Fototermal Eğik ışık saçılımı ile hızlı ve Kimyasal içermeyen Hemoglobin Deneyi

Özet

A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

Özet

Foto-termal açısal ışık saçılması (PT-AS) kan örnekleri hemoglobin konsantrasyonu ([Hb]) ölçmek için yeni bir optik bir yöntemdir. Hemoglobin moleküllerin içsel fototermal yanıtı temelinde, sensör yüksek hassasiyetli, [Hb] kimyasal içermeyen ölçüm sağlar. [Hb] 0.35 aralığında 0.12 gr / dl sınır ile algılama yeteneği - 17.9 g / dl, daha önce ortaya konmuştur. yöntem kolayca böyle bir lazer pointer ve bir web kamerası olarak ucuz tüketici elektronik cihazları kullanılarak uygulanabilir. Kan kap gibi bir mikro-kapiller tüpün kullanılması da nanolitre ölçekli kan hacmi ve düşük işletme maliyeti Hemoglobin analizi sağlar. Burada, PT-AS optik kurulum ve sinyal işleme işlemleri için ayrıntılı talimatlar sunulmaktadır. Deney protokolleri ve anemi rahatsızlıkları kan örnekleri için temsil edici sonuçları ([Hb] = 5.3, 7.5, ve 9.9 g / dl) da sağlanmıştır, ve ölçümler, bu ileri geri karşılaştırılmıştırma hematoloji analizörü. uygulanması ve operasyonda sadeliği klinik laboratuarlar ve kaynak sınırlı ortamlarda geniş benimsenmesini sağlamalıdır.

Giriş

Bir kan testi yaygın genel insan sağlığını değerlendirmek ve belirli hastalıklarla ilgili Biyobelirteçleri tespit etmek için yapılır. Örneğin, kandaki kolesterol konsantrasyonu yakından kalp damar hastalıkları ve pankreatit ile ilgilidir, hiperlipidemi için bir kriter olarak hizmet vermektedir. glikoz düzeyi diyabetik ketoasidoz ve hiperglisemik hiperozmolar sendromu gibi komplikasyonlar ile ilişkili olarak kan şekeri içeriği, sık sık ölçülmelidir. sıtma, insan immün yetmezlik virüsü ve edinilmiş bağışıklık yetersizliği sendromu gibi ciddi hastalıklar, kan bulguları ile de teşhis ve eritrosit, trombosit dahil olmak üzere kan bileşenlerinin ölçümü ve lökosit pankreatik ve böbrek hastalıklarının taraması sağlar edilir.

Hemoglobin (Hb), kan kritik bir bileşeni, eritrositlerin yaklaşık% 96 yapar, ve insan organlara oksijen taşır. kitle konsantrasyonunun önemli değişiklik ([Hb]) Bana gösterebilirtabolic değişiklikler, hepatobiliyer hastalık ve nörolojik kardiyovasküler ve endokrinolojik bozukluklar ^1. [Hb] Bu nedenle rutin kan testleri ile ölçülür. Özellikle, anemik hastalar, diyaliz hastalarında ve hamile kadınlar güçlü bir hayati görev ² olarak [Hb] izlemek için tavsiye edilir.

Çeşitli [Hb] saptama yöntemleri, böylece geliştirilmiştir. Hemoglobin siyanür yöntem olup, [Hb] ölçümü için en yaygın tekniklerden biri, potasyum siyanid (KCN), eritrositlerin ³ lipid ikili katmanı yok etmek için kullanmaktadır. 540 nm civarında kimyasal sergileyen, yüksek emme ile üretilen siyanid hemoglobin; dolayısıyla, [Hb] ölçümleri kolorimetrik analizi ile yapılabilir. Bu yöntem yaygın olarak sadeliği sayesinde istihdam, ancak kullanılan kimyasallar (örneğin, KCN ve dimethyllaurylamine oksit) insanlar ve çevre için zehirli olduğunu. hematokrit Şema total kan vol kıyasla kırmızı kan hücrelerinin hacmi oranını ölçersantrifüjle ayırma yoluyla ume; Ancak bu nispeten büyük bir kan hacmi (50-100 ul), ⁴ gerektirir. Spektrofotometri yöntemleri tedbir [Hb] kesinlikle herhangi bir kimyasal olmadan, ancak birden fazla dalga boylarına ve büyük bir kan hacminde ölçümler ^5,6 gereklidir. Benzer şekilde, [Hb] ölçmek için çeşitli optik yöntemler ışık saçılması dayalı algılama yöntemleri dahil olmak üzere ileri sürülmüştür, ancak ölçüm doğrulukları teorik kan modelinin doğruluğuna kuvvetle bağlıdır.

Bu sınırlamaları aşmak için, Hb fototermal (PT) etkisine dayanan [Hb] saptama yöntemleri son zamanlarda ⁷ ileri sürülmüştür. Ağırlıklı olarak demir oksitler oluşur Hb, 532 nm de ışığı absorbe ve ısı ^8-10 içine ışık enerjisini dönüştürür. Bu PT sıcaklık artışı kan örnekleri kırılma indeksi (RI) bir değişimin ölçülmesi optik olarak tespit edilebilir. Yım ve ark. istihdam spektral domain optik koherens reflectometrY, bir kan içeren bölme ¹¹ PT optik yol uzunluk değişimi ölçülür. yöntem kimyasal madde içermeyen ve doğrudan [Hb] ölçüm sağlasa, bir spektrometre kullanımı ve interferometrik düzenleme onun minyatür engelleyebilir. Son zamanlarda, alternatif [Hb] algılama yöntemi sunulmaktadır cihazı minyatürleştirme ¹² için daha uygundur verilmedi termal açısal ışık saçılımı (PT-AS) sensör olarak adlandırılan. PT-AS sensörü kılcal tüp içinde bir kan örneğinin RI PT değişiklikleri ölçmek için geri saçılma interferometre (BSI) yüksek UR hassasiyetini patlatır. BSI çeşitli çözümler ^13-15 RI ölçmek ve ücretsiz bir çözüm ¹⁶ biyokimyasal etkileşimler izlemek için kullanılmıştır. PT-AS sensör BSI gibi benzer optik düzenlemeyi istihdam ancak kan örneklerinde RI PT artışı ölçmek için fototermal uyarma kurulumu birleştirir. BSI ve PT-AS sensörlerin çalışma prensipleri başka yerlerde ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ^{12,15. PT-AS sensörü geniş bir algılama aralığı (,35-17,9 g / dL) üzerinde yüksek hassasiyetli [Hb] Ölçümü gösterdi ve <100 nl örnek hacimleri ile çalışan yeteneğine sahiptir. kan örneği yok önkoşullanma gereklidir ve ölçüm süresi sadece ~ 5 sn. Burada, deney düzeneği ve detaylı bir ölçüm protokolü tarif edilmiştir. Temsilci PT-AS sonuçları anemik hastalarda kan örnekleri kullanılarak sağlanır ve sonuçlar PT-AS sensörünün doğruluğunu değerlendirmek için bir hematoloji analizörü gelenler karşılaştırılır.}

Protokol

Kan örnekleri ile deneyler, ilgili yasa ve kurumsal kurallarına uygun olarak yapılmıştır. Numuneler edinilen ve kurumda klinik testlerde işlenen olmuştu artık kan örnekleri vardı.

1. PT-AS Optik Kur

NOT: Bir ilk PT-AS kurulumu için boş bir mikro-kapiller tüp kullanabilirsiniz.

1. sırasıyla, 200 ve 330 um, iç ve dış çaplara sahip boş mikro kapiller tüp ve bir kılcal tüp armatürü daha büyük 5 ~ daha cm uzunluğunda monte edin. Ticari olarak temin edilebilen lif fikstür tüp fikstür olarak kullanılabilir.
2. Güvenli kılcal tüp aydınlatmak için, ışık kaynağını soruşturma, yani 650 nm lazer pointer çapa. Sonda kiriş kılcal boru daha büyük olmalıdır. Açısal periyodik desen gözlemlemek için kılcal boru arkasında bir ekran (örneğin, beyaz kağıt) yerleştirin.
3. Algılama parçası için, doğrudan Scatt yakalamak için bir web kamerası herhangi lensleri çıkarındesen ering. Prob ışını yönüne 25-35 ° 'lik bir açı ile kılcal boru arkasında kamerası yerleştirin. Kılcal boru tarafından üretilen açısal periyodik desen dedektörü (Şekil 1) ile ölçülebilir emin olun. görüntü sensörü düzgün konumlandırılmış görüntü sensörünün ortasında açısal periyodik desen gözlemlemek.
4. kılcal tüp aydınlatmak için bir 532-nm PT uyarma ışık kaynağı yerleştirin. sürece PT uyarma ışık kılcal tüp prob ışını ile örtüşür ve doğrudan dedektör bulmuyor olarak, herhangi bir açıda PT ışık kaynağını yerleştirin. o RI büyük bir değişikliğe yol açar tipik olarak yüksek optik gücünü kullanarak kan örnekleri PT uyarma, PT-AS duyarlılık geliştirir.
   1. Kullanılan PT uyarma ışık kaynağının en yüksek optik gücünü kullanın. Buna ek olarak, PT uyarma ışık kılcal tüp prob ışık örtüşür emin olun. PT uyarma ışık demeti boyutu kullanınen az iki kez prob ışık o tüm prob hacmi ısıtmak için.
5. 532-nm ışığı bloke ve sadece 650-nm prob ışığı ölçmek için dedektör önünde uzun geçiren filtre yerleştirin.
6. kılcal tüp aydınlatıcı önce PT uyarma ışık yolunda bir optik helikopteri takın. Optik kıyıcı PT uyarma ışık yoğunluğunu modüle etmek için kullanılır.

2. Kan Numune Hazırlama

1. etilendiamintetraasetik asit kan örnekleme tüpleri içine anemik durumda taze tam kan 6 ml çizin ve iyi örnekleri karıştırın. Başka hiçbir işlem gereklidir.
2. pıhtılaşmasını önlemek için çıkarıldığı 24 saat içinde PT-AS sensörü kullanılarak kan örnekleri ölçün.

3. PT-AS Ölçüm Protokolleri

1. ölçmek için bir kan örneği ile, bir mikro-kapiller tüp yükleyin. Kan S içine tüp yerleştirme kılcal etki aracılığıyla kanla kılcal tüp doldurunbol. ölçüm için gerekli olan minimum numune hacmi kılcal tüpün iç çapı ve sonda kiriş boyutu tarafından belirlenir.
   1. 200 um arasında bir iç çapa sahip bir tüp çalıştırmak. Prob ışını boyutu ölçümü> 63 nl bir numune hacmi ile yapılabilir düşündüren, Örnek sonuçları 2 mm idi.
2. fikstür belirlenen pozisyonda kılcal tüp monte edin.
3. Kan yüklü mikro-kapiller tüp aydınlatmak için 650 nm prob Lazer açın. açısal periyodik desen kamerası ile dikkat edilmelidir.
4. tüp aydınlatmak için 532 nm PT uyarma Lazer açın.
5. 2 Hz PT uyarma ışık yoğunluğunu modüle optik helikopter çalıştırın.
   NOT: Bu çalışma koşulunda seçimi için gerekçe tartışma ve Kim et al açıklanmaktadır. ^12.
   1. Optik kıyıcı motor kafası düzeneğinde bir kıyıcı tekerlek monte edinsistemi.
   2. kıyıcı kontrol kutusu açın ve modülasyon frekansını ayarlamak için konsoldaki kontrol düğmesini kullanın.
   3. Kontrol düğmesini kullanarak helikopteri çalıştırın.
6. MPEG-4 (mp4) formatında 5 saniye web kamerası aracılığıyla dalgalanan saçılma desen kaydedin.

4. Sinyal İşleme

NOT: PT-AS sinyal işleme laboratuvar tarafından geliştirilen MATLAB kodu kullanılarak gerçekleştirildi.

1. görüntüleri ayıklamak için video dosyasını yükleyin. Her görüntü için, dikey doğrultu boyunca piksel değerlerinin ortalamasını hesaplayarak ortalama dağılma modeli elde [temsili bir görüntü için şekil 2 (a) 'e bakınız] [Şekil 2 (b, c)].
2. Fourier ortalama saçılma desen dönüşümü değerlendirmek ve tepe mekansal frekansta faz hesaplamak. tüm kaydedilmiş tüm görüntüleri kare için bu işlemleri gerçekleştirmek.
3. tüm görüntüleri elde edilen faz değerlerini kullanarak, zamansal faz arsadalgalanma [Şekil 2 (d)]. faz PT modülasyon frekansı dalgalanır unutmayın. Fourier modülasyon frekansında büyüklüğünü zaman alanında faz dalgalanma dönüşümü ve elde atın. Bu sinyal, PT-gibi sinyal olarak adlandırılır [Şekil 2 (e)].
4. içine PT-gibi sinyal dönüştürerek bir kan örneğinin [Hb] ölçün Protokol 5'de elde edilen kalibrasyon eğrisi kullanılarak [Hb] gelir.

5. PT-AS Kalibrasyon

1. (- 18 g / dL, örneğin 0) [Hb] eşit PT-AS sensörün algılama aralığında dağıtılan değerlerine sahip olan, kan örnekleri hazırlayın.
2. Kalibrasyon önce bir referans hematoloji analizörü kullanarak numunelerin [Hb] değerleri ölçmek. Örneklerin PT-AS sinyalleri ölçün.
3. experimenta kalibrasyon en küçük kareler uygun doğrusal gerçekleştirerek PT-AS sinyaline [Hb] ilişkin eğri, [hemoglobin] = A [PT-AS Sinyali] + B, türetmekl sonuçlanır. Tablo 1'de belirtilen çalışma koşulları için, [Hb] ve PT-AS sinyali arasındaki ilişki [Hb] olduğu saptanmıştır = 5.13 [PT-AS sinyali] - 0.09. doğrusal uyum gerçekleştirmek için MATLAB kodu kullanın.

Sonuçlar

Bir hemoglobin tahlil PT-AS sensörü kullanılarak gerçekleştirildi ve onun ölçümler hematoloji analizörü gelenler ile karşılaştırıldı. Deney 1.4 W / cm ² 5 sn PT modülasyonu 2 Hz frekans ve ölçüm süresi bir PT uyarma ışık yoğunluğu ile gerçekleştirilmiştir. Tablo 1 deney koşullarını özetler. Sonda ve PT uyarma ışık demeti boyutları sırasıyla 5,5 ve 2 mm idi. web kamerası 30 fps kare hızında kaydedilen görüntüleri. ö...

Tartışmalar

PT-AS sensörü işlenmemiş kan örneklerinin direkt [Hb] ölçüm yapabilen bir all-optik yöntem temsil eder. yöntem eritrositler hemoglobin moleküllerinin içsel PT yanıtını kullanarak kanda [Hb] rakamlarla. 532-nm ışık ile aydınlatma altında, Hb molekülleri ışık enerjisini emer ve ısı üretirler. Elde edilen sıcaklık yükselmesi kan örneği RI değiştirir. BSI yüksek RI duyarlılığı kanda bu RI değişimi ölçmek için istismar edilmiştir. Daha önce, PT-sensör piyasada ticari [Hb] sensö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
650 nm laser pointer	LASMAC	LED-1	Probe light
Hollow round glass capillaries	VitroCom	CV2033	Blood sample container
Webcam	Logitech	C525	CMOS optical sensor
Optical chopper system	Thorlabs	MC2000-EC	Optical chopper
Plastic long-pass filter	Edmund Optics	#43-942	To reject 532-nm PT excitation light
Fiber clamp	Thorlabs	SM1F1-250	Capillary tube fixture
EDTA coated blood sampling tube	Greiner Bio-One	VACUETTE 454217	Blood sampling & anticoagulating
Hematology analyzer	Siemens AG	ADVIA 2120i	Reference hematology analyzer