JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Abstract

كشف دقيق وتحديد الطفرات التردد المنخفض يمكن أن يكون مشكلة عند تقييم مرض المتبقية بعد العلاج، والكشف عن الطفرات المقاومة الناشئة خلال فترة العلاج، أو عند المرضى الذين لديهم عدد قليل من تعميم الخلايا السرطانية. النوع البري منع PCR تليها تحليل التسلسل يوفر حساسية عالية، والمرونة، والبساطة كمنهجية للكشف عن هذه الطفرات التردد المنخفض. بإضافة مصممة خصيصا مقفل الحمض النووي النوكليوتيد لفحص تسلسل PCR أساس تقليدي جديد أو سابقا المعمول بها، الحساسيات ما يقرب من 1 أليل متحولة في خلفية من 1000 الأليلات WT يمكن أن يتحقق (1: 1000). التحف التسلسل المرتبطة بالأحداث نزع الأمين توجد عادة في الفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة يمكن معالجتها جزئيا عن طريق استخدام glycosylase DNA اليوراسيل خلال خطوات استخراج. بروتوكول الأمثل هنا هو محدد للكشف عن MYD88 الطفرة، ولكن يمكن أن تكون بمثابة نموذج لتصميم أيWTB-PCR الفحص. مزايا الفحص WTB-PCR على فحوصات أخرى تستخدم عادة للكشف عن الطفرات ذات التردد المنخفض بما فيها أليل محددة PCR في الوقت الحقيقي والكمي PCR تشمل الحوادث أقل من ايجابيات كاذبة، وزيادة المرونة وسهولة التنفيذ، والقدرة على كشف كل معروف والطفرات غير معروفة.

Introduction

وكان سانجر تسلسل تقليديا معيار الذهب في اختبار لكل من الطفرات الجسدية المعروفة وغير المعروفة. واحد من أوجه القصور في سانجر التسلسل هو الحد الأقصى لها من الكشف (~ 10-20٪ أليل متحولة في خلفية WT) 1. هذا المستوى من الحساسية غير مناسب للكشف عن الطفرات الجسدية المستوى المنخفض التي قد تكون موجودة في عينات من أنسجة ما قبل سرطان أو المرضى الذين يعانون من بعض تعميم الخلايا السرطانية، أو عندما نخاع العظم (BM) غير متجانس. وهذا أيضا يجعل تقييم المرض المتبقية بعد العلاج أو الكشف عن الطفرات المقاومة الناشئة خلال فترة العلاج الصعبة التي التسلسل التقليدي وحده 2. من خلال استبدال PCR التقليدية مع الحمض النووي مقفل (LNA) بوساطة من النوع البري منع PCR (WTB-PCR) في سانجر تسلسل والحساسيات تصل إلى 0.1٪ أليل متحولة في خلفية WT يمكن أن يتحقق 2 و 3 و 4. فيWTB-PCR، ويتحقق إثراء لالأليلات متحولة عن طريق إضافة قصيرة (~ 10-14 NT) منع (LNA) النوكليوتيد التي ترتبط بشكل تفضيلي WT DNA وبالتالي منع التضخيم من WT DNA. والتخصيب المنتج WTB-PCR متحولة يمكن بعد ذلك التسلسل. من خلال منع WT DNA بدلا من اختيار للطفرات محددة WTB-PCR يسمح لتخصيب كل من الطفرات المعروفة وغير المعروفة الموجودة في أجزاء الخلية دقيقة.

وتستخدم أساليب متعددة في الوقت الحالي للكشف عن الطفرات في خلايا صغيرة كسور. وهذا يشمل PCR، التضخيم الحرارية نظام أليل محددة طفرة (ARMS)، تغيير طبيعة عالية الأداء اللوني السائل (DHPLC)، والخرز، والمستحلبات، والتضخيم، والمغناطيسية (مبتهجا)، الكهربائية الإفراج الناجم عن الميدان والقياس (EFIRM)، وارتفاع القرار نقطة انصهار وغيرها. ومع ذلك، فإن معظم هذه الأساليب تقتصر كل ايجابيات كاذبة والقدرة على كشف فقط طفرة واحدة التي تم تصميمها الفحص لمدة 4 . WTB-PCR، ومع ذلك، تسمح للمستخدم تصور آثار التسلسل الذي يمكن من اكتشاف أنواع الطفرات متعددة ويمكن أن تساعد في استبعاد ايجابيات كاذبة بسبب القطع الأثرية أو الأحداث نزع الأمين. الجيل التالي من التسلسل (خ ع) قد تقدم بديلا مناسبا لالتسلسل التقليدي، ومع ذلك، أكبر بكثير التكاليف والتعقيد وقتا أطول فحص تجعلها خيارا غير ضروري بالنسبة لكثير من أنواع المرض مع بعض الواسمات الجزيئية متميزة أو لرصد المرضى على العلاج لالناشئة الطفرات المقاومة. وعلاوة على ذلك، فإن معدلات إيجابية كاذبة عالية عندما يكتشف المتغيرات مع الترددات أليل متحولة أقل من 5٪، يمكن أن تشكل مشكلة بالنسبة NGS القائم على amplicon 5، 6.

نحن هنا لشرح الزيادة في الحساسية WTB-PCR الذي تحقق في الكشف عن الطفرات في التمايز النخاعي عامل 88 الجين كما وصفها البيطار وآخرون. 3 MYD88 mutatioنانوثانية هي العوامل التشخيصية والنذير مهمة في مرض فالدنشتروم (WM)، الغلوبولين المناعي وحيدة النسيلة اعتلال غامائي من أهمية مجهولة (الغلوبولين المناعي-MGUS)، الطحال الغدد الليمفاوية منطقة هامشية (SMZL)، ومنتشر كبير سرطان الغدد الليمفاوية B-الخلية (DLBCL). تم العثور على الطفرات MYD88 تقريبا في جميع حالات WM، وحوالي 50٪ من المرضى الذين يعانون المناعي M (الغلوبولين المناعي) -secreting MGUS. متضارب، تم العثور على الطفرات MYD88 في المائة فقط 0-6 المرضى الذين يعانون من SMZL وغائبة في المايلوما المتعددة 7 و 8. بسبب تداخل المورفولوجية، immunophenotypic، خلوي، والخصائص السريرية بين WM وSMZL أو المايلوما الغلوبولين المناعي-متعددة يمكن في كثير من الأحيان إلى تعقيد تشخيصات تفريقية، وجود طفرة MYD88 قد يكون بمثابة عامل تحديد المفيد 9. كما تم المرتبطة الطفرات MYD88 مع عبئا أكبر المرض في المرضى الذين يعانون من DLBCL وضعف البقاء على قيد الحياة بعد العلاج 7، 10. بالإضافة إلى ذلك، لأن الطفرات MYD88 هي أكثر كثيرا ما وجدت في مثل B-الخلية (ABC) DLBCL تفعيلها من مركز جرثومي B-الخلية مثل (GCB) DLBCL أو الأساسي سرطان الغدد الليمفاوية المنصفية B-الخلية (PMBL)، MYD88 وضع طفرة قد تكون بمثابة علامة بديلة لنوع فرعي ABC 11 و 12.

بروتوكول مفصل المقدمة هنا بمثابة القالب الذي يمكن تطويرها فحوصات جديدة أو معظم فحوصات تسلسل القائمة يمكن أن تتكيف بسهولة مع الكشف بدقة الطفرات التردد المنخفض في مختلف أنواع العينة. ويمكن أيضا أن النهج أن تستخدم لرصد واكتشاف الطفرات المقاومة التي قد تتطور في أورام أو حتى البكتيريا التي قد تتطور بينما يعالج المرضى مع العلاج الموجه أو المضادات الحيوية. وعلاوة على ذلك، فإنه يتناول وسائل الانتصاف العديد من القضايا المرتبطة بتخصيب طفرة، ولا سيما في الأنسجة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE).

Protocol

أخلاقيات الإعلان: تم تنفيذ جميع اختبار العينات البشرية بعد الحصول المؤسسي مجلس مراجعة (IRB) موافقة.

1. استخراج الحمض النووي من FFPE الأنسجة، الدم المحيطي، ونخاع العظم نضح

  1. لالعظام الأنسجة نخاع FFPE مع DNA FFPE عدة استخراج
    1. تبدأ الأنسجة FFPE من الشرائح غير ملوثين (5-10 أقسام في 5-10 سمك ميكرون).
      ملاحظة: إذا بداية مع حلاقات الأنسجة، واستخدام 3-6 أقسام في 5-10 ميكرون سمك وانتقل إلى الخطوة 1.1.6.
    2. وضع الشرائح في سلة الشرائح وإعداد أربعة خزانات غسيل (اثنان للالزيلين واثنين لمدة 100٪ كحول). إضافة حد أدنى لحجم 600 مل من محلول لكل سلة.
    3. Deparaffinize الشرائح عن طريق القيام غسل زيلين 5 دقائق في علبة الأولى. نقل الشرائح إلى الثاني خزان غسل الزيلين لمدة 5 دقائق إضافية.
    4. بعد deparaffinization، وغسل الشرائح مع 100٪ الكحول لمدة 5 دقائق. نقل الشرائح إلى الثانيالكحول خزان غسل لمدة 5 دقائق إضافية.
    5. السماح للشرائح حتى يجف تماما تحت غطاء قبل إلغاء منهم بشفرة حلاقة في أنبوب microcentrifuge.
      ملاحظة: إذا كان شريحة H & E مع منطقة الورم أشارت متاح، والمواءمة بين الشرائح وكشط فقط منطقة الورم.
    6. المضي قدما تعليمات من صدقة المصنعة المدرجة في المجموعة.
  2. لBM نضح والدم المحيطي
    1. استخراج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة صدقة مع هذه المواصفات.
      ملاحظة: هناك العديد من مجموعات وطرق استخراج الحمض النووي من الأنسجة والخلايا FFPE المتاحة تجاريا. عمليا، يمكن للجميع استخدامها. استخدام أسلوب التي يتم تأسيسها في المختبر.
      1. استخدام 200 ميكرولتر الدم المحيطي (PB) أو 100 ميكرولتر BM + 100 ميكرولتر PBS.
      2. استخدام 4 ميكرولتر ريبونوكلياز حل الأسهم.
      3. أزل مع شطف العازلة 100 ميكرولتر.
  3. الكمي DNA
    1. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام معمل ضمان 260 نانومتر / 280 نيوتن متر من نسبة ما يقرب من 1.8 (لDNA النقي). وإذا كانت النسبة أقل بشكل ملحوظ، قد تشير إلى وجود بروتين، الفينول، أو غيرها من الملوثات التي قد تتداخل مع تطبيقات المصب.
    2. ضبط تركيز الحمض النووي لحوالي 50-100 نانوغرام / ميكرولتر مع شطف العازلة المناسبة.

2. البرية من نوع حجب PCR

  1. التصميم التمهيدي
    1. ووصفت تصميم والحصول على الاشعال للجينات الفائدة وفقا لسبق المبادئ التوجيهية العامة من PCR التصميم التمهيدي 13. تشمل M13 إلى الأمام وعكس الاشعال التسلسل العالمية في الاشعال PCR.
      "تم تصميم المنطقة intronic تتضاعف لتغطية لصق موقع وجزء من إنترون 4. إلى الأمام وعكس الاشعال مع 5" و 110 النيوكليوتيدات الموجودة في 5 - وقد تم تطوير هذا الفحص MYD88 لتضخيم اكسون 5 من MYD88 (N291 G259): ملاحظة -M13 تسلسل (M13 إلى الأمام: TGT AAA ACG ACG دول مجلس التعاون الخليجي AGT. M13-الاتجاه المعاكس: CAG غا هيئة مكافحة الفساد GCT ATG ACC) للسماح الصلب من الاشعال التسلسل التكميلية (انظر المواد الجدول).
  2. مغلق الحمض النووي تصميم قليل النوكليوتيد
    1. تصميم النوكليوتيد منع أن ما يقرب من 10-15 قواعد في طول ومكملة لقالب WT حيث هو المطلوب تخصيب متحولة.
      ملاحظة: سوف جزئية أقصر تحسين التمييز عدم تطابق. لتحقيق درجة عالية من الدقة الهدف، فمن المهم عدم استخدام الكثير من النيوكليوتيدات حجب لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى النوكليوتيد جدا "لزجة". محتوى وطول ومنع النوكليوتيدات ينبغي أن يكون تحسين وفقا لالنوكليوتيدات المحددة التي تحتاج إلى المحظورة. ومن المهم لتحقيق خصوصية ملزمة عالية دون المساس هيكل الثانوي والمخاطرة التكامل الذاتي.
    2. تصميم بنسبة ضئيلة منع أن يكون T م 10-15 ° C فوق temperat تمديدلدى عودتهم خلال التدوير الحراري thermocycling. ضبط T م وذلك بإضافة أو إزالة قواعد منع أو عن طريق استبدال قواعد حظر ل DNA مع تجنب فترات طويلة (3-4 قواعد) بعرقلة G أو C القواعد.
      1. انتقل إلى موقع أدوات بنسبة ضئيلة (انظر جدول المواد) وحدد أداة "عرقلة جزئية تيم التنبؤ".
      2. لصق تسلسل القالب WT هذا هو المطلوب ليكون قد تم حظره في مربع "جزئية تسلسل". إضافة "+" أمام قواعد للإشارة إلى قواعد مانع.
      3. حدد زر "حساب" لتحديد تقريبي T م الهجين DNA-مانع.
    3. تصميم بنسبة ضئيلة عرقلة لتجنب تشكيل هيكل الثانوي أو dimers الذاتي.
      1. انتقل إلى موقع أدوات بنسبة ضئيلة (انظر جدول المواد) وحدد أداة "عرقلة محسن جزئية".
      2. لصق تسلسل القالب WT هذا هو المطلوب ليكون قد تم حظره في مربع. إضافة "+" أمام قواعد للإشارة إلى عرقلة القواعد.
      3. حدد خانات اثنين ل "هيكل الثانوي" و "النفس فقط". اضغط على زر تحليل لمراجعة جزئية لهياكل الثانوية يحتمل أن تكون مزعجة أو dimers الذاتي.
        ملاحظة: عشرات تمثل تقديرات تقريبية جدا من T م الصورة من الهياكل الثانوية وdimers الذاتي. انخفاض درجات بالتالي فهي أفضل ويمكن أن يتحقق عن طريق الحد من مانع مانع الاقتران. قليل النوكليوتيد عرقلة لMYD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + CC / invdT /)] وقد صمم لتغطية الأحماض الأمينية Q262-I266 ويتميز 3'مقلوب DT لمنع كل من التمديد البلمرة DNA والتدهور التي كتبها 3'-نوكلياز خارجية. هذه جزئية حجب محددة هي 17mer مع 10 قواعد منع والتي يرمز لها "+ N". 7 قواعد المتبقية هي النيوكليوتيدات DNA العادية.
  3. إعداد WTB-PCR والتدوير الحراري thermocycling
    1. إعداد WTB-PCR ميل الماجستيرس (MMX) باستخدام 2.5 ميكرولتر PCR رد فعل العازلة 10X ث / 20 ملي MgCl 2، 250 ميكرومتر dNTPs، 0.2 ميكرومتر إلى الأمام وعكس التمهيدي، 1.2 ميكرومتر MYD88blocker، والدناز، خالية من ريبونوكلياز، H فائقة النقي 2 O لخلق النهائي حجم حل من 21.75 ميكرولتر في رد الفعل.
      ملاحظة: العمل التركيزات لحجم رد الفعل النهائي من 25 ميكرولتر (بعد إضافة قالب DNA والبلمرة). يتم إعداد التقليدية PCR MMX ببساطة عن طريق حذف إضافة مانع. تبقى جميع الخطوات بروتوكول متطابقة لكلا WTB وPCR التقليدية. وهذا يمكن أن تستخدم في التحقق من صحة وتحديد تخصيب يتحقق عن طريق إضافة مانع.
      1. عند حساب كمية MMX للتحضير للتأكد من حساب لمدة 3 ردود الفعل إضافية (الضوابط الإيجابية والسلبية والتحكم غير القالب للتحقق من التلوث) وعلى الأقل 1 رد فعل إضافي للخطأ pipetting ل.
    2. دوامة MMX بدقة. ويمكن تخزين MMX في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ayالأذن.
    3. إضافة 0.25 البلمرة ميكرولتر طق DNA في رد فعل على MMX وعكس إلى المزيج. مرة واحدة تم إضافة البلمرة إلى MMX، ويبقيه على الجليد.
    4. وضع 96 لوحة PCR جيدا جديدة على طبق من ذهب الباردة وماصة 22 ميكرولتر من MMX مع البلمرة إلى كل رد فعل جيدا.
    5. إضافة 3 ميكرولتر الحمض النووي الجيني (50-100 نانوغرام / ميكرولتر إلى كل من الآبار التي تحتوي على MMX مع البلمرة.
    6. ختم لوحة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لضمان حل يصل الجزء السفلي من كل بئر.
    7. تحميل لوحة PCR على thermocycler.
      1. تهيئة الظروف التدوير الحراري thermocycling للتفاعل WTB-PCR على النحو التالي: تمسخ الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 6 دقائق. 40 دورات تمسخ في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، التمهيدي الصلب عند 56 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، والإرشاد عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة 20 ثانية. تمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
        ملاحظة: تتضمن أفضل الممارسات استكمال ما تبقى من البروتوكول في منطقة منفصلة جسديا لتجنب التلوث amplicon طن الاجهزة المستقبلية.
  4. أداء هلام الكهربائي وفقا لبروتوكولات الموصوفة سابقا 14 من أجل تحديد ما إذا كان WTB-PCR ناجحة ولتأكيد عدم وجود تضخيم في السيطرة غير القالب.
  5. تنقية PCR المنتج من حبات مغناطيسية
    1. إزالة حبات مغناطيسية من 4 ° C وتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. نقل 10 ميكرولتر منتج PCR إلى لوحة PCR جديدة.
    3. دوامة حبات مغناطيسية بقوة لإعادة تعليق كامل الجسيمات المغناطيسية.
    4. إضافة 18 ميكرولتر حبات مغناطيسية إلى كل بئر على لوحة جديدة. ماصة مزيج 10 مرات.
    5. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    6. وضع لوحة PCR على لوحة المغناطيس-تلتف الجانب لمدة 2 دقيقة إلى حبات منفصلة عن حل.
    7. نضح طاف مع ماصة الأقنية، وتجنب بيليه حبة.
    8. الاستغناء عن 150 ميكرولتر الايثانول 70٪ في كل بئر ويحضن في درجة حرارة الغرفة FOص لا يقل عن 30 ثانية. نضح الإيثانول مع ماصة الأقنية وتجاهل النصائح. كرر هذا الإجراء الغسيل مرة أخرى.
    9. باستخدام 20 ميكرولتر ماصة الأقنية نضح الإيثانول المتبقية من كل بئر وتجاهل النصائح.
    10. مرة واحدة آبار جافة (~ 10 دقيقة)، وترفع من لوحة المغناطيس وإضافة 40 ميكرولتر المياه مجانا نوكلياز إلى كل المزيج جيدا وماصة 15 مرات أو دوامة بلطف.
    11. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    12. وضع لوحة PCR على لوحة المغناطيس لمدة 1 دقيقة إلى حبات منفصلة عن حل.
    13. نقل 35 ميكرولتر من الناتج النقي إلى لوحة PCR جديدة. هذا هو تنقية المنتج PCR هو الآن على استعداد للشروع في التسلسل ثنائي الاتجاه أو يمكن تخزينها في -20 ° C لحين الحاجة إليها.
      ملاحظة: عند تطوير فحص جديد، قد تكون هناك حاجة الكمي من الناتج PCR المنقى. 1-3 نانوغرام / ميكرولتر amplicon DNA هو الأمثل لتسلسل ثنائية الاتجاه. إذا تركيز منخفض باستمرار، وزيادة المنتجات والمغناطيسية الخرز PCR proportionally (1: 1.8). إذا تركيز مرتفع باستمرار، أزل مع كمية أكبر من المياه.

3. تسلسل WTB-PCR المنتج

  1. ثنائي الاتجاه تسلسل
    ملاحظة: بروتوكول التالي هو صيغة معدلة من إرشادات الشركة المصنعة التي تم الأمثل لاستخدام عدد أقل من المواد الكيميائية.
    1. إعداد الأمام وعكس رد فعل التسلسل يمزج مع 0.25 ميكرولتر جاهزة مزيج من ردود الفعل، 1.88 ميكرولتر تسلسل العازلة، 1.78 ميكرومتر M13-F أو M13-R الاشعال التسلسل وإضافة والدناز، ريبونوكلياز خالية، H فائقة النقي 2 O لإيجاد حل نهائي حجم 9 ميكرولتر في رد الفعل. هذا المزيج رد فعل التسلسل يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل الى عام.
    2. ماصة 9 ميكرولتر من مزيج رد فعل التسلسل إلى الأمام في كل بئر من 96 لوحة PCR جيدا جديدة للتفاعل التسلسل إلى الأمام. كرر على لوحة منفصلة للتفاعل التسلسل العكسي.
    3. إضافة 1 ميكرولتر من تنقية ر المنتج WTB-PCRس كل بئر على حد سواء إلى الأمام وعكس لوحات.
    4. ختم لوحة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لضمان حل يصل الجزء السفلي من كل بئر.
    5. تحميل لوحة PCR على thermocycler.
      1. تهيئة الظروف التدوير الحراري thermocycling للتفاعل التسلسل على النحو التالي: 96 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 30 دورات من 96 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 50 درجة مئوية لمدة 5 ثوان، 60 ° C لمدة 4 دقائق. عقد في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للتنقية.
  2. تنقية تسلسل المنتجات
    1. إعداد 1:25 حل جديد من 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) والإيثانول بنسبة 100٪.
    2. إعداد 70٪ من محلول الإيثانول النقي.
    3. إضافة 30 ميكرولتر من خلات الصوديوم / 100٪ محلول الإيثانول إلى كل بئر على حد سواء إلى الأمام وعكس لوحات التسلسل ومزيج ماصة 5 مرات.
    4. ختم لوحة واحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    5. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 2250 x ج لمدة 15 دقيقة.
    6. إزالة سداده لوحة وعكس مدى النفاياتحاوية.
      ملاحظة: عكس مرة واحدة فقط أو بيليه قد تخفف من قيعان جيدا.
    7. وضع لوحة مقلوب على منشفة ورقية نظيفة وأجهزة الطرد المركزي في 150 x ج لمدة 1 دقيقة.
    8. إضافة 150 ميكرولتر الايثانول 70٪ على كل جانب.
    9. ختم لوحة وتدور في 2250 x ج لمدة 5 دقائق.
    10. كرر الخطوات من 3.2.6 و3.2.7.
    11. إذا الآبار ليست جافة تماما، والسماح لهم الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة. تأكد من العينات محمية من الضوء في حين التجفيف.
    12. إضافة 10 ميكرولتر الفورماميد إلى كل المزيج جيدا وماصة 10 مرات. ختم اللوحة.
    13. تفسد على thermocycler في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق تليها 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    14. بعد تغيير طبيعة، يستعاض عن سداده لوحة مع الحاجز وتسلسل على منصة التسلسل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 15.

4. تحليل النتائج تسلسل

  1. تصور آثار التسلسل باستخدام دات التسلسلبرنامج تحليل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 16 و محاذاة إلى متواليات إشارة منها. محاذاة MYD88 إلى NCBI تسلسل المرجعية "NM_002468".

النتائج

وقدم لمحة المفاهيمية للWTB-PCR خلال التمديد في الشكل 1. بسبب عدم تطابق النوكليوتيدات واحد في هجين مانع DNA يقلل إلى حد كبير درجة حرارة انصهاره (ΔT م = 20 - 30 ° C)، والتضخيم من الأليل WT يتم حظر حين متحولة DNA قالب حر في استكمال تمديد 17. ...

Discussion

فحص WTB-PCR الموصوفة هنا يستخدم مجموعة عامة من الاشعال مع جزئية منع يهدف إلى منع التضخيم من WT DNA خلال تمديد (الشكل 1). ثم التسلسل المنتج WTB-PCR لتحليل طفرية. فائدة WTB-PCR / سانجر تكمن في بساطته، ذات حساسية عالية، والإنتاجية العالية. باستخدام الإرشادات الموضحة هنا، فإن ?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no acknowledgements.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubesEppendorf05-402-25
100% alcoholVWR89370-084Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencerABIor equivalent
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foilsGeneMateT-2451-1For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kitLife Technologies4337455For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 SeriesEppendorfA-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well platesEppendorfZ606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100 mM)Invitrogen10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted MagnetThermo Fisher Scientific12027For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute SigmaE7023200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Toolswww.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL)Roche12032937001With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit Qiagen180134Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di FormamideABI4311320For sequencing.
LNA oligonucleotideExiqon5001005'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing PrimerABI5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing PrimerABI5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S ThermocyclerEppendorfE950030020
Microcentrifuge Model 5430EppendorfFA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermo Fisher Scientific
PCR forward primerIDT5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primerIDT5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR platesGeneMateT-3107-1
Pipettors20, 200, 1,000 µL
Plate septa, 96 wellABI4315933
QIAamp DNA Mini KitQiagen51304For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0ABI4474978For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3 M, pH 5.2) SigmaS7899
Sterile filtered pipette tips20, 200, 1,000 µL
Thermomixer C Eppendorf5382000023
Vortex genieScientific IndustriesSI-0236
Wash reservoir~ 1,000 mL
XyleneVWR89370-088Histology grade

References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  2. Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
  3. Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
  4. Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
  5. Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
  6. Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
  7. Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
  8. Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
  9. Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
  10. Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
  11. Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
  12. Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
  13. Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  15. Applied Biosystems. . User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
  16. Applied Biosystems. . User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
  17. Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
  18. Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
  19. Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
  20. Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
  21. Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
  22. Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
  23. Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
  24. Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
  25. Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
  26. Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
  27. Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
  28. Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

121 WTB PCR PCR FFPE MYD88 Macroglobulnemia

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved