定に必要な最小試料容量は、毛細管の内径及びプローブビームサイズによって決定されます。
   1. 200μmの内径を有する管を採用しています。プローブビームのサイズは、測定が> 63ナノリットルの試料容量を用いて行うことができることを示唆している、代表的な結果は2mmでした。
2. フィクスチャ内の指定位置に毛細管をマウントします。
3. 血液ロードされたマイクロキャピラリーチューブを照明するために650 nmのプローブレーザをオンにします。角度の周期パターンは、ウェブカメラで観察する必要があります。
4. チューブを照らすために532-nmのPTの励起レーザーをオンにします。
5. 2 HzでPTの励起光の強度を変調する光チョッパを実行します。
   注：この動作条件の選択のための理論的根拠は、ディスカッションおよびKim らに記載されています。 ^12。
   1. 光チョッパのモーターヘッドアセンブリにチョッパーホイールを装着システム。
   2. チョッパ制御ボックスをオンにして、変調周波数を設定するために、コンソールにコントロールノブを使用します。
   3. コントロールノブを使用してチョッパーを実行します。
6. MPEG-4（MP4）形式で5秒間のウェブカメラを経由して変動する散乱パターンを記録します。

4.信号処理

注：PT-AS信号処理は、実験室開発MATLABコードを使用して行きました。

1. 画像を抽出するために、ビデオファイルをロードします。各画像について、垂直方向[ 図2（B、C）]に沿った画素値の平均を計算することによって平均散乱パターンを得た[ 図2（a）は代表的な画像を参照]。
2. フーリエ変換を平均散乱パターンの変換を評価し、ピーク空間周波数で位相を計算します。すべての記録画像のすべてのフレームのためにこれらの操作を実行します。
3. すべての画像から得られた位相値を用いて、時間的な位相をプロット変動〔 図2（D）]。位相がPTの変調周波数で変動することに注意してください。時間領域における位相変動の変換、および変調周波数での大きさを得るフーリエ変換を取ります。この信号は、PT-AS信号〔 図2（E）]と呼ばれます。
4. プロトコル5で得られた検量線を用いて、[Hbの】対応にそのPT-AS信号を変換して、血液サンプルの[ヘモグロビン]を測定します。

5. PT-ASキャリブレーション

1. （ - 18グラム/デシリットル例えば 、0）を均一PT-ASセンサの検出範囲に分布している[ヘモグロビン]の値を持つ、血液サンプルを準備します。
2. キャリブレーションの前に、参照血液分析器を使用して、サンプルの[Hbの]の値を定量化します。サンプルのPT-AS信号を測定します。
3. 線形最小二乗を行うことにより、PT-AS信号に[Hbの]に関する校正曲線を導出エクスペリの、B + [ヘモグロビン] = A [PT-AS信号]、フィットLが得られます。動作条件は[ヘモグロビン]との関係は 、 表1に指定され、PT-AS信号は、[ヘモグロビン] = 5.13 [PT-AS信号]であることがわかった- 0.09。線形フィットを実行するためにMATLABコードを使用してください。

結果

ヘモグロビンアッセイは、PT-ASセンサを用いて行い、その測定値は、血液分析器からのものと比較しました。実験は2ヘルツの1.4 W / cm ²で、PTの変調周波数、及び5秒の測定時間のPTの励起光強度で行いました。 表1に実験条件をまとめたものです。プローブおよびPT励起光のビームサイズは、それぞれ、5.5および2mMでした。ウェブカメラは、30fpsのフ?...

ディスカッション

PT-ASセンサは、未処理の血液サンプルの直接【のHb]測定可能な全光学的方法を表します。この方法は、赤血球中のヘモグロビン分子の固有のPT応答を使用して、血液中の[Hbを]定量化します。 532 nmの光による照明下で、ヘモグロビン分子が光エネルギーを吸収して熱を発生します。得られた温度上昇は、血液試料のRIを変更します。 BSIの高RI感度は、血液中のこのRIの変化を測定するために利?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
650 nm laser pointer	LASMAC	LED-1	Probe light
Hollow round glass capillaries	VitroCom	CV2033	Blood sample container
Webcam	Logitech	C525	CMOS optical sensor
Optical chopper system	Thorlabs	MC2000-EC	Optical chopper
Plastic long-pass filter	Edmund Optics	#43-942	To reject 532-nm PT excitation light
Fiber clamp	Thorlabs	SM1F1-250	Capillary tube fixture
EDTA coated blood sampling tube	Greiner Bio-One	VACUETTE 454217	Blood sampling & anticoagulating
Hematology analyzer	Siemens AG	ADVIA 2120i	Reference hematology analyzer