A rápida e sem produtos químicos dosagem de hemoglobina com Photothermal angular de espalhamento de luz

Resumo

A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

Resumo

Foto�t�rmica angular de espalhamento de luz (PT-AS) é um método óptico de novo para a medição da concentração de hemoglobina ([Hb]) de amostras de sangue. Com base na resposta fototérmico intrínseca de moléculas de hemoglobina, o sensor permite alta sensibilidade, medida livre de produtos químicos de [Hb]. [Hb] capacidade de detecção com um limite de 0,12 g / dl ao longo do intervalo de 0,35-17,9 g / dl foi demonstrada anteriormente. O método pode ser facilmente implementada usando dispositivos electrónicos de consumo de baixo custo, tais como um ponteiro laser e uma webcam. O uso de um tubo de micro-capilar como um recipiente para o sangue também permite que o ensaio de hemoglobina com um volume de sangue escala nanolitros e um baixo custo de operação. Aqui, são apresentados instruções detalhadas para os procedimentos de processamento de instalação e de sinal PT-AS óptica. Protocolos experimentais e resultados representativos para as amostras de sangue em condições anémicas ([Hb] = 5,3, 7,5, e 9,9 g / dL) são também fornecidos, e as medições são comparadas com as froma analisador hematológico. Sua simplicidade na implementação e operação deve permitir a sua ampla adoção em laboratórios clínicos e contextos de recursos limitados.

Introdução

Um exame de sangue é comumente realizada para avaliar a saúde humana em geral e para detectar biomarcadores relacionados a certas doenças. Por exemplo, a concentração de colesterol no sangue serve como um critério para a hiperlipidemia, que está estreitamente relacionada com doenças cardiovasculares e pancreatite. O conteúdo de glicose no sangue deve ser medida com frequência, pois o nível de glicose está associada a complicações tais como cetoacidose diabética e síndrome hiperosmolar hiperglicêmicos. doenças graves como a malária, o vírus da imunodeficiência humana e síndrome da imunodeficiência adquirida são diagnosticadas através de exames de sangue, e quantificação dos componentes do sangue, incluindo eritrócitos, trombócitos, leucócitos e permite o rastreio de pâncreas e doenças renais.

A hemoglobina (Hb), um componente crítico de sangue, torna-se cerca de 96% dos eritrócitos, e transporta o oxigénio para órgãos humanos. alteração significativa da sua concentração de massa ([Hb]) pode indicar-memudanças tabolic, doença hepatobiliar, e distúrbios neurológicos, cardiovasculares e endocrinológicos ^1. [Hb] é, portanto, rotineiramente medidos em exames de sangue. Em particular, pacientes anêmicos, pacientes de diálise, e as mulheres grávidas são fortemente recomendados para monitorar [Hb] como uma tarefa vital ^2.

Vários métodos de detecção [Hb] foram assim desenvolvidos. O método da hemoglobina cianeto, uma das técnicas mais comuns para [Hb] quantificação, emprega cianeto de potássio (KCN), para destruir a bicamada lipídica de eritrócitos ^3. A hemoglobina cianeto produzido pelo exposições químicas alta absorção em torno de 540 nm; Assim, [Hb] medições podem ser feitas através de análise colorimétrica. Este método é amplamente utilizado devido à sua simplicidade, mas os produtos químicos utilizados (por exemplo, KCN e óxido dimethyllaurylamine) são tóxicos para os seres humanos eo meio ambiente. O regime de hematócrito mede a relação do volume de células vermelhas do sangue em comparação com o volume total de sangueume através da separação centrífuga; no entanto, exige um volume relativamente grande de sangue (50-100 ul) ^4. Espectrofotometria de métodos de medida [Hb] precisamente sem produtos químicos, mas medições em vários comprimentos de onda e um volume de sangue grande são necessárias ^5,6. Da mesma forma, vários métodos ópticos para medir [Hb] têm sido propostos, incluindo os métodos de detecção baseadas em luz-se espalhando, mas as suas precisões de medição dependem fortemente da precisão do modelo de sangue teórica.

Para superar estas limitações, [Hb] métodos de detecção baseados no efeito fototérmico (PT) de Hb recentemente têm sido propostos ^7. Hb, que é composto principalmente de óxidos de ferro, absorve a luz a 532 nm e converte a energia da luz em calor ^8-10. Este aumento de temperatura PT pode ser detectado opticamente por medição de uma alteração no índice de refracção (RI) de amostras de sangue. Yim et ai. empregada espectral-domain reflectometr de coerência ópticaY para medir a alteração óptica caminho de comprimento PT numa câmara contendo ¹¹ sangue. Embora o método permite a livre de produtos químicos e directa [Hb] medição, a utilização de um espectrómetro e um arranjo de interferometria pode dificultar a sua miniaturização. Recentemente, apresentado um método de detecção alternativo [Hb], denominado sensor de foto�t�rmica angular de espalhamento de luz (PT-AS), que é mais adequado para a miniaturização do dispositivo ^12. O sensor PT-AS explora a sensibilidade elevada RI da interferometria de dispersão de volta (BSI) para medir as mudanças PT no RI de uma amostra de sangue dentro de um tubo capilar. BSI têm sido utilizados para medir RI de várias soluções de ^13-15 e para monitorar interacções bioquímicas em solução livre ^16. O sensor PT-AS emprega disposição óptica semelhante à do BSI, mas combina configuração de excitação fototérmica para medir aumento PT de RI em amostras de sangue. Princípios de funcionamento do BSI e os sensores de PT-AS são descritos em detalhe noutro lugar ^{12,15. PT-demonstrado como sensor de medição de alta sensibilidade [Hb] ao longo de um largo intervalo de detecção (0,35-17,9 g / dl) e é capaz de funcionar com volumes de amostra de <100 nl. Sem o pré-condicionamento de amostra de sangue é necessário, e o tempo de medição é apenas ~ 5 seg. Aqui, a montagem experimental e um protocolo de medição detalhada são descritos. Os resultados representativos PT-AS são fornecidos usando amostras de sangue de pacientes anêmicos, e os resultados são comparados com os de um analisador hematológico para avaliar a precisão do sensor PT-AS.}

Protocolo

Experimentos com amostras de sangue foram realizadas em conformidade com as leis e diretrizes institucionais. As amostras foram as amostras de sangue residuais que tinham sido adquiridas e processadas em testes clínicos na instituição.

Configuração óptica 1. PT-AS

NOTA: Pode-se usar um tubo de micro-capilar vazio para uma configuração inicial PT-AS.

1. Montar um tubo de micro-capilar vazio com diâmetros interior e exterior de 200 e 330 uM, respectivamente, e um comprimento superior a cinco centímetros ~ em uma fixação de tubo capilar. Chaves de fibras comercialmente disponíveis podem ser usados ​​como a fixação de tubo.
2. Ancorar firmemente um ponteiro laser 650 nm, isto é, a sonda fonte de luz, para iluminar o tubo capilar. O feixe de sonda deve ser maior que o tubo capilar. Coloque uma tela (por exemplo, papel branco) por trás do tubo capilar para observar um padrão periódico angular.
3. Para a parte de detecção, remova quaisquer lentes em uma webcam para capturar diretamente o scattrando padrão. Posicionar o webcam atrás do tubo capilar com um ângulo de 25-35 ° em relação à direcção do feixe sonda. Assegure-se que o padrão periódico angular produzida pelo tubo capilar pode ser medida com o detector (Figura 1). Observar o padrão periódico angular no meio do sensor de imagem quando o sensor de imagem está correctamente posicionado.
4. Posicionar uma fonte de luz de excitação PT 532-nm para iluminar o tubo capilar. Posicionar a fonte de luz PT em qualquer ângulo, desde que a luz de excitação PT sobrepõe com feixe de sonda no tubo capilar e não atinge o detector directamente. PT excitação das amostras de sangue utilizando alta potência óptica tipicamente melhora o PT-Como a sensibilidade, uma vez que conduz a uma variação maior no IR.
   1. Utilizar a maior potência óptica da fonte de luz de excitação PT empregue. Além disso, garantir que a luz PT excitação sobrepõe a luz sonda no tubo capilar. Use um tamanho feixe da luz de excitação PTpelo menos duas vezes a da sonda de luz para aquecer todo o volume da sonda.
5. Coloque um filtro passa longo em frente ao detector para bloquear a luz de 532 nm, e medir apenas a luz da sonda 650-nm.
6. Instalar um chopper óptica no caminho da luz de excitação PT antes de iluminar o tubo capilar. O helicóptero óptico é utilizado para modular a intensidade de luz de excitação PT.

Preparação da Amostra 2. Sangue

1. Desenhar 6 mL de sangue inteiro fresco em estado anémico em ácido etilenodiaminotetracético tubos de recolha de sangue, e misturar bem as amostras. Nenhum outro tratamento é necessário.
2. Medem-se as amostras de sangue utilizando o sensor de PT-AS dentro de 24 horas de extracção para impedir a coagulação.

3. PT-como protocolos de medição

1. Coloque um tubo de micro-capilar com uma amostra de sangue para medir. Encher o tubo capilar com o sangue através de uma acção capilar, colocando o tubo no sangue samplo. O volume mínimo de amostra necessário para a medição é determinada pelo diâmetro interior do tubo capilar e o tamanho do feixe de sonda.
   1. Empregar um tubo com um diâmetro interior de 200 um. O tamanho do feixe de sonda foi de 2 mm nos resultados representativos, sugerindo que a medição pode ser realizada com um volume de amostra de> 63 nl.
2. Montar o tubo capilar na posição designada no suporte.
3. Ligue o laser sonda 650 nm para iluminar o tubo de micro-capilar carregado de sangue. O padrão periódico angular devem ser observadas com a webcam.
4. Ligue o 532-nm do laser de excitação PT para iluminar o tubo.
5. Executar o helicóptero óptico para modular a intensidade da luz de excitação PT a 2 Hz.
   NOTA: O critério para a selecção de esta condição de operação é descrita em Discussão e Kim et al. ^12.
   1. Montar uma roda de corte no conjunto do cabeçote do motor do helicóptero ópticasistema.
   2. Ligue a caixa de controle helicóptero, e use o botão de controle no console para definir a frequência de modulação.
   3. Execute o helicóptero usando o botão de controle.
6. Gravar o padrão de espalhamento flutuante através da webcam para 5 segundos no formato MPEG-4 (mp4).

4. Processamento de Sinais

NOTA: processamento de sinal PT-AS foi realizada utilizando um código MATLAB desenvolveu-lab.

1. Carregar o arquivo de vídeo para extrair as imagens. Para cada imagem [ver Figura 2 (a), para uma imagem representativa], obter o padrão de dispersão média calculando a média dos valores de pixel ao longo da direcção vertical [Figura 2 (b, c)].
2. Avaliar a transformada de Fourier do padrão de dispersão em média, e calcular a fase no pico de frequência espacial. Executar essas operações para todos os quadros de todas as imagens gravadas.
3. Utilizando os valores de fase obtidos a partir de todas as imagens, traçar a fase temporaisflutuação [Figura 2 (d)]. Note-se que a fase varia com a frequência de modulação PT. Aqui a transformada de Fourier a flutuação de fase no domínio do tempo, e obter a amplitude na frequência de modulação. Este sinal é referido como o PT-Como o sinal [Figura 2 (e)].
4. Meça a [Hb] de uma amostra de sangue, convertendo seu sinal PT-AS para o correspondente [Hb], utilizando a curva de calibração que é obtido no Protocolo 5.

5. PT-AS Calibração

1. Preparar as amostras de sangue, tendo [Hb] valores que estão uniformemente distribuídas no intervalo de detecção do sensor PT-AS (por exemplo, 0-18 g / dl).
2. Antes da calibração, quantificar os valores de [Hb] das amostras utilizando um analisador de hematologia referência. Medir os sinais PT-AS das amostras.
3. Derivar uma curva de calibração relacionando [Hb] para o sinal PT-AS realizando uma linear de mínimos quadrados encaixam, [Hb] = A [PT-AS Signal] + B, das experimental resultados. Para as condições de funcionamento especificados no quadro 1, a relação entre [Hb] e o sinal PT-AS foi encontrado para ser [Hb] = 5,13 [sinal PT-AS] - 0,09. Use o código MATLAB para realizar o ajuste linear.

Resultados

Um ensaio de hemoglobina foi realizada utilizando o sensor de PT-AS, e suas medições foram comparadas com aquelas de um analisador de hematologia. O experimento foi realizado com uma intensidade de luz PT excitação de 1,4 W / cm ^2, PT modulação de frequência de 2 Hz, e medição do tempo de 5 segundos. A Tabela 1 resume as condições experimentais. Os tamanhos de feixe da luz da sonda e excitação PT foram de 5,5 e 2 mm, respectivamente. A webcam grav...

Discussão

O sensor PT-AS representa um método totalmente óptica capaz de medição direta [Hb] de amostras de sangue não transformados. O método quantifica [Hb] no sangue, utilizando a resposta PT intrínseca de moléculas de hemoglobina em eritrócitos. Sob iluminação pela luz de 532 nm, as moléculas de hemoglobina absorver a energia da luz e produzir calor. O aumento da temperatura resultante altera o RI da amostra de sangue. A sensibilidade elevada RI da BSI foi explorada para medir esta mudança RI no sangue. Anteriorm...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
650 nm laser pointer	LASMAC	LED-1	Probe light
Hollow round glass capillaries	VitroCom	CV2033	Blood sample container
Webcam	Logitech	C525	CMOS optical sensor
Optical chopper system	Thorlabs	MC2000-EC	Optical chopper
Plastic long-pass filter	Edmund Optics	#43-942	To reject 532-nm PT excitation light
Fiber clamp	Thorlabs	SM1F1-250	Capillary tube fixture
EDTA coated blood sampling tube	Greiner Bio-One	VACUETTE 454217	Blood sampling & anticoagulating
Hematology analyzer	Siemens AG	ADVIA 2120i	Reference hematology analyzer