De tipo selvagem Bloqueio de PCR combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de Baixa Frequência mutações somáticas

Resumo

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Resumo

A detecção precisa e identificação de mutações de baixa frequência pode ser problemática quando se avalia doença residual após terapia, o rastreio de mutações de resistência emergente durante a terapia, ou quando os pacientes têm poucas células tumorais circulantes. De tipo selvagem bloqueio de PCR seguido por análise de sequenciação oferece alta sensibilidade, flexibilidade e simplicidade como uma metodologia para detectar essas mutações de baixa frequência. Ao adicionar um projetado bloqueado oligonucleótido ácido nucleico para um ensaio de sequenciação baseada em PCR convencional novo ou previamente estabelecida, sensibilidades de aproximadamente um alelo mutante de um fundo de 1.000 alelos WT pode ser conseguida (1: 1000). artefactos de sequenciação associados com eventos de desaminação comumente encontrados em tecidos embebidos em parafina fixados com formalina pode ser parcialmente remediada pela utilização de glicosilase de uracilo de ADN durante os passos de extracção. O protocolo optimizado aqui é específico para a detecção de mutação MyD88, mas pode servir como um modelo para conceber qualquerensaio WTB-PCR. As vantagens do ensaio de WTB-PCR em relação a outros ensaios vulgarmente utilizados para a detecção de mutações de baixa frequência, incluindo alelo específico PCR e PCR em tempo real quantitativo incluem menos ocorrências de falsos positivos, maior flexibilidade e facilidade de aplicação, e a capacidade para detectar tanto conhecida e mutações desconhecidas.

Introdução

Sanger de sequenciação tem sido, tradicionalmente, o padrão de ouro em ambos os testes para mutações somáticas conhecidos e desconhecidos. Uma das limitações de Sanger de sequenciação é o seu limite de detecção (~ 10 - 20% alelo mutante em um fundo de WT) ^1. Este nível de sensibilidade é inadequado para a detecção de mutações somáticas de baixo nível, que podem estar presentes em amostras a partir de tecidos pré-malignas ou doentes com algumas células tumorais em circulação, ou quando a medula óssea (BM) é irregular. Isto também faz com que a avaliação de doença residual após terapia ou detecção de mutações resistentes emergentes durante a terapia difícil por sequenciação convencional sozinho ^2. Através da substituição de PCR convencional com ácido nucleico bloqueado (LNA) mediada de tipo selvagem bloqueio de PCR (WTB-PCR), na sequenciação de Sanger, sensibilidades de até 0,1% alelo mutante em um fundo de WT pode ser obtida ^{2, 3, 4.} DentroWTB-PCR, o enriquecimento para os alelos mutantes é conseguido através da adição de uma pequena (~ 10-14 NT) de bloqueio (LNA) oligonucleótido que se liga preferencialmente ao ADN WT impedindo assim a amplificação de ADN WT. O produto WTB-PCR enriquecido mutante pode em seguida ser sequenciados. Ao bloquear ADN WT em vez de seleccionar para mutações específicas WTB-PCR permite o enriquecimento de ambas as mutações conhecidas e desconhecidas presentes em fracções celulares hora.

Vários métodos são actualmente utilizados para a detecção de mutações em fracções de células pequenas. Isto inclui por PCR, do sistema específico de alelo amplificação refractário mutação (ARMS), desnaturante cromatografia líquida de alta eficiência (DHPLC), grânulos, emulsões, amplificação, e magnetos (radiante), libertação induzida por um campo eléctrico e de medição (Efirm), de alta resolução ponto de fusão e outros. No entanto, a maioria desses métodos são limitados por falsos positivos e a capacidade de detectar apenas uma mutação que o ensaio foi concebido para ^quatro . WTB-PCR, no entanto, permite ao utilizador visualizar os traços de sequenciação que permite a detecção de vários tipos de mutação e podem auxiliar na exclusão de falsos positivos devido a artefactos ou eventos de desaminação. sequenciação próxima geração (NGS) pode oferecer uma alternativa adequada para a sequenciação convencional, no entanto, substancialmente maiores custos, complexidade e tempo de ensaio mais o tornar uma opção desnecessária para muitos tipos de doenças com alguns marcadores moleculares distintos ou para a monitorização de pacientes em terapia para emergente mutações de resistência. Além disso, as altas taxas de falsos positivos, quando detectam variantes com frequências de alelos mutantes de menos de 5% pode representar um problema para NGS à base de amplicon ^{5, 6.}

Aqui demonstramos o aumento da sensibilidade obtida por WTB-PCR em rastreio de mutações no gene de diferenciação mielóide factor de 88, tal como descrito por Albitar et al. Mutatio ³ MyD88ns são factores de diagnóstico e prognóstico importantes em Macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), IgM monoclonal gamopatia de significado desconhecido (IgM-MGUS), linfoma da zona marginal esplénica (SMZL), e linfoma difuso de grandes células B (DLBCL). MyD88 mutações são encontrados em quase todos os casos de WM e aproximadamente 50% dos pacientes com Imunoglobulina M (IgM) secretores MGUS. Em contraste, as mutações MyD88 são encontrados em apenas 0-6% dos doentes com SMZL e estão ausentes no mieloma múltiplo ^{7, 8.} Porque morfológica sobreposição, imunofenotípicas, citogenética, e características clínicas entre WM e SMZL ou mieloma múltiplo IgM muitas vezes pode complicar o diagnóstico diferencial, a presença de uma mutação MyD88 pode servir como um factor de identificação útil ^9. MyD88 mutações também têm sido associadas com uma maior carga da doença em pacientes com DLBCL e sobrevivência global pobre seguintes terapia ^{7, 10.} Além disso, porque as mutações MyD88 são mais frequentemente encontrados na célula B semelhante (ABC) DLBCL activada do que o centro germinal B-célula-like (GCB) DLBCL ou linfoma de células B do mediastino primário (PMBL), estado de mutação MyD88 pode servir como um marcador substituto para o subtipo de ABC ^{11, 12.}

O protocolo detalhado fornecida aqui serve como um molde a partir do qual novos ensaios podem ser desenvolvidos ou a maioria dos ensaios de sequenciação existentes podem ser facilmente adaptadas para detectar com precisão as mutações de baixa frequência em vários tipos de amostras. A abordagem também pode ser utilizada para monitorar e detectar mutações resistentes que podem desenvolver-se tumores ou mesmo bactérias que podem desenvolver enquanto os pacientes estão a ser tratados com terapia direcionada ou antibióticos. Além disso, aborda e remédios muitos dos problemas associados com o enriquecimento de mutação, especialmente no tecido embebido em parafina fixado em formalina (FFPE).

Protocolo

Declaração de Ética: Todos os testes de amostras humanas foi realizada após a obtenção Institutional Review Board aprovação (IRB).

1. Extracção de DNA a partir de FFPE tecido, sangue periférico, medula óssea e Aspirar

1. Para osso tecido FFPE medula com o kit de extracção de ADN FFPE
   1. Comece com o tecido FFPE de lâminas não coradas (5 - 10 em secções de 5 - 10? M de espessura).
      NOTA: Se início com aparas de tecido, usar 3 - 6 secções de 5 - 10? M de espessura e avance para o passo 1.1.6.
   2. Colocar as lâminas em um carrinho deslizante e preparar quatro reservatórios de lavagem (duas por xileno e duas para 100% de álcool). Adicionar um volume mínimo de 600 ml de solução para cada carrinho.
   3. Desparafinar as lâminas fazendo uma lavagem de xileno 5 min na primeira bandeja. Transferir as lâminas para o segundo reservatório de lavagem xileno durante um adicional de 5 min.
   4. Após desparafinizao, lavar as lâminas com uma álcool 100% durante 5 min. Transferir as lâminas para a segundareservatório de lavagem de álcool durante um adicional de 5 min.
   5. Permitir que as lâminas secar completamente sob uma capa antes raspando-as com uma lâmina de barbear para um tubo de microcentrífuga.
      NOTA: Se um slide de H & E com a região do tumor indicado está disponível, alinhar as lâminas e raspar apenas a região do tumor.
   6. Prossiga com as instruções do fabricante folheto incluídos no kit.
2. Para BM aspirado e sangue periférico
   1. Extracto de acordo com as instruções folheto do fabricante com estas especificações.
      NOTA: Existem numerosos conjuntos e métodos de extracção de ADN a partir de tecidos e células FFPE disponíveis comercialmente. Praticamente, todos podem ser utilizados. Use um método que é criada em laboratório.
      1. Use 200 uL de sangue periférico (PB) ou 100 ul BM + 100 uL de PBS.
      2. Use 4 uL de RNase A solução estoque.
      3. Eluir com 100 mL de tampão de eluição.
3. Quantificação de DNA
   1. Medir as concentrações de ADN, utilizando um espectrofotómetro de assegurar um / A280 nm 260 nm de aproximadamente 1,8 (para o ADN puro). Se a proporção é sensivelmente menor, que pode indicar a presença de proteína, de fenol, ou outros contaminantes que podem interferir com as aplicações a jusante.
   2. Ajustar as concentrações de ADN de, aproximadamente, 50 - 100 ng / mL com tampão de eluição adequado.

2. Bloqueio de Tipo Selvagem de PCR

1. projeto Primer
   1. Concepção e obtenção de iniciadores para genes de interesse de acordo com o anteriormente descrito orientações gerais do projecto de iniciador de PCR ^13. Incluem-M13 para frente e reverso iniciadores de sequenciação universais em iniciadores de PCR.
      NOTA: O ensaio de MyD88 foi desenvolvido para amplificar o exão 5 de MyD88 (G259 - N291) e 110 nucleótidos localizados na região 5' intrónica para cobrir o local de splicing e parte do intr 4. O directo e inverso foram concebidos iniciadores com um 5' -M13 sequência (H13-forward: tgt aaa ACG ACG gcc agt; M13-reverso: CAG GAA ACA GCT ATG ACC) para permitir a hibridação dos iniciadores de sequenciação complementares (ver Materiais Tabela).
2. Ácido nucléico bloqueado Oligonucleotide projeto
   1. Desenhar o oligonucleótido de bloqueio para ser de aproximadamente 10 - 15 bases de comprimento e complementar ao modelo WT, onde é desejado o enriquecimento mutante.
      NOTA: Um oligo mais curto irá melhorar a discriminação incompatibilidade. Para alcançar alta especificidade alvo, é importante para não usar demais nucleotídeos bloqueio pois isso pode resultar em um oligonucleotídeo muito "pegajoso". O conteúdo e o comprimento de nucleótidos e bloqueio deve ser optimizar de acordo com as sequências de nucleótidos específicas que têm de ser bloqueados. É importante para conseguir a especificidade de ligação de elevada sem comprometer a estrutura secundária e correr o risco de auto-complementaridade.
   2. Conceber o oligo de bloqueio para ter uma _Tm de 10 - 15 ° C acima da temperat extensãoure durante ciclos tmicos. Ajustar a _Tm por adição ou remoção de bases de bloqueio ou por substituição de bases de bloqueio para o ADN, evitando trechos longos (3 - 4 bases) de bloqueio de bases G ou C.
      1. Navegar até o site ferramentas de oligo (ver Tabela de Materiais) e selecione o "bloqueio Oligo Tm Prediction" ferramenta.
      2. Colar a sequência do molde WT que é desejado para ser bloqueado na caixa "Oligo Sequência". Adicionar "+" na frente de bases para indicar bases bloqueador.
      3. Selecione o botão "Calcular" para determinar o aproximada T _m do híbrido de ADN-Blocker.
   3. Conceber o oligo de bloqueio para evitar a formação de estruturas secundárias ou auto-dímeros.
      1. Navegar até o site ferramentas de oligo (ver Tabela de Materiais) e selecione o "bloqueio Oligo Optimizer" ferramenta.
      2. Colar a sequência do molde WT que é desejado para ser bloqueado na caixa. Adicionar "+" na frente de bases para indicar o bloqueio bases.
      3. Selecione as duas caixas para "estrutura secundária" e "Self Only". Pressione o botão Analisar para analisar o oligo de estruturas secundárias potencialmente problemáticos ou auto-dímeros.
         NOTA: As pontuações representam estimativas muito grosseiras da T _m 's das estruturas secundárias e auto-dímeros. As pontuações mais baixas são portanto ideal e pode ser conseguida limitando bloqueador-bloqueador de emparelhamento. O oligonucleótido bloqueador para MyD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + D + G + A + T + CC / invdT /)] foi concebida para cobrir aminoácidos Q262-I266 e apresenta uma 3'-invertida dT para inibir tanto a extensão por polimerase de ADN e da degradação por 3'-exonuclease. Este oligo bloqueio específico é um 17-mero com 10 bases de bloqueio que são denotados como "+ N". Os restantes 7 bases são nucleótidos de ADN comuns.
3. Configuração WTB-PCR e ciclos de temperatura
   1. Preparar um WTB-PCR mi mestrex (MMX) utilizando 2,5 mL de PCR de tampão de reacção 10 x w / 20 mM de _MgCl2, 250 ^ M de dNTP, 0,2 uM iniciador directo e inverso, 1,2 uM MYD88blocker, e DNAse, RNAse-livre, ultra-pura _H2O para criar uma definitiva volume da solução de 21,75 mL por reacção.
      NOTA: Trabalhando concentrações referem-se ao volume de reacção final de 25 ul (após a adição de DNA molde e polimerase). PCR convencional MMX é preparado por simplesmente omitindo a adição do bloqueador. Todos os passos do protocolo permanecem idênticas para ambos WTB e PCR convencional. Isso pode ser usado em validação e determinação de enriquecimento alcançado pela adição de bloqueador.
      1. Ao calcular a quantidade de MMX para preparar a certificar-se de que são responsáveis ​​por reacções adicionais 3 (controlos positivos e negativos e um controlo não-modelo para verificar se há contaminação) e pelo menos uma reacção adicional para erros de pipetagem.
   2. Vortex MMX completamente. A MMX pode ser armazenado a -80 ° C durante até ayorelha.
   3. Adicionar 0,25 mL de Taq DNA polimerase por reacção à MMX e invertido para misturar. Uma vez que a polimerase foi adicionado à MMX, mantê-lo em gelo.
   4. Colocar uma nova placa de 96 poços de PCR sobre uma placa fria e pipeta de 22 uL da MMX com polimerase, para cada cavidade de reacção.
   5. Adiciona-se 3 mL de ADN genómico (50 - 100 ng / mL para cada um dos poços que contêm a MMX com polimerase.
   6. Selar a placa e Centrifugar brevemente para garantir que a solução atinge o fundo de cada poço.
   7. Carregar a placa de PCR num termociclador.
      1. Definir as condições de termociclização para a reacção WTB-PCR como se segue: desnaturação inicial a 95 ° C durante 6 minutos; 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 30 s, emparelhamento de iniciador a 56 ° C durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 1 min 20 s; extensão final a 72 ° C durante 10 min.
         NOTA: Melhor prática envolve completar o restante do protocolo em uma área separada fisicamente para evitar a contaminação amplicon in futuras configurações.
4. Efectuar a electroforese de gel de acordo com protocolos anteriormente descritos ^14, a fim de determinar se WTB-PCR foi bem sucedida e para confirmar a falta de amplificação no controlo não-molde.
5. Purificação de PCR produtos por esferas magnéticas
   1. Remover esferas magnéticas a partir de 4 ° C e trazer para a temperatura ambiente.
   2. Transferir 10 uL do produto de PCR para uma nova placa de PCR.
   3. Vortex as esferas magnéticas vigorosamente para voltar a suspender totalmente as partículas magnéticas.
   4. Adicionar 18 mL esferas magnéticas a cada poço na nova placa. Pipeta misturar 10 vezes.
   5. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
   6. Colocar a placa de PCR para a placa de íman contornado-lado durante 2 minutos para separar as pérolas da solução.
   7. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de canais múltiplos, evitando-se o sedimento de grânulo.
   8. Dispensar 150 uL de 70% de etanol a cada poço e incubar à temperatura ambiente for pelo menos 30 s. Aspirar o etanol com uma pipeta multicanal e descartar dicas. Repetir este procedimento de lavagem mais uma vez.
   9. Usando uma pipeta de múltiplos canais 20 uL aspirar o etanol remanescente a partir de cada cavidade e descartar dicas.
   10. Depois dos poços são secos (~ 10 min), remover da placa íman e adicionar 40 uL de água livre de nuclease a cada poço e mistura pipeta 15 vezes ou vórtice suavemente.
   11. Incubar à temperatura ambiente durante 2 min.
   12. Colocar a placa de PCR no prato íman durante 1 min para separar as pérolas a partir de solução.
   13. Transferência de 35 uL de produto purificado para uma nova placa de PCR. Este produto de PCR é purificado é agora pronto para prosseguir com a sequenciação bidireccional ou pode ser armazenado a -20 ° C até ser necessário.
       Nota: Quando o desenvolvimento de um novo ensaio, a quantificação de produto de PCR purificado pode ser necessária. 1-3 ng de ADN amplic / uL é ideal para sequenciação bi-direccional. Se a concentração é consistentemente baixa, aumentar o produto de PCR e magnéticos grânulos proportionally (1: 1,8). Se a concentração é consistentemente elevado, elui-se com um maior volume de água.

3. Sequência de WTB-PCR produtos

1. Sequenciamento Bi-direcional
   NOTA: O protocolo seguinte é uma forma modificada de instruções do fabricante que foi optimizado para usar menos reagentes.
   1. Preparar para a frente e reverso reacção de sequenciação mistura-se com 0,25 mL Pronto mistura de reacção, 1,88 mL Sequenciação Tampão, 1,78 uM M13-F ou M13-R iniciadores de sequenciação e adicionar e DNAse, RNAse-livre, ultra-pura _H2O para criar uma solução final volume de 9 mL por reacção. Esta mistura de reacção de sequenciação pode ser armazenado a -20 ° C durante até um ano.
   2. Pipeta 9 pL da mistura de reacção de sequenciação para a frente em cada poço de uma nova placa de 96 poços de PCR para a reacção de sequenciação para a frente. Repetir em uma placa separada para a reacção de sequenciação reversa.
   3. Adicionar 1 mL do produto purificado t WTB-PCRO cada poço em ambas as placas para a frente e reverso.
   4. Selar a placa e Centrifugar brevemente para garantir que a solução atinge o fundo de cada poço.
   5. Carregar a placa de PCR num termociclador.
      1. Definir as condições de termociclização para a reacção de sequenciação como se segue: 96 ° C durante 1 min; 30 ciclos de 96 ° C durante 10 s, 50 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 4 min; manter a 4 ° C até estar pronta para purificação.
2. Purificar Sequencing produtos
   1. Prepara-se uma solução 01:25 de acetato de fresco de sódio 3M (pH 5,2) e etanol a 100%.
   2. Prepara-se uma solução fresca de etanol a 70%.
   3. Adicionar 30 ul de acetato de sódio / solução de etanol a 100% a cada poço de ambas as placas para a frente e inverso de sequenciação e mistura pipeta de 5 vezes.
   4. Selar a placa e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 20 min.
   5. Centrifugar a placa a 2250 xg durante 15 min.
   6. Remova o vedante de placa e inverta sobre um desperdíciorecipiente.
      NOTA: Inverter apenas uma ou a pelota pode soltar a partir do fundo bem.
   7. Colocar a placa invertida sobre uma toalha de papel limpa e centrifugar a 150 xg durante 1 min.
   8. Adicionar 150? L de 70% etanol a cada poço.
   9. Selar a placa e girar a 2250 xg durante 5 min.
   10. Repita os passos 3.2.6 e 3.2.7.
   11. Se os poços não são completamente seca, permitir-lhes secar ao ar à temperatura ambiente. Certifique-se as amostras são protegidas da luz durante a secagem.
   12. Adicionar 10 mL de formamida a cada poço e pipeta mix 10 vezes. Selar a placa.
   13. Desnaturar no termociclador a 95 ° C durante 3 minutos seguido de 4 ° C durante 5 min.
   14. Após desnaturação, substituir o vedante de placa com um septo e a sequência na plataforma de sequenciação de acordo com as instruções do fabricante ^15.

4. Análise dos Resultados Sequencing

1. Visualizar os traços de sequenciação utilizando um dat sequenciaçãoum software de análise de acordo com as instruções do fabricante ¹⁶ e alinham com as respectivas sequências de referência. MyD88 alinhar a sequcia de refercia do NCBI "NM_002468".

Resultados

Uma visão geral conceitual de WTB-PCR durante a extensão é apresentado na Figura 1. Uma vez que um único nucleótido mal emparelhado o híbrido ADN-bloqueador diminui consideravelmente a sua temperatura de fus (? T _m = 20 - 30 ° C), a amplificação do alelo WT é bloqueado enquanto ADN molde mutante é livre para completar a extensão ^17. Neste modo, o DNA mutante é amplificada exponencialmente, enquanto ADN WT é amplificado lin...

Discussão

O ensaio WTB-PCR descrita aqui utiliza um conjunto genérico de iniciadores com um oligo de bloqueio concebido para bloquear a amplificação de ADN WT durante a extensão (Figura 1). O produto WTB-PCR é, em seguida, sequenciados para análise mutacional. O utilitário de WTB-PCR / Sanger reside na sua simplicidade, de alta sensibilidade, e de alto rendimento. Usando as diretrizes descritas aqui, a maioria dos ensaios baseados em Sanger existentes podem ser simplesmente modificadas por meio da adição...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes	Eppendorf	05-402-25
100% alcohol	VWR	89370-084	Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer	ABI		or equivalent
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils	GeneMate	T-2451-1	For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit	Life Technologies	4337455	For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series	Eppendorf		A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates	Eppendorf	Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100 mM)	Invitrogen	10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet	Thermo Fisher Scientific	12027	For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute	Sigma	E7023	200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools			www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL)	Roche	12032937001	With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus			2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit	Qiagen	180134	Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide	ABI	4311320	For sequencing.
LNA oligonucleotide	Exiqon	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer	ABI		5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer	ABI		5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler	Eppendorf	E950030020
Microcentrifuge Model 5430	Eppendorf		FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer	IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates	GeneMate	T-3107-1
Pipettors			20, 200, 1,000 µL
Plate septa, 96 well	ABI	4315933
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304	For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0	ABI	4474978	For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3 M, pH 5.2)	Sigma	S7899
Sterile filtered pipette tips			20, 200, 1,000 µL
Thermomixer C	Eppendorf	5382000023
Vortex genie	Scientific Industries	SI-0236
Wash reservoir			~ 1,000 mL
Xylene	VWR	89370-088	Histology grade