Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Zusammenfassung

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Zusammenfassung

Eine genaue Erfassung und Identifizierung von Niederfrequenzmutationen können problematisch sein, wenn Resterkrankung nach der Therapie die Beurteilung, Screening für neue Resistenzmutationen während der Therapie, oder wenn die Patienten haben wenige zirkulierende Tumorzellen. Wildtyp durch Sequenzanalyse gefolgt PCR Blockierung bietet eine hohe Empfindlichkeit, Flexibilität und Einfachheit als Methode, diese niedrigen Frequenz Mutationen zu detektieren. Durch das Hinzufügen eines benutzerdefinierten Nukleinsäure-Oligonukleotid an ein neuen oder zuvor etablierten konventionellen PCR basierten Sequenzierungsassay entworfen verriegelte, Empfindlichkeiten von etwa 1 mutanten Allels in einem Hintergrund von 1000 WT Allele (: 1000 1) erreicht werden. Sequenzierungsartefakten im Zusammenhang mit Ereignissen Desaminierung üblicherweise in Formalin fixierten Paraffin eingebetteten Geweben teilweise durch die Verwendung von Uracil-DNA-Glycosylase während Extraktionsschritte behoben werden kann. Das optimierte Protokoll hier ist spezifisch zum Nachweis MYD88 Mutation, sondern kann als Vorlage dient jeden entwerfenWTB-PCR-Assays. Die Vorteile des WTB-PCR-Test gegenüber anderen häufig verwendeten Tests zum Nachweis von niedrigen Frequenz Mutationen einschließlich Allel-spezifische PCR und quantitative Echtzeit-PCR weniger Vorkommen von Fehlalarmen sind, eine größere Flexibilität und eine einfache Implementierung und die Fähigkeit zu erkennen, sowohl bekannte als und unbekannte Mutationen.

Einleitung

Sanger-Sequenzierung ist traditionell der Goldstandard in der Erkennung von bekannten und unbekannten somatischen Mutationen. Eine der Einschränkungen der Sanger - Sequenzierung ist die Nachweisgrenze (~ 10 - 20% mutanten Allels in einem Hintergrund von WT) ^1. Dieses Maß an Empfindlichkeit ungeeignet ist für geringe somatische Mutationen erfassen, die in Proben von Geweben oder prämalignen Patienten mit wenigen zirkulierenden Tumorzellen vorhanden sein können, oder, wenn Knochenmark (BM) sind lückenhaft. Dies macht auch Resterkrankung nach der Therapie oder zum Nachweis von Schwellenresistenzmutationen während der Therapie schwierig durch konventionelle Sequenzierung allein ² zu beurteilen. Durch Ersetzen der konventionelle PCR mit verschlossenen Nukleinsäure (LNA) -vermittelten Wildtyp - blockierende PCR (WTB-PCR) in Sanger - Sequenzierung, Empfindlichkeiten von bis zu 0,1% mutanten Allels in einem Hintergrund von WT ^{2, 3, 4} erreicht werden. ImWTB-PCR, Anreicherung für mutante Allele wird über die Zugabe eines kurzen erreicht (~ 10 bis 14 NT) Blocking (LNA) Oligonukleotid, das bevorzugt an WT DNA wodurch verhindert Amplifikation von WT DNA bindet. Die Mutante angereicherte WTB-PCR-Produkt kann dann sequenziert werden. WT DNA anstelle der Auswahl für spezifische Mutationen WTB-PCR ermöglicht die Anreicherung von bekannten und unbekannten Mutationen in winzigen Zellfraktionen durch die Blockierung.

Mehrere Verfahren sind zum Nachweis von Mutationen in kleinen Zellen Fraktionen derzeit verwendet. Dazu gehören allelspezifische PCR Amplifikation-Refractory Mutation System (ARMS), denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (DHPLC), Perlen, Emulsionen, Amplifikation und Magnetics (beaming), elektrisches Feld induzierte Freisetzung und Messung (Efirm), hochauflösende Schmelzpunkt und andere. Allerdings sind die meisten dieser Methoden begrenzt durch falsch-positive und die Fähigkeit, nur eine Mutation nachzuweisen , dass der Assay entwickelt wurde ⁴ . WTB-PCR, jedoch ermöglicht es dem Benutzer Sequenzierungsspuren sichtbar zu machen, die den Nachweis mehrerer Mutationstypen ermöglicht und in auszuschließen Fehlalarme aufgrund Artefakte oder Desaminierung Ereignisse helfen können. Next-Generation-Sequencing (NGS) eine geeignete Alternative zu herkömmlicher Sequenzierung bieten kann jedoch wesentlich höher Kosten, Komplexität und mehr Testzeit machen ihnen eine unnötige Option für viele Krankheitstypen mit wenige verschiedenen molekularen Marker oder zur Überwachung von Patienten auf Therapie für die Schwellen Resistenzmutationen. Weiterhin hohe falsch positive Raten bei der Erkennung Varianten mit mutanten Allel - Häufigkeiten von weniger als 5% können ein Problem für Amplicon-Basis darstellen NGS ^{5, 6.}

Hier zeigen wir die Steigerung der Empfindlichkeit erreicht durch WTB-PCR in Screening auf Mutationen in dem myeloischen Differenzierungsfaktor 88 - Gen , wie durch Albitar et al. ³ MYD88 mutations sind wichtige diagnostische und prognostische Faktoren in Morbus Waldenström (WM), IgM monoklonaler Gammopathie unklarer Signifikanz (IgM-MGUS), Milz- Randzone Lymphom (SMZL) und diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom (DLBCL). MYD88 Mutationen sind in fast allen Fällen von WM und etwa 50% der Patienten mit Immunoglobulin M (IgM) -sezernierenden MGUS gefunden. Im Gegensatz dazu sind MYD88 Mutationen in nur 0-6% der Patienten mit SMZL und fehlt bei multiplem Myelom ^{7, 8} gefunden. Da überlappende morphologischen, immunphänotypische, zytogenetischen und klinische Charakteristika zwischen WM und SMZL oder IgM-multiplem Myelom häufig Differentialdiagnosen können, das Vorhandensein einer Mutation MYD88 komplizieren kann als nützlich identifiziert Faktor ⁹ dienen. MYD88 Mutationen auch mit einem größeren Krankheitsbelastung bei Patienten mit DLBCL und schlechter Gesamtüberlebenszeit nach der Therapie ^7, in Verbindung gebracht worden ^10. Darüber hinaus, da MYD88 Mutationen sind häufiger in aktivierten B-Zell-like (ABC) DLBCL als Keimzentrum-B-Zell-like (GCB) DLBCL oder primärer mediastinalen B-Zell-Lymphom (PMBL), MYD88 Mutationsstatus als dienen kann gefunden Surrogatmarker für das ABC - Subtyp ^{11, 12.}

Das detaillierte Protokoll hier zur Verfügung gestellten dient als Vorlage, aus denen neue Tests entwickelt werden können, oder die meisten bestehenden Sequenzierung Assays können leicht genau angepasst werden, um Niederfrequenz Mutationen in verschiedenen Probentypen zu erkennen. Der Ansatz kann auch zur Überwachung und Erfassung resistente Mutationen verwendet werden, die in Tumoren oder sogar Bakterien entwickeln können, die sie entwickeln kann, während Patienten mit gezielter Therapie oder Antibiotika behandelt werden. Darüber hinaus richtet sie und Abhilfen viele der Probleme mit der Mutation Anreicherung verbunden sind, insbesondere in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe in Formalin fixiert.

Protokoll

Ethik Statement: Alle Tests von menschlichen Proben wurden durchgeführt, nachdem Institutional Review Board (IRB) die Genehmigung zu erhalten.

1. DNA Extraktion aus FFPE Tissue, peripherem Blut und Knochenmark-Aspirat

1. Für FFPE Gewebe Knochenmark mit DNA-Extraktions-Kits FFPE
   1. Beginne mit FFPE Geweben von ungefärbten Folien (von 5 bis 10 Abschnitte mit einem 5 - 10 um Dicke).
      HINWEIS: Bei Beginn mit Gewebespänen verwenden 3 bis 6 Abschnitte mit einer 5 - 10 um Dicke und überspringt zu Schritt 1.1.6.
   2. Legen Sie Folien in einer Dia-Korb und bereiten vier Waschwasserbecken (zwei für Xylen und zwei für 100% Alkohol). In jeden Korb ein Mindestvolumen von 600 ml Lösung.
   3. Deparaffinisieren die Folien durch in der ersten Schale 5 min Xylol waschen zu tun. Die Objektträger in der zweiten Xylol Spülwanne für weitere 5 min.
   4. Nach Entparaffinierung, waschen Sie die Folien mit 100% Alkohol 5 min. Die Objektträger in der zweitenAlkohol Spülwanne für weitere 5 min.
   5. Lassen Sie die Folien vor dem Abschaben sie mit einer Rasierklinge in ein Mikrozentrifugenröhrchen vollständig unter einer Abzugshaube trocknen.
      HINWEIS: Wenn ein H & E Schlitten mit Tumorregion angegeben zur Verfügung steht, die Folien ausrichten und nur die Tumorregion kratzen.
   6. Gehen Sie mit den Anweisungen des Herstellers Handout im Bausatz enthalten.
2. Für BM absaugen und peripherem Blut
   1. Extrahieren Sie nach den Anweisungen des Herstellers Handout mit diesen Spezifikationen.
      HINWEIS: Es gibt zahlreiche im Handel erhältliche Kits und Verfahren zur DNA-Extraktion aus FFPE Geweben und Zellen. Praktisch können alle verwendet werden. Verwendet ein Verfahren, das im Labor hergestellt wird.
      1. Verwenden 200 & mgr; l peripheres Blut (PB) oder 100 ul BM + 100 & mgr; l PBS.
      2. Verwenden Sie 4 & mgr; l RNase A-Stammlösung.
      3. Eluieren mit 100 & mgr; l Elutionspuffer.
3. DNA-Quantifizierung
   1. Messung von DNA-Konzentrationen unter Verwendung einen Spektralphotometers ein 260 nm / 280 nm-Verhältnis von etwa 1,8 (bei reiner DNA) zu gewährleisten. Wenn das Verhältnis wesentlich niedriger ist, kann sie die Anwesenheit von Protein, Phenol oder anderen Verunreinigungen zeigen, die mit Downstream-Anwendungen stören können.
   2. Justieren DNA-Konzentrationen auf etwa 50 bis 100 ng / & mgr; L mit dem entsprechenden Elutionspuffer.

2. Wildtyp-PCR-Blocking

1. Primer-Design
   1. Design und erhalten Primer für die Gene von Interesse nach zuvor beschriebenen allgemeinen Richtlinien des PCR - Primer - Designs ^13. Fügen Sie M13-Vorwärts- und Rückwärts-Universal-Sequenzierungs-Primer in PCR-Primer.
      HINWEIS: Der Assay MYD88 Exon 5 von MYD88 zu amplifizieren entwickelt (G259 - N291) und 110 in der 5' befindet Nukleotide intronischen Region, die die Spleißstelle und ein Teil von Intron 4 zu bedecken die Vorwärts- und Rückwärtsprimer wurden entwickelt, um mit einem 5' -M13-Sequenz (M13-forward: tgt aaa ACG ACG GCC AGT; M13-Rückwärts: CAG GAA ACA GCT ATG ACC) für das Annealing von komplementären Sequenzierungsprimern (siehe Materialien Table) zu ermöglichen.
2. Locked Nucleic Acids Oligonukleotid-Entwurf
   1. Entwerfen des blockierende Oligonukleotid etwa 10 bis - 15 Basen lang und komplementär zu der WT-Vorlage, wo mutanten Anreicherung gewünscht wird.
      HINWEIS: Eine kürzere Oligo wird Mismatchdiskriminierung verbessern. Um eine hohe Zielspezifität zu erreichen, ist es wichtig, nicht zu viel zu verwenden, blockiert Nukleotiden, da diese in einem sehr „klebrig“ Oligonukleotid führen kann. Der Inhalt und die Länge und die blockierende Nucleotid sollte entsprechend der spezifischen Nukleotid optimieren werden, die blockiert werden müssen. Es ist wichtig, eine hohe Bindungsspezifität zu erreichen, ohne Sekundärstruktur zu beeinträchtigen und Selbst Komplementarität zu riskieren.
   2. Entwerfen der blockierenden Oligo eine T _m 10 haben - 15 ° C über der Verlängerung temperature während Thermozyklisierung. Stellen Sie die T _m durch Hinzufügen oder Entfernen von blockierenden Basen oder durch Basen für die DNA - Blockierung bei gleichzeitiger Vermeidung lange Strecken Einsetzen von (3 bis 4 Basen) des Blockierens G oder C - Basen.
      1. Navigieren Sie zu dem Oligo - Tools - Website (siehe Tabelle der Materialien) und wählen Sie die „Blockierung Oligo Tm Prediction“ -Tool.
      2. Einfügen der Sequenz der WT-Vorlage, die gewünscht wird, in die „Oligo Sequence“ abgeblockt wird. Add „+“ vor Basen-Blocker Basen anzuzeigen.
      3. Wählen Sie den „Berechnen“ , um die ungefähre _Tm der DNA-Blocker - Hybrid zu bestimmen.
   3. Entwerfen Sie die Blockierung Oligo Sekundärstrukturbildung oder Selbst Dimere zu vermeiden.
      1. Navigieren Sie zu dem Oligo - Tools - Website (siehe Tabelle der Materialien) und wählen Sie die „Blockierung Oligo Optimizer“ -Tool.
      2. Einfügen der Sequenz der WT-Vorlage, die gewünscht wird, in die Box blockiert werden. Add „+“ vor Basen blockiert Basen anzuzeigen.
      3. Wählen Sie die beiden Boxen für „Sekundärstruktur“ und „Nur selbst“. Drücken Sie die Taste, um die Analyse Oligo für potenziell störende Nebenstrukturen oder Selbst Dimere zu überprüfen.
         HINWEIS: Die Noten repräsentieren sehr grobe Schätzungen der T _m ‚s der Sekundärstrukturen und Selbst Dimere. Niedrigere Werte sind daher optimal und können durch eine Begrenzung Blocker-Blocker Paarung erreicht werden. Die Blockierungs-Oligonucleotid für MYD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + G + T + A + T + CC / invdT /)] wurde entwickelt, um die Aminosäuren Q262-I266 zu bedecken und verfügt über ein 3'-invertierten dT sowohl Verlängerung durch DNA-Polymerase und Abbau durch 3'-Exonuclease zu hemmen. Diese spezifische blockierende oligo ist ein 17-mer mit 10 blockierenden Basen, die als „+ N“ bezeichnet sind. Die verbleibenden 7 Basen sind gewöhnliche DNA-Nucleotide.
3. WTB-PCR-Setup und Thermocycling
   1. Bereiten Sie einen WTB-PCR Master mix (MMX) 2,5 & mgr; l PCR - Reaktionspuffer 10x w / 20 mM MgCl _2, 250 & mgr; M dNTPs, 0,2 & mgr; M Vorwärts und Rückwärtsprimer, 1.2 uM MYD88blocker und DNAse, RNAse-frei, ultrareines H ₂ O , um eine endgültige zu schaffen unter Verwendung von Lösungsvolumen von 21,75 & mgr; l pro Reaktion.
      HINWEIS: Die Arbeitskonzentrationen sind für die endgültigen Reaktionsvolumen von 25 & mgr; l (nach der Zugabe von DNA-Matrize und Polymerase). Herkömmliche PCR MMX wird durch einfaches Weglassen der Zugabe von Blocker hergestellt. Alle Protokollschritte bleiben identisch für beide WTB und konventionelle PCR. Dies kann bei der Validierung und Bestimmung Anreicherung durch Zugabe von Blocker erreicht werden.
      1. Wenn die Menge der MMX Berechnung vorzubereiten für 3 zusätzliche Reaktionen (positive und negative Kontrollen und eine nicht-Kontrolle zu überprüfen, für die Kontamination) und zumindest 1 weitere Reaktion zum Pipettieren Fehler zu berücksichtigen, stellen Sie sicher.
   2. Vortex MMX gründlich. Die MMX kann bei -80 ° C gelagert werden bis ayOhr.
   3. Zugabe von 0,25 & mgr; l Taq DNA-Polymerase pro Reaktion auf den MMX und Invertzucker zu mischen. Sobald die Polymerase an die MMX hinzugefügt wurde, halten Sie es auf Eis.
   4. Legen Sie eine neue 96-Well-PCR-Platte auf einer kalten Platte und Pipette 22 ul MMX mit Polymerase zu jeder Well Reaktion.
   5. Fügen 3 ul genomische DNA (50 bis 100 ng / & mgr; l zu jedem der Vertiefungen mit dem MMX-Polymerase enthalten.
   6. Verschließen Sie die Platte und Zentrifuge kurz die Lösung erreicht den Boden jeder Vertiefung zu gewährleisten.
   7. Laden Sie die PCR-Platte auf einem Thermocycler.
      1. Stellen Sie die thermozyklischen Bedingungen für die WTB-PCR-Reaktion wie folgt: anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 6 min; 40 Zyklen der Denaturierung bei 95 ° C für 30 s, Primer-Annealing bei 56 ° C für 30 s und Verlängerung bei 72 ° C für 1 min 20 s; letzte Verlängerung bei 72 ° C für 10 min.
         HINWEIS: Beste Praxis beinhaltet in einem räumlich getrennten Bereich, den Rest des Protokolls abgeschlossen Amplikonkontamination zu vermeiden in Zukunft Setups.
4. Perform - Gelelektrophorese nach vorher beschriebenen Protokollen ^14, um zu bestimmen , ob WTB-PCR erfolgreich war , und einen Mangel an Verstärkung in dem nicht-Templat zu bestätigen.
5. Aufreinigung von PCR-Produkt von magnetischen Kügelchen
   1. Entfernen magnetische Kügelchen von 4 ° C und bringt auf Raumtemperatur.
   2. Übertragen Sie 10 & mgr; l PCR-Produkt zu einer neuen PCR-Platte.
   3. Vortex kräftig die magnetischen Kügelchen vollständig die magnetischen Partikel resuspendieren.
   4. In 18 ul magnetische Kügelchen zu jeder Vertiefung auf die neue Platte. Pipette 10 Mal mischen.
   5. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min.
   6. Platzieren Sie die PCR-Platte auf der Seite Röcke Magnetplatte für 2 Minuten zur Trennung Perlen aus der Lösung.
   7. Den Überstand aspirieren mit einer Mehrkanalpipette, um den Wulst Pellet zu vermeiden.
   8. Dispense 150 & mgr; l 70% Ethanol in jede Vertiefung und Inkubieren bei Raumtemperatur for mindestens 30 s. Saugen Sie das Ethanol mit einer Mehrkanalpipette und Tipps verwerfen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch einmal.
   9. Unter Verwendung einer 20 & mgr; l Mehrkanalpipette die verbleibende Ethanol aus jeder Vertiefung verworfen und Spitzen abzusaugen.
   10. Sobald Vertiefungen trocken (~ 10 min) sind, von der Magnetplatte zu entfernen, und 40 & mgr; l Nuklease freies Wasser zu jeder Vertiefung und Pipettenmischung 15-mal oder vortex sanft hinzuzufügen.
   11. Inkubiere bei Raumtemperatur für 2 min.
   12. Platzieren Sie die PCR-Platte auf Magnetplatte für 1 min auf getrennte Perlen aus der Lösung.
   13. Transfer 35 ul gereinigtes Produkt eine neue PCR-Platte. Dies ist gereinigte PCR-Produkt nun bereit ist, mit bidirektionaler Sequenzierung, um fortzufahren oder können, bis sie benötigt bei -20 ° C gelagert werden.
       HINWEIS: Wenn Sie einen neuen Test zu entwickeln, die Quantifizierung des gereinigten PCR-Produkts erforderlich. Von 1 bis 3 ng / & mgr; l DNA-Amplikon ist optimal für die bidirektionale Sequenzierung. Wenn Konzentration konstant niedrig ist, erhöht PCR-Produkt und magnetische Kügelchen proportional (1: 1.8). Wenn Konzentration konstant hoch ist, mit einem größeren Volumen Wasser eluieren.

3. Sequenzierung des WTB-PCR-Produkt

1. Bidirektionale Sequenzierung
   HINWEIS: Das folgende Protokoll eine modifizierte Form der Anweisungen des Herstellers, die optimiert wurde weniger Reagenzien zu verwenden.
   1. Bereiten Vorwärts- und Rückwärts - Sequenzierungsreaktion vermischt sich mit 0,25 & mgr; l Ready Reaction Mix, 1,88 & mgr; l Sequenzierungspuffer, 1,78 & mgr; M M13-F oder M13-R - Sequenzierungsprimer und fügen und DNAse, RNAse-frei, ultrareines H ₂ O , um eine endgültige Lösung zu schaffen Volumen von 9 & mgr; l pro Reaktion. Diese Sequenzierung Reaktionsmischung kann bis zu einem Jahr bei -20 ° C gelagert werden.
   2. Pipette 9 ul der Vorwärts-Sequenzierungsreaktionsmischung in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-PCR-Platte für die Vorwärtssequenzierungsreaktion. Wiederholen Sie auf einer separaten Platte für die Rückwärtssequenzierungsreaktion.
   3. 1 & mgr; l des gereinigten WTB-PCR-Produkt to jede Vertiefung auf sowohl die Vorwärts- und Rückwärts-Platten.
   4. Verschließen Sie die Platte und Zentrifuge kurz die Lösung erreicht den Boden jeder Vertiefung zu gewährleisten.
   5. Laden Sie die PCR-Platte auf einem Thermocycler.
      1. Stellen Sie die thermozyklischen Bedingungen für die Sequenzierungsreaktion wie folgt: 96 ° C für 1 min; 30 Zyklen von 96 ° C für 10 s, 50 ° C für 5 s, 60 ° C für 4 min; zur Reinigung bei 4 ° C, bis sie bereit halten.
2. Reinige Sequenzierungsprodukte
   1. Eine frische Lösung von 01.25 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 100% igem Ethanol.
   2. Bereiten Sie eine frische 70% Ethanollösung.
   3. Zugabe von 30 & mgr; l Natriumacetat / 100% Ethanol-Lösung zu jeder Vertiefung sowohl die Vorwärts- und Rückwärts-Sequenzierungsplatten und Pipetten Mischung 5 mal.
   4. die Platte wieder zu verschließen und für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
   5. Zentrifugieren der Platte bei 2.250 xg für 15 min.
   6. Entfernen Sie die Abklebefolie und invertieren über einen AbfallContainer.
      HINWEIS: Invert nur einmal oder das Pellet aus den Vertiefungsböden lösen kann.
   7. Legen Sie die umgedrehte Platte auf einem sauberen Papiertuch und Zentrifuge bei 150 × g für 1 min.
   8. In 150 & mgr; l 70% Ethanol zu jeder Vertiefung.
   9. Reseal die Platte und Spin bei 2.250 × g für 5 min.
   10. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.6 und 3.2.7.
   11. Wenn die Vertiefungen nicht vollständig trocken sind, damit sie bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Stellen Sie sicher, dass die Proben vor Licht geschützt werden, während Trocknen.
   12. In 10 & mgr; l Formamid in jede Vertiefung und Pipette Mix 10-mal. Reseal die Platte.
   13. Denaturieren auf Thermocycler bei 95 ° C für 3 min um 4 ° C für 5 min.
   14. Nach Denaturieren Ersetzen auf Sequenzierung Plattform die Plattenversiegelung mit Septen und Sequenz gemäß den Anweisungen des Herstellers ^15.

4. Analyse der Sequenzierungsergebnisse

1. Visualisieren Sequenzierung Spuren eine Sequenzierung dat miteine Analysesoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers ¹⁶ und zu den jeweiligen Referenzsequenzen auszurichten. Richten MYD88 zu NCBI Referenzsequenz „NM_002468“.

Ergebnisse

Eine konzeptionelle Übersicht über WTB-PCR während der Extension ist in Abbildung 1 dargestellt. Da eine einzelne Nukleotid Fehlpaarung in dem Blocker-DNA - Hybrid seine Schmelztemperatur stark abnimmt (& Delta; T _m = 20 - 30 ° C), die Amplifikation des WT Allel blockiert wird , während mutieren Template - DNA frei ist Verlängerung abzuschließen ^17. Auf diese Weise wird mutierte DNA amplifiziert exponentiell während WT DNA l...

Diskussion

Die WTB-PCR - Assay beschrieben hier verwendet einen generischen Satz von Primern mit einem blockierenden Oligo während des Ausfahrens (Figur 1) zu blockieren Amplifikation von WT DNA konstruiert. Das WTB-PCR-Produkt wird dann für Mutationsanalyse sequenziert. Die Nützlichkeit der WTB-PCR / Sanger liegt in seiner Einfachheit, hohe Empfindlichkeit und hohen Durchsatz. Mit den hier beschriebenen Richtlinien, die meisten bestehenden Sanger basierte Assays können einfach über die Zugabe eines blockiere...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes	Eppendorf	05-402-25
100% alcohol	VWR	89370-084	Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer	ABI		or equivalent
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils	GeneMate	T-2451-1	For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit	Life Technologies	4337455	For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series	Eppendorf		A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates	Eppendorf	Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100 mM)	Invitrogen	10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet	Thermo Fisher Scientific	12027	For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute	Sigma	E7023	200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools			www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL)	Roche	12032937001	With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus			2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit	Qiagen	180134	Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide	ABI	4311320	For sequencing.
LNA oligonucleotide	Exiqon	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer	ABI		5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer	ABI		5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler	Eppendorf	E950030020
Microcentrifuge Model 5430	Eppendorf		FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer	IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates	GeneMate	T-3107-1
Pipettors			20, 200, 1,000 µL
Plate septa, 96 well	ABI	4315933
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304	For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0	ABI	4474978	For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3 M, pH 5.2)	Sigma	S7899
Sterile filtered pipette tips			20, 200, 1,000 µL
Thermomixer C	Eppendorf	5382000023
Vortex genie	Scientific Industries	SI-0236
Wash reservoir			~ 1,000 mL
Xylene	VWR	89370-088	Histology grade