Un ensayo de hemoglobina rápida y libre de químicos con fototérmica angular de dispersión de luz

Resumen

A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

Resumen

Photo-térmica angular de dispersión de luz (PT-AS) es un método óptico novedoso para la medición de la concentración de hemoglobina ([Hb]) de muestras de sangre. Sobre la base de la respuesta fototérmica intrínseca de las moléculas de hemoglobina, el sensor permite una alta sensibilidad, la medición libre de químicos de [Hb]. [Hb] capacidad de detección con un límite de 0,12 g / dl en el rango de 0,35 a 17,9 g / dl se ha demostrado previamente. El método se puede implementar fácilmente utilizando dispositivos electrónicos de bajo costo de consumo, tales como un puntero láser y una cámara web. El uso de un tubo de micro-capilar como un recipiente de sangre también permite el ensayo de la hemoglobina con un volumen de sangre de nanolitros escala y un bajo costo de operación. A continuación, se presentan instrucciones detalladas para los procedimientos de procesamiento de configuración PT-ópticos y de señal. También se proporcionan los protocolos experimentales y los resultados representativos de las muestras de sangre en condiciones anémicas ([Hb] = 5,3, 7,5, y 9,9 g / dl), y las mediciones se comparan con los froanalizador de hematología ma. Su simplicidad en la implementación y operación de permitir su adopción generalizada en los laboratorios clínicos y entornos con recursos limitados.

Introducción

Un análisis de sangre se realiza con frecuencia para evaluar la salud humana en general y para la detección de biomarcadores relacionados con ciertas enfermedades. Por ejemplo, la concentración de colesterol en la sangre sirve como criterio para la hiperlipidemia, que está estrechamente relacionada con enfermedades cardiovasculares y pancreatitis. El contenido de glucosa en sangre deben ser medidos con frecuencia, ya que el nivel de glucosa se asocia con complicaciones tales como la cetoacidosis diabética y el síndrome hiperosmolar hiperglucémico. Las enfermedades graves como la malaria, el virus de la inmunodeficiencia humana y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida se diagnostica mediante exámenes de sangre, y la cuantificación de los componentes de la sangre incluyendo eritrocitos, trombocitos, leucocitos y permite la detección de enfermedades pancreáticas y renales.

La hemoglobina (Hb), un componente crítico de la sangre, representa aproximadamente el 96% de los eritrocitos, y transporta oxígeno a los órganos humanos. alteración significativa de su concentración en masa ([Hb]) me puede indicarcambios tabólica, enfermedad hepatobiliar y trastornos neurológicos, cardiovasculares y endocrinológicas ^1. Por lo tanto, [Hb] se mide de forma rutinaria en los análisis de sangre. En particular, los pacientes con anemia, los pacientes de diálisis, y las mujeres embarazadas se recomiendan fuertemente para vigilar [Hb] como una tarea fundamental ^2.

Así, se han desarrollado diversos métodos de detección [Hb]. El método de la hemoglobina cianuro, una de las técnicas más comunes para [Hb] cuantificación, emplea cianuro de potasio (KCN) para destruir la bicapa lipídica de los eritrocitos ^3. La hemoglobina cianuro producido por el exposiciones químicas de alta absorción alrededor de 540 nm; Así pues, [Hb] mediciones pueden realizarse a través de análisis colorimétrico. Este método es ampliamente empleado debido a su simplicidad, pero los productos químicos empleados (por ejemplo, KCN y óxido de dimethyllaurylamine) son tóxicos para los humanos y el medio ambiente. El esquema de hematocrito mide la relación en volumen de células rojas de la sangre en comparación con el total de la sangre volume través de la separación centrífuga; sin embargo, requiere un volumen de sangre relativamente grande (50 a 100 l) ^4. Espectrofotometría de métodos de medida [Hb] precisión, sin ningún producto químico, pero las mediciones de múltiples longitudes de onda y un volumen grande de sangre se requieren ^5,6. Del mismo modo, se han propuesto varios métodos ópticos para la medición de [Hb] incluidos los métodos de detección basados ​​en dispersión de luz, pero sus exactitudes de medición dependerá en gran medida de la precisión del modelo de sangre teórico.

Para superar estas limitaciones, recientemente se han propuesto métodos de detección [Hb] basados en el efecto fototérmica (PT) de Hb ^7. Hb, que está compuesta principalmente de óxidos de hierro, absorbe la luz a 532 nm y convierte la energía de la luz en calor ^8-10. Este aumento de temperatura PT puede detectarse ópticamente mediante la medición de un cambio en el índice de refracción (RI) de muestras de sangre. Yim et al. empleada dominio espectral de coherencia óptica reflectometry para medir el PT cambio de la longitud del recorrido óptico en una cámara ¹¹ que contiene sangre. Aunque el método permite la medición directa [Hb] libre de productos químicos y, el uso de un espectrómetro y una disposición interferométrico pueden obstaculizar su miniaturización. Recientemente hemos presentado un método alternativo de detección [Hb], denominado sensor de foto-térmica angular de dispersión de luz (PT-AS), que es más adecuado para la miniaturización del dispositivo ^12. El sensor PT-AS explota la alta sensibilidad RI de la interferometría de retrodispersión (BSI) para medir los cambios de PT de la RI de una muestra de sangre dentro de un tubo capilar. BSI se han utilizado para medir RI de diversas soluciones de ^13-15 y para monitorear las interacciones bioquímicas en solución libre ^16. El sensor PT-AS emplea a disposición óptica similar a la del BSI, pero combina la configuración de excitación fototérmica para medir el aumento de PT RI en muestras de sangre. Principios de funcionamiento de la BSI y los sensores PT-AS se describen en detalle en otra parte ^{12,15. PT-AS sensor demostró alta sensibilidad de medición [Hb] en un amplio rango de detección (0,35 a 17,9 g / dl) y es capaz de funcionar con volúmenes de muestra de <100 nl. No se requiere un preacondicionamiento de la muestra de sangre, y el tiempo de medición es solamente ~ 5 seg. A continuación, se describen la configuración experimental y un protocolo de medición detallada. Los resultados representativos PT-AS se proporcionan usando muestras de sangre de pacientes anémicos, y los resultados se comparan con los de un analizador de hematología para evaluar la precisión del sensor de PT-AS.}

Protocolo

Los experimentos con muestras de sangre se realizaron en cumplimiento de las leyes y directrices institucionales. Las muestras fueron las muestras de sangre residual que habían sido adquiridas y procesadas en los ensayos clínicos en la institución.

1. PT-AS Configuración óptico

NOTA: Se puede utilizar un tubo de micro-capilar de vacío para una configuración inicial PT-AS.

1. Montar un tubo de micro-capilar vacío con diámetros interior y exterior de 200 y 330 micras, respectivamente, y una longitud de más de ~ 5 cm en un accesorio de tubo capilar. accesorios de fibra comercialmente disponibles se pueden usar como el accesorio de tubo.
2. Segura anclar un puntero láser de 650 nm, es decir, la sonda fuente de luz, para iluminar el tubo capilar. El haz de sonda debe ser mayor que el tubo capilar. Coloque una pantalla (por ejemplo, papel blanco) por detrás del tubo capilar para observar un patrón periódico angular.
3. Para la parte de detección, quitar los lentes de una cámara web para capturar directamente el scattEring patrón. Coloque la cámara detrás del tubo capilar en un ángulo de 25-35 ° con respecto a la dirección del haz de la sonda. Asegúrese de que el patrón periódico angular producido por el tubo capilar se puede medir con el detector (Figura 1). Observe el patrón periódico angular en el medio del sensor de imagen cuando el sensor de imagen está colocada adecuadamente.
4. Posicionar una fuente de luz de excitación PT-532 nm para iluminar el tubo capilar. Coloque la fuente de luz PT en cualquier ángulo, siempre y cuando la luz de excitación se superpone con PT haz de sonda en el tubo capilar y no llega al detector directamente. excitación PT de muestras de sangre usando alta potencia óptica típicamente mejora la PT-AS sensibilidad, ya que conduce a un cambio mayor en la RI.
   1. Utilice la potencia óptica más alta de la fuente de luz de excitación PT empleado. Además, asegúrese de que la luz de excitación PT se superpone a la luz de la sonda en el tubo capilar. Utilice un tamaño de haz de la luz de excitación PTal menos dos veces la de la luz de la sonda para calentar todo el volumen de la sonda.
5. Coloque un filtro de paso largo en frente del detector para bloquear la luz de 532 nm y medir sólo la luz de la sonda de 650 nm.
6. Instalar una cuchilla óptica en la trayectoria de la luz de excitación PT antes de iluminar el tubo capilar. La cuchilla óptica se emplea para modular la intensidad PT luz de excitación.

Preparación de la muestra 2. Blood

1. Dibujar 6 ml de sangre total fresca en estado anémico en tubos de muestras de sangre de ácido etilendiaminotetraacético, y mezclar bien las muestras. No se requiere ningún otro proceso.
2. Medir las muestras de sangre utilizando el sensor PT-AS dentro de 24 h de extracción para evitar la coagulación.

3.-AS PT Protocolos de medición

1. Cargar un tubo de micro-capilar con una muestra de sangre para medir. Llenar el tubo capilar con la sangre a través de la acción capilar al colocar el tubo en el s sangreamplio. El volumen mínimo de muestra requerido para la medición se determina por el diámetro interior del tubo capilar y el tamaño del haz de la sonda.
   1. Emplear un tubo con un diámetro interior de 200 micras. El tamaño del haz de la sonda fue de 2 mm en los resultados representativos, lo que sugiere que la medición puede realizarse con un volumen de muestra de> 63 nl.
2. Montar el tubo capilar en la posición designada en el accesorio.
3. Encienda el láser sonda de 650 nm para iluminar el tubo capilar micro-cargado de sangre. El patrón periódico angular debe ser observado con la cámara web.
4. Encienda el 532-nm láser de excitación PT para iluminar el tubo.
5. Ejecutar la cuchilla óptica para modular la intensidad de la luz de excitación PT a 2 Hz.
   NOTA: La justificación de la selección de este estado de funcionamiento se describe en Discusión y Kim et al. ^12.
   1. Montar una rueda perforada en el conjunto de la cabeza del motor de la cuchilla ópticasistema.
   2. Encienda la caja de control del chopper, y utilice el mando de control en la consola para configurar la frecuencia de modulación.
   3. Ejecutar el helicóptero con el mando de control.
6. Registrar el patrón de dispersión fluctuante a través de la cámara web durante 5 segundos en formato MPEG-4 (MP4).

4. Procesamiento de Señales

NOTA: procesamiento de señales PT-AS se ha realizado mediante un código MATLAB desarrolladas en laboratorio.

1. Cargar el archivo de vídeo para extraer las imágenes. Para cada imagen [véase la figura 2 (a) para una imagen representativa], obtener el patrón de dispersión promediado mediante el cálculo de la media de los valores de los píxeles a lo largo de la dirección vertical [Figura 2 (b, c)].
2. Evaluar la transformada de Fourier del patrón de dispersión de promediado, y calcular la fase en la frecuencia espacial de pico. Realizar estas operaciones para todos los marcos de todas las imágenes grabadas.
3. Utilizando los valores de fase obtenidos de todas las imágenes, trazar la fase temporalfluctuación [Figura 2 (d)]. Tenga en cuenta que la fase fluctúa en la frecuencia de modulación PT. Tomar la transformada de Fourier de la fluctuación de fase en el dominio del tiempo, y la obtención de la magnitud en la frecuencia de modulación. Esta señal se conoce como el PT, como señal de [Figura 2 (e)].
4. Medir la [Hb] de una muestra de sangre mediante la conversión de su señal de PT-AS en el correspondiente [Hb] utilizando la curva de calibración que se obtiene en el Protocolo 5.

5. PT-AS calibración

1. Preparar muestras de sangre, que tiene [Hb] valores que se distribuyen de manera uniforme en el rango de detección del sensor PT-AS (por ejemplo, 0 a 18 g / dl).
2. Antes de la calibración, cuantificar los valores de [Hb] de las muestras usando un analizador de hematología de referencia. Medir las señales PT-A partir de las muestras.
3. Derivar una curva de calibración correspondiente [Hb] para la señal de PT-AS mediante la realización de un lineal de mínimos cuadrados encajan, [Hb] = A [PT-AS señal] + B, de los Experimental resultados. Para las condiciones de funcionamiento especificadas en la Tabla 1, se encontró que la relación entre la señal PT-AS [Hb] y ser [Hb] = 5,13 [señal de PT-AS] - 0,09. Utilice el código de MATLAB para realizar el ajuste lineal.

Resultados

Un ensayo de hemoglobina se realizó utilizando el sensor PT-AS, y sus mediciones se compararon con los de un analizador de hematología. El experimento se realizó con una intensidad de luz de excitación PT de 1,4 W / cm ^2, PT frecuencia de modulación de 2 Hz, y la medición de tiempo de 5 seg. La Tabla 1 resume las condiciones experimentales. Los tamaños de haz de la sonda y la excitación de la luz PT fueron del 5,5 y 2 mm, respectivamente. La cámara we...

Discusión

El sensor PT-AS representa un método totalmente óptico capaz de medir directamente la [Hb] de las muestras de sangre no procesada. El método cuantifica [Hb] en la sangre usando la respuesta PT intrínseca de las moléculas de hemoglobina en los eritrocitos. Bajo iluminación con luz de 532 nm, las moléculas de Hb absorben la energía de la luz y producen calor. El aumento de temperatura resultante cambia el RI de la muestra de sangre. La alta sensibilidad de RI de BSI fue explotada para medir este cambio de RI en la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
650 nm laser pointer	LASMAC	LED-1	Probe light
Hollow round glass capillaries	VitroCom	CV2033	Blood sample container
Webcam	Logitech	C525	CMOS optical sensor
Optical chopper system	Thorlabs	MC2000-EC	Optical chopper
Plastic long-pass filter	Edmund Optics	#43-942	To reject 532-nm PT excitation light
Fiber clamp	Thorlabs	SM1F1-250	Capillary tube fixture
EDTA coated blood sampling tube	Greiner Bio-One	VACUETTE 454217	Blood sampling & anticoagulating
Hematology analyzer	Siemens AG	ADVIA 2120i	Reference hematology analyzer