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要約

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

要約

治療、治療中に耐性変異を出現するためのスクリーニング、または場合患者が少数の循環腫瘍細胞を有していた後に残存病変を評価する場合、低周波変異の正確な検出と識別が問題となり得ます。配列決定分析に続くPCRブロッキング野生型は、これらの低周波数の変異を検出するための方法として、高感度、柔軟性、および単純さを提供しています。新しいまたは以前に確立された従来のPCRに基づく配列決定アッセイにカスタム設計されたロックされた核酸、オリゴヌクレオチドを添加することにより、1000個のWT対立遺伝子のバックグラウンドで約1変異対立遺伝子の感度は、（1,000 1）を達成することができます。一般的に、ホルマリン固定パラフィン包埋組織で見出さ脱アミノ化イベントに関連付けられたシーケンシングアーチファクトが部分的に抽出工程中のウラシルDNAグリコシラーゼを使用することによって改善することができます。ここで最適化されたプロトコルは、MYD88の変異を検出するための具体的であるが、任意のを設計するためのテンプレートとして機能することができWTB-PCRアッセイ。対立遺伝子特異的PCR及びリアルタイム定量PCRを含む低頻度変異の検出のための他の一般的に利用されるアッセイオーバーWTB-PCRアッセイ法の利点は、偽陽性の少ない発生、柔軟性と実装の容易さ、および検出する能力を含む既知の両方および未知の変異。

概要

サンガー配列決定は、伝統的に、既知および未知の体細胞変異の検査でゴールドスタンダードとなっています。 （ - WTのバックグラウンド中の20％の変異対立〜10）1サンガー配列決定の制限の1つは、検出の限界です。感度のこのレベルは、いくつかの循環腫瘍細胞、又は骨髄（BM）は、斑状のときと前悪性組織または患者からの試料中に存在し得る低レベルの体細胞変異を検出するためには不適切です。これはまた、治療後の残存疾患を評価する単独2従来の配列決定により困難な治療中に新たな耐性変異を検出することができます。ロックされた核酸（LNA）と、従来のPCRを置き換えることによって、サンガー配列決定にPCR（WTB-PCR）をブロックする野生型の媒介、WTの背景で最大0.1％突然変異対立遺伝子の感度は、2、3、4を達成することができます。にこれにより、WT DNAの増幅を防止WT DNAに優先的に結合する（LNA）、オリゴヌクレオチドをブロック - （14 NT〜10）WTB-PCRは、変異体対立遺伝子について富化は短いの添加を介して達成されます。変異体富化WTB-PCR産物は、次いで、配列決定することができます。 WT DNAを遮断ではなく、特定の変異について選択することによってWTB-PCRは、微小細胞画分中に存在する既知および未知の変異の濃縮を可能にします。

複数の方法は、現在、小細胞画分における変異を検出するために使用されます。これは、高速液体クロマトグラフィー（DHPLC）、ビーズ、エマルジョン、増幅、および磁気（のBEAMing）、電界誘起放出および測定（EFIRM）、高分解能変性、対立遺伝子特異的PCR、増幅不応性変異システム（ARMS）を含みます融点など。しかし、これらの方法のほとんどは偽陽性とのみアッセイは4のために設計された一つの変異を検出する能力によって制限されています。 WTB-PCRは、しかし、ユーザが複数の変異型の検出を可能にし、成果物または脱アミノ化の事象による偽陽性を除外するのを助けることができるシーケンシングトレースを視覚化することができます。次世代シーケンシング（NGS）が、実質的に大きなコスト、複雑さ、及びより長いアッセイ時間はそれをいくつかの異なる分子マーカーを有する多くの疾患の種類または新興のための治療を受けている患者を監視するための不要なオプションをレンダリング、従来の配列決定に適切な代替を提供することができます耐性変異。さらに、高い偽陽性率が5％未満の変異対立遺伝子頻度を有する変異体を検出した場合は、アンプリコンベースのNGS 5、6のための問題を提起することができます。

ここでは、Albitar らによって記載されているように骨髄分化因子88遺伝子の突然変異のスクリーニングにWTB-PCRによって達成感度の増加を示します。 3 MYD88のmutatioNSは、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（WM）未知の重要性（IgMでMGUS）の、IgMモノクローナル免疫グロブリン血症、脾臓辺縁帯リンパ腫（SMZL）における重要な診断および予後因子であり、大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）を拡散します。 MYD88の変異は、WMとMGUSを分泌する免疫グロブリンM（IgM抗体）の患者の約50％のほぼすべてのケースで発見されました。対照的に、MYD88突然変異はSMZL患者の唯一の0から6パーセントに見られ、多発性骨髄腫7,8に存在しないされています。重複形態学、免疫表現型、細胞遺伝学的、およびWM及びSMZL又はIgM、多発性骨髄腫との間の臨床的特徴は、多くの場合、鑑別診断を複雑にすることができるので、MYD88変異の存在は、有用な同定因子9として機能することができます。 MYD88の変異はまた、治療7次DLBCLと貧しい全体的な生存患者においてより大きな疾病負担と関連しています 10。また、MYD88突然変異はより頻繁に活性化B細胞様（ABC）DLBCLで発見されているのでBが細胞様（GCB）DLBCLまたは原発性縦隔B細胞リンパ腫（PMBL）、MYD88の変異状態として働くことができる胚中心ABCサブタイプ11、12の代理マーカー。

ここで提供される詳細なプロトコルは、新しいアッセイを開発することができるか、またはほとんどの既存の配列決定アッセイを容易に正確に様々な試料タイプにおける低頻度変異を検出するように構成することが可能なテンプレートとして役立ちます。アプローチはまた、モニタリング及び腫瘍または患者は標的療法または抗生物質で治療されている間に発生することがあっても、細菌で発症し得る耐性変異を検出するために使用することができます。さらに、それは特にホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織では、変異濃縮に関連する問題の多くに対処し、救済。

プロトコル

倫理文：ヒトサンプルのすべてのテストは、治験審査委員会（IRB）の承認を得た後に行われました。

1. FFPE組織からのDNA抽出、末梢血、及び骨髄吸引

  1. DNA FFPE抽出キットと骨髄FFPE組織のための
    1. （ - 5時10節 - 10μmの厚さ5）未染色スライドからのFFPE組織で始まります。
      注：組織の削りくずとの始まりは、3つを使用する場合 - 5で6セクションを - 10ミクロンの厚さと1.1.6に進みます。
    2. スライドバスケットにスライドを置き四の洗浄リザーバ（キシレンための2つの100％アルコールのための2つ）を調製。各バスケットに対する解決策の600ミリリットルの最小容積を追加します。
    3. 第1トレイにおける5分間のキシレン洗浄を行うことによってスライドを脱パラフィン。さらに5分間、第二キシレン洗浄槽にスライドを転送します。
    4. 脱パラフィン後、5分間100％アルコールでスライドを洗浄します。第二に、スライドを転送さらに5分間アルコール洗浄槽。
    5. スライドはマイクロ遠心チューブにカミソリの刃でそれらをこする前に、ボンネットの下に完全に乾燥することができます。
      注：示された腫瘍領域とH＆Eスライドが利用可能な場合、スライドを整列のみ腫瘍領域をこすり。
    6. キットに含まれているメーカーの配布資料からの指示に進みます。
  2. BM吸引および末梢血のために
    1. これらの仕様とメーカーの説明書の配布資料に基づいて抽出します。
      注：FFPE組織や細胞からのDNA抽出のための多数の市販のキット及び方法があります。実際には、すべてを使用することができます。実験室で確立された方法を使用してください。
      1. 200μLの末梢血（PB）又は100μLのBM +100μLのPBSを使用します。
      2. 4μLのRNase Aストック溶液を使用してください。
      3. 100μLの溶出緩衝液で溶出します。
  3. DNAの定量化
    1. （純粋なDNAの場合）約1.8の260nmで/ 280 nmの比率を確保する分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。比がかなり低い場合には、下流アプリケーションに干渉する可能性タンパク質、フェノール、または他の汚染物質の存在を示すことができます。
    2. 適切な溶出緩衝液で100 ng /μLで - 約50にDNA濃度を調整します。

2.野生型PCRブロッキング

  1. プライマー設計
    1. 設計と以前にPCRプライマー設計13の一般的なガイドラインを説明に従って目的の遺伝子のためのプライマーを得ます。 M13フォワードを含めると、PCRプライマーにユニバーサル配列決定プライマーをリバース。
      注：MYD88アッセイはMYD88のエクソン5を増幅するために開発された（G259 - N291）5' に位置し、110個のヌクレオチドプライマーをイントロン4前方のスプライス部位と一部を覆い、逆にイントロン領域5' を用いて設計しました-M13シーケンス（M13フォワード：TGT AAA ACG ACG GCC AGT。 M13リバース：CAG GAA ACA GCT ATG ACC）相補的配列決定プライマーのアニーリングを可能にする（ 材料表を参照）。
  2. ロックされた核酸、オリゴヌクレオチドのデザイン
    1. 約10であることをブロッキングオリゴヌクレオチドを設計 - 長さが15塩基および変異体濃縮が望まれるWTテンプレートに相補。
      注：短いオリゴは、ミスマッチ識別が向上します。これは非常に「粘着性」オリゴヌクレオチドにつながることができるので、高い標的特異性を達成するために、あまりにも多くのブロッキングヌクレオチドを使用しないことが重要です。コンテンツの長さとブロッキングヌクレオチドを遮断する必要がある特定のヌクレオチドに応じて最適化されるようにすべきです。二次構造を損なうことと、自己相補性を危険にさらすことなく、高い結合特異性を達成することが重要です。
    2. 拡張temperat上方15°C - T mの10を有するようにブロッキングオリゴを設計熱サイクリング中にURE。 GまたはC塩基を遮断- （4塩基3）ブロッキング塩基を追加または削除することによって、又は長いストレッチを回避しながら、DNAのためのブロッキングの塩基を置換することにより、T mを調整します。
      1. オリゴツールのウェブサイトに移動します（ 材料の表を参照）、「オリゴTmの予測をブロッキング」ツールを選択します。
      2. 「オリゴシーケンス」ボックスにブロックされることが望まれるWTテンプレートの配列を貼り付けます。ブロッカー拠点を示すために、拠点の前に「+」を追加します。
      3. DNA-ブロッカーハイブリッドのおおよそのT mを決定するために、「計算」ボタンを選択します。
    3. 二次構造形成や自己二量体を避けるために、ブロッキングオリゴを設計します。
      1. オリゴツールのウェブサイトに移動します（ 材料の表を参照）、「オリゴOptimizerをブロッキング」ツールを選択します。
      2. ボックスにブロックされることが望まれるWTテンプレートの配列を貼り付け。拠点を遮断示すために、拠点の前に「+」を追加します。
      3. 「二次構造」と「自己のみ」の2つのボックスを選択します。潜在的に厄介な二次構造または自己二量体のためのオリゴを検討する分析ボタンを押してください。
        注：スコアは、二次構造および自己二量体のT m「sを非常に粗い推定値を表します。低いスコアは、したがって最適であり、ブロッカーブロッカーペアを制限することによって達成することができます。 MYD88 [MYD88blocker（TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T +のCC / invdT /）]のためのブロッキングオリゴヌクレオチドはQ262、I266アミノ酸をカバーするように設計されており、反転3 'を備えましたdTの3'-エキソヌクレアーゼによってDNAポリメラーゼおよび分解の両方によって伸長を阻害します。この特定のブロッキングオリゴは「+ N」と表記されている10のブロック塩基と17マーです。残りの7つの塩基は、通常のDNAヌクレオチドです。
  3. WTB-PCRセットアップおよび熱サイクル
    1. WTB-PCRマスターマイルを準備X（MMX）フォワード10X W / 20mMのMgCl 2を 、250μMのdNTP、0.2μM2.5μLPCR反応緩衝液を使用し、リバースプライマー、1.2μMMYD88blocker、およびDNアーゼ、RNアーゼを含まない、超純H 2 Oは、最終を作成します反応あたり21.75μLの液量。
      注：作業濃度は25μL（DNA鋳型とのポリメラーゼの添加後）の最終反応容量のためのものです。従来のPCR MMXは、単にブロッカーの添加を省略することにより調製されます。すべてのプロトコル手順はWTBと従来のPCRの両方に対して同一のままです。これは、検証に使用されるとブロッカーの添加によって達成濃縮を決定することができます。
      1. MMXの量を計算する際に3つの追加反応（陽性および陰性対照および非テンプレートコントロール汚染をチェックする）とピペッティングエラーのための少なくとも1つの追加の反応を考慮してください調製しました。
    2. 徹底的にボルテックスMMX。 MMXはAYまでのために-80℃で保存することができます耳。
    3. MMXに反応当たり0.25μLのTaq DNAポリメラーゼを加え、混合して反転。ポリメラーゼはMMXに追加された後、氷の上に保管してください。
    4. 各反応ウェルにコールドプレートピペットポリメラーゼとMMXの22μLに新しい96ウェルPCRプレートを置きます。
    5. ポリメラーゼでMMXを含む各ウェルに100 ng /μLで - 3μLゲノムDNA（50加えます。
    6. 溶液は、各ウェルの底に到達確実にするために簡単にプレートと遠心分離をシール。
    7. サーモサイクラー上でPCRプレートを読み込みます。
      1. 次のようにWTB-PCR反応の熱サイクル条件を設定：6分間95℃での初期変性; 30秒間95℃での変性、30秒間56℃でのプライマーアニーリング、および1分20秒間72℃での伸長の40サイクル。 10分間72℃で最終伸長。
        注：ベストプラクティスは、アンプリコンの汚染を避けるために、物理的に独立した領域に、プロトコルの残りを完了含まInは将来のセットアップ。
  4. WTB-PCRが成功したかどうかを判断し、非鋳型対照における増幅の欠如を確認するために、以前に記載されたプロトコル14に従ってゲル電気泳動を行います。
  5. 磁気ビーズによるPCR生成物の精製
    1. 4°Cから磁気ビーズを取り出し、室温に持って来ます。
    2. 新しいPCRプレートに10μLのPCR産物を転送します。
    3. 渦磁気ビーズを激しく完全に磁性粒子を再懸濁します。
    4. 新しいプレート上の各ウェルに18μLに磁気ビーズを追加します。ピペットを10回混ぜます。
    5. 5分間室温でインキュベートします。
    6. 溶液から別のビーズに2分間サイドスカート磁石プレート上にPCRプレートを置きます。
    7. ビーズペレットを避け、マルチチャンネルピペットで上清を吸引除去します。
    8. 各ウェルに150μLの70％エタノールを分配し、foは室温でインキュベートRは、少なくとも30秒。マルチチャンネルピペットでエタノールを吸引し、ヒントを捨てます。もう一度この洗浄手順を繰り返します。
    9. 20μLのマルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルからの残りのエタノールを吸引し、チップを廃棄します。
    10. ウェルを（約10分間）乾燥されると、磁石プレートから除去し、穏やかに各ウェルにピペットミックスに40μLを15回又は渦をヌクレアーゼフリー水を加えます。
    11. 2分間、室温でインキュベートします。
    12. 溶液から別のビーズに1分間磁石板上PCRプレートを置きます。
    13. 新しいPCRプレートに精製された生成物の35μLを移します。これは、精製されたPCR産物は、現在、双方向の配列決定を続行する準備ができているか、必要になるまで-20℃で保存することが可能です。
      注：新規アッセイを開発する場合、精製されたPCR産物の定量化が必要とされ得ます。 1から3 ng /μLでアンプリコンのDNAは、双方向の配列決定のために最適です。濃度が一貫して低い場合、PCR産物及び磁性ビーズを高めるproportionally（1：1.8）。濃度が一貫して高い場合、水のより大きな容積で溶出します。

WTB-PCR産物の3シーケンシング

  1. 双方向シーケンシング
    注：以下のプロトコルは、より少ない試薬を使用するために最適化された製造業者の使用説明書の改変された形態です。
    1. フォワード準備と逆方向配列決定反応は、最終的な溶液を作成するために追加して、DNアーゼ、RNアーゼを含まない、超純H 2 O 0.25μLレディ反応混合物、1.88μL配列決定緩衝液、1.78μMM13-F又はM13-R配列決定プライマーとと混合します反応あたり9μLのボリューム。この配列決定反応ミックスは年まで-20℃で保存することができます。
    2. 順方向配列決定反応のための新しい96ウェルPCRプレートの各ウェルに順方向配列決定反応混合物のピペット9μL。逆方向配列決定反応のために別々のプレート上で繰り返します。
    3. 精製したWTB-PCR産物トンの1μLを追加各Oウェルの両方前方プレートを逆に。
    4. 溶液は、各ウェルの底に到達確実にするために簡単にプレートと遠心分離をシール。
    5. サーモサイクラー上でPCRプレートを読み込みます。
      1. 次のように配列決定反応のための熱サイクル条件を設定：96℃を1分間; 10秒間96℃の30サイクル、5秒50℃、4分間60°C。浄化のための準備が整うまで4℃で保持します。
  2. シーケンシング製品を精製
    1. 3M酢酸ナトリウム（pH5.2）および100％エタノールの新鮮な1時25溶液を調製します。
    2. 新鮮な70％エタノール溶液を調製します。
    3. 酢酸ナトリウムの30μL/フォワードおよびシーケンシングプレートを逆にし、ピペットミックス5回の両方の各ウェルに100％エタノール溶液を加えます。
    4. プレートを再シールし、20分間室温で暗所でインキュベートします。
    5. 15分間2,250×gでプレートを遠心します。
    6. プレートシーラーを取り外し、廃棄物の上に反転コンテナ。
      注：一度だけ反転またはペレットはウェル底部から緩むことがあります。
    7. 1分間150×gで清潔なペーパータオルと遠心分離機に反転プレートを置きます。
    8. 各ウェルに150μLの70％エタノールを追加します。
    9. プレートを再シールし、5分間、2,250×gでスピン。
    10. 繰り返しは3.2.6と3.2.7を繰り返します。
    11. ウェルが完全に乾燥していない場合は、室温で空気乾燥させます。乾燥しながら、サンプルを光から保護されていることを確認してください。
    12. 各ウェルピペットミックスに10回を10μLホルムアミドを追加します。プレートを再シール。
    13. 5分間、4℃で、続いて3分間95℃でサーモサイクラーで変性。
    14. 変性後、メーカーの指示15に従ってシーケンシングプラットフォームにセプタムおよび配列とプレートシーラーを交換してください。

配列決定結果の分析4。

  1. シーケンシングのDATを使用してシーケンシングトレースを可視化製造業者の説明書16とそれぞれの基準配列に整列に従って解析ソフトウェア。 NCBI参照配列「NM_002468」にMYD88を合わせます。

結果

拡張時WTB-PCRの概念の概要は、 図1に示されています。ブロッカー-DNAハイブリッド中の一塩基ミスマッチが大きく、その融解温度低下するため（ΔTM = 20から30°C）の変異鋳型DNAは、拡張17を完成するのに自由であるが、WT対立遺伝子の増幅が阻止されます。 WT DNAが直線的に増幅されている間、このように、変異体DNAを指数関数的に?...

ディスカッション

WTB-PCRアッセイは、ここで説明する拡張（ 図1）の間にWT DNAの増幅をブロックするように設計されたブロッキングオリゴプライマーの一般的なセットを使用します。 WTB-PCR産物は、次いで、変異解析のために配列決定されます。 WTB-PCR /サンガーの有用性は、その単純性、高感度、高スループットです。ここで説明するガイドラインを使用して、ほとんどの既存のサンガーベースの?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

The authors have no acknowledgements.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubesEppendorf05-402-25
100% alcoholVWR89370-084Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencerABIor equivalent
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foilsGeneMateT-2451-1For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kitLife Technologies4337455For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 SeriesEppendorfA-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well platesEppendorfZ606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100 mM)Invitrogen10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted MagnetThermo Fisher Scientific12027For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute SigmaE7023200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Toolswww.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL)Roche12032937001With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit Qiagen180134Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di FormamideABI4311320For sequencing.
LNA oligonucleotideExiqon5001005'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing PrimerABI5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing PrimerABI5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S ThermocyclerEppendorfE950030020
Microcentrifuge Model 5430EppendorfFA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermo Fisher Scientific
PCR forward primerIDT5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primerIDT5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR platesGeneMateT-3107-1
Pipettors20, 200, 1,000 µL
Plate septa, 96 wellABI4315933
QIAamp DNA Mini KitQiagen51304For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0ABI4474978For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3 M, pH 5.2) SigmaS7899
Sterile filtered pipette tips20, 200, 1,000 µL
Thermomixer C Eppendorf5382000023
Vortex genieScientific IndustriesSI-0236
Wash reservoir~ 1,000 mL
XyleneVWR89370-088Histology grade

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