A Hémoglobine Assay rapide et sans produits chimiques avec Photothermique angulaire Light Scattering

Résumé

A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

Résumé

Photo-thermique angulaire diffusion de la lumière (PT-AS) est une méthode optique nouvelle pour mesurer la concentration d'hémoglobine ([Hb]) des échantillons de sang. Sur la base de la réponse photothermique intrinsèque des molécules d'hémoglobine, le capteur permet à haute sensibilité, mesure sans produit chimique de [Hb]. [Hb] capacité de détection avec une limite de 0,12 g / dl dans l'intervalle de 0,35 à 17,9 g / dl a été démontré précédemment. Le procédé peut être facilement mis en œuvre en utilisant des dispositifs électroniques grand public bon marché tel qu'un pointeur laser et une webcam. L'utilisation d'un tube microcapillaire en tant que récipient de sang permet également le dosage de l'hémoglobine avec un volume de sang à l'échelle nanolitres et un faible coût d'exploitation. Ici, des instructions détaillées pour les procédures de traitement configuration PT-AS optique et signaux sont présentés. Les protocoles expérimentaux et des résultats représentatifs pour les échantillons de sang dans des conditions anémiques ([Hb] = 5,3, 7,5, et 9,9 g / dl) sont également fournis, et les mesures sont comparées à celles froma analyseur d'hématologie. Sa simplicité dans la mise en œuvre et l'exploitation devrait permettre à sa large adoption dans les laboratoires cliniques et les paramètres de ressources limitées.

Introduction

Un test sanguin est généralement effectuée pour évaluer la santé humaine globale et de détecter les biomarqueurs liés à certaines maladies. Par exemple, la concentration en cholestérol dans le sang sert de critère pour l'hyperlipidémie, qui est étroitement liée aux maladies cardio-vasculaires et la pancréatite. Les teneurs en glucose dans le sang doivent être mesurés fréquemment, car le taux de glucose est associé à des complications telles que l'acidocétose diabétique et le syndrome hyperosmolaire hyperglycémique. des maladies graves telles que le paludisme, le virus de l'immunodéficience humaine et le syndrome acquis de déficience immunitaire sont diagnostiquées par des examens sanguins, et la quantification des composants sanguins, y compris les erythrocytes, les thrombocytes et les leucocytes permet le dépistage du pancréas et des maladies rénales.

Hémoglobine (Hb), une composante essentielle du sang, représente environ 96% des érythrocytes, et transporte l'oxygène aux organes humains. Modification significative de sa concentration massique ([Hb]) peut me indiquerchangements tabolic, maladies hépatobiliaires, et des troubles neurologiques, cardiovasculaires et endocrinologiques ^1. [Hb] est donc systématiquement mesurée dans les tests sanguins. En particulier, les patients anémiques, les patients de dialyse, et les femmes enceintes sont fortement recommandés pour surveiller [Hb] comme une tâche vitale ^2.

[Hb] divers procédés de détection ont donc été mis au point. Le procédé de l' hémoglobine de cyanure, une des techniques les plus courantes pour [Hb] quantification utilise le cyanure de potassium (KCN) pour détruire la double couche lipidique des globules rouges ^3. L'hémoglobine de cyanure produit par l'exposition chimique haute absorption autour de 540 nm; par conséquent, [Hb] mesures peuvent être effectuées par l'intermédiaire de l'analyse colorimétrique. Cette méthode est largement utilisée en raison de sa simplicité, mais les produits chimiques utilisés (par exemple, KCN et de l' oxyde de diméthyllaurylamine) sont toxiques pour les humains et l'environnement. Le régime d'hématocrite mesure le rapport volumique des globules rouges par rapport au volume sanguin totalume par séparation centrifuge; mais il nécessite un volume de sang relativement grand (50-100 ul) ^4. Spectrophotométrie méthodes mesure [Hb] précisément sans aucun produit chimique, mais des mesures à plusieurs longueurs d' onde et un grand volume de sang sont nécessaires ^5,6. De même, plusieurs procédés optiques pour la mesure [Hb] ont été proposés, y compris les méthodes de détection basées sur la diffusion de la lumière, mais leur précision de mesure dépend fortement de la précision du modèle de sang théorique.

Pour surmonter ces limitations, [Hb] méthodes de détection basées sur l'effet photothermique (PT) de Hb ont été récemment proposé ^7. Hb, qui se compose principalement d'oxydes de fer, absorbe la lumière à 532 nm et convertit l'énergie lumineuse en chaleur ^8-10. Cette augmentation de température PT peut être détecté optiquement en mesurant une variation de l'indice de réfraction (RI) d'échantillons de sang. Yim et al. salarié domaine spectral cohérence optique reflectometry pour mesurer le changement de trajet de longueur optique PT dans une chambre contenant du sang ^11. Bien que la méthode permet directe [Hb] mesure sans produit chimique et l'utilisation d'un spectromètre et un agencement interférométrique peuvent entraver sa miniaturisation. Nous avons récemment présenté une alternative [Hb] méthode de détection, appelée angulaire diffusion de la lumière (PT-AS) capteur photo-thermique, qui est plus approprié pour la miniaturisation de l' appareil ^12. Le capteur PT-AS exploite la haute sensibilité RI de l'interférométrie rétrodiffusion (BSI) pour mesurer les changements de PT dans le RI d'un échantillon de sang dans un tube capillaire. BSI ont été utilisées pour mesurer RI de diverses solutions ^13-15 et de surveiller les interactions biochimiques en solution libre ^16. Le capteur PT-AS emploie dispositif optique similaire à celle de BSI, mais combine la configuration d'excitation photothermique pour mesurer augmentation PT du RI dans des échantillons de sang. principes de la BSI et les capteurs PT-AS d'exploitation sont décrits en détail ailleurs ^{12,15. PT-AS capteur démontré haute sensibilité [Hb] mesure sur une plage de détection large (0,35 à 17,9 g / dl) et est capable de fonctionner avec des volumes de <100 nl d'échantillon. Aucun préconditionnement de l'échantillon de sang est nécessaire, et le temps de mesure est seulement ~ 5 sec. Ici, le dispositif expérimental et un protocole de mesures détaillées sont décrites. Les résultats représentatifs PT-AS sont fournis en utilisant des échantillons de sang provenant de patients anémiques, et les résultats sont comparés à ceux d'un analyseur d'hématologie pour évaluer la précision du capteur PT-AS.}

Protocole

Des expériences avec des échantillons de sang ont été effectuées dans le respect des lois et des directives institutionnelles. Les échantillons étaient des échantillons de sang résiduels qui avaient été acquises et traitées dans des essais cliniques à l'institution.

1. PT-AS Configuration optique

NOTE: On peut utiliser un micro-capillaire tube vide pour une configuration initiale PT-AS.

1. Monter un micro-capillaire tube vide avec des diamètres interne et externe de 200 pm et 330, respectivement, et une longueur supérieure à environ 5 cm sur une fixation de tube capillaire. Les appareils disponibles dans le commerce de fibres peuvent être utilisés en tant que partie intégrante du tube.
2. Solidement ancrer un pointeur laser de 650 nm, à savoir, la sonde source de lumière, pour éclairer le tube capillaire. Le faisceau de la sonde doit être supérieure à celle du tube capillaire. Placez un écran (par exemple, du papier blanc) derrière le tube capillaire pour observer un motif périodique angulaire.
3. Pour la partie de détection, enlever les lentilles dans une webcam pour capturer directement le scattEring motif. Positionner la webcam derrière le tube capillaire à un angle de 25-35 ° par rapport à la direction du faisceau de sonde. Assurez -vous que le motif périodique angulaire produit par le tube capillaire peut être mesurée avec le détecteur (figure 1). Observer le motif périodique angulaire au centre du capteur d'image lorsque le capteur d'image est correctement positionné.
4. Positionner une source lumineuse d'excitation PT 532 nm pour éclairer le tube capillaire. Placez la source de lumière PT à un angle quelconque, aussi longtemps que la lumière PT d'excitation chevauche avec sonde faisceau sur le tube capillaire et ne parvient pas directement le détecteur. PT excitation des échantillons de sang en utilisant une puissance optique élevée généralement améliore la PT-AS sensibilité, car elle conduit à un plus grand changement dans le RI.
   1. Utiliser la puissance optique la plus élevée de la source de lumière d'excitation PT utilisé. En outre, veiller à ce que la lumière d'excitation PT chevauche la lumière de la sonde sur le tube capillaire. Utilisez une taille de faisceau de la lumière d'excitation PTau moins deux fois celle de la lumière de la sonde pour chauffer le volume de mesure tout entier.
5. Placer un filtre passe-temps devant le détecteur pour bloquer la lumière de 532 nm et mesurer seulement la sonde de lumière de 650 nm.
6. Installez un hacheur optique dans la trajectoire de la lumière d'excitation PT avant d'éclairer le tube capillaire. Le hacheur optique est utilisée pour moduler l'intensité de la lumière PT excitation.

2. Préparation des échantillons de sang

1. Dessinez 6 ml de sang frais dans un état anémique dans des tubes de prélèvement sanguin d'acide éthylènediaminetétraacétique, et bien mélanger les échantillons. Aucun autre traitement est nécessaire.
2. Mesurer les échantillons de sang en utilisant le capteur PT-AS dans les 24 heures d'extraction pour éviter la coagulation.

3. PT-AS Protocoles de mesure

1. Chargez un tube micro-capillaire avec un échantillon de sang pour mesurer. Remplir le tube capillaire avec le sang par capillarité en plaçant le tube dans le sang deample. Le volume d'échantillon minimum requis pour la mesure est déterminée par le diamètre intérieur du tube capillaire et la taille du faisceau de sonde.
   1. Utiliser un tube ayant un diamètre interne de 200 pm. La taille du faisceau de sonde est de 2 mm dans les résultats représentatifs, ce qui suggère que la mesure peut être effectuée avec un volume de> 63 nl d'échantillon.
2. Monter le tube capillaire à la position désignée dans le luminaire.
3. Allumez le 650 nm laser sonde pour éclairer le micro-tube capillaire de sang chargé. Le motif périodique angulaire doit être observé avec la webcam.
4. Allumez le 532-nm laser PT d'excitation pour éclairer le tube.
5. Exécutez le chopper optique pour moduler l'intensité de la lumière d'excitation de PT à 2 Hz.
   NOTE: La justification du choix de cette condition de fonctionnement est décrit dans la discussion et Kim et al. ^12.
   1. Monter une roue de découpage dans l'ensemble de la tête du moteur du hacheur optiquesystème.
   2. Allumez le boîtier de commande du hacheur, et utilisez le bouton de commande dans la console pour régler la fréquence de modulation.
   3. Exécutez le chopper en utilisant le bouton de commande.
6. Enregistrez le modèle de diffusion fluctuant via la webcam pendant 5 s en MPEG-4 (mp4).

4. Traitement du signal

NOTE: PT-AS traitement du signal a été effectuée en utilisant un code MATLAB lab-développé.

1. Chargez le fichier vidéo pour extraire les images. Pour chaque image [voir la figure 2 (a) pour une image représentative], obtenir le motif de diffusion moyenne en calculant la moyenne des valeurs de pixels le long de la direction verticale [Figure 2 (b, c)].
2. Évaluer la transformée de Fourier du motif de dispersion moyenne, et calculer la phase à la fréquence spatiale de crête. Effectuez ces opérations pour tous les cadres de toutes les images enregistrées.
3. En utilisant les valeurs de phase obtenues à partir de toutes les images, tracer la phase temporellefluctuation [figure 2 (d)]. A noter que la phase oscille à la fréquence de modulation PT. Prendre la transformée de Fourier de la variation de phase dans le domaine temporel, et obtenir l'amplitude à la fréquence de modulation. Ce signal est appelé signal , le PT-AS [Figure 2 (e)].
4. Mesurer la [Hb] d'un échantillon de sang en convertissant son signal PT-AS dans le correspondant [Hb] en utilisant la courbe d'étalonnage qui est obtenu dans le protocole 5.

5. PT-AS Calibration

1. Préparer des échantillons de sang, ayant [Hb] Les valeurs qui sont uniformément répartis dans la plage de détection du capteur PT-AS (par exemple, 0-18 g / dl).
2. Avant l'étalonnage, quantifier les [Hb] valeurs des échantillons en utilisant un analyseur d'hématologie de référence. Mesurer les signaux PT-AS des échantillons.
3. Calculer une courbe d'étalonnage se rapportant [Hb] au signal PT-AS en effectuant linéaire des moindres carrés, [Hb] = A [PT-AS signal] + B, des experimental Résultats. Pour les conditions de fonctionnement spécifiées dans le tableau 1, la relation entre [Hb] et le signal PT-AS a été jugée [Hb] = 5,13 [signal de PT-AS] - 0,09. Utilisez le code MATLAB pour effectuer l'ajustement linéaire.

Résultats

Un dosage de l'hémoglobine a été réalisée en utilisant le capteur PT-AS et ses mesures ont été comparées à celles d'un analyseur d'hématologie. L'expérience a été réalisée avec une intensité de lumière d'excitation PT de 1,4 W / cm ^2, PT modulation de fréquence de 2 Hz et à la mesure du temps de 5 sec. Le tableau 1 résume les conditions expérimentales. Les tailles de faisceau de la sonde et PT excitation lumineuse étai...

Discussion

Le capteur PT-AS représente une méthode tout-optique capable de [Hb] mesure directe des échantillons de sang non transformés. La méthode quantifie [Hb] dans le sang en utilisant la réponse PT intrinsèque des molécules d'hémoglobine dans les érythrocytes. Sous l'éclairage par la lumière de 532 nm, les molécules d'Hb absorbent l'énergie lumineuse et produisent de la chaleur. L'élévation de température résultante change la RI de l'échantillon de sang. La haute sensibilité RI de B...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
650 nm laser pointer	LASMAC	LED-1	Probe light
Hollow round glass capillaries	VitroCom	CV2033	Blood sample container
Webcam	Logitech	C525	CMOS optical sensor
Optical chopper system	Thorlabs	MC2000-EC	Optical chopper
Plastic long-pass filter	Edmund Optics	#43-942	To reject 532-nm PT excitation light
Fiber clamp	Thorlabs	SM1F1-250	Capillary tube fixture
EDTA coated blood sampling tube	Greiner Bio-One	VACUETTE 454217	Blood sampling & anticoagulating
Hematology analyzer	Siemens AG	ADVIA 2120i	Reference hematology analyzer