Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

Özet

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Özet

Hassas algılama ve düşük frekanslı mutasyon tanımlama tedavisi sırasında direnç mutasyonları ortaya için tarama, tedavi sonrasında kalan hastalık değerlendirilirken sorunlu olabilir, ya da hastaların birkaç dolaşımdaki tümör hücrelerinin olduğunda. dizi analizi, ardından PCR bloke Yabani tip, bu düşük frekans mutasyonları tespit etmek için bir yöntem olarak, yüksek hassasiyet, esneklik ve kolaylık sunar. tespit edilmiş bir yeni veya daha önce geleneksel PCR bazlı sıralama deneyi için nükleik asit oligonükleotid kilitli özel tasarlanmış ekleyerek, 1000 WT alel kökenli, yaklaşık 1 mutant allelin duyarlılıkları (: 1000 1) elde edilebilir. deaminasyon olaylarla ilişkili Ardışık eserler yaygın kısmen ekstraksiyon adımları sırasında urasil DNA glikosilaz kullanımı ile giderilebilir formalinde tespit edilmiş parafine gömülmüş dokularda bulunan. Optimize edilmiş protokol burada MyD88 mutasyonu tespit etmek için özeldir, ancak herhangi tasarlamak için bir şablon olarak hizmet verebilirWTB-PCR deneyi. PCR, gerçek zamanlı kantitatif PCR yanlış pozitiflerin az oluşumları, daha büyük esneklik ve uygulama kolaylığı, özel allel de dahil olmak üzere düşük frekanslı mutasyonların saptanması için yaygın olarak kullanılan deneylerde fazla WTB-PCR yöntemi avantajları, ve her ikisi de bilinen tespit yeteneği ve bilinmeyen mutasyonlar.

Giriş

Sanger sıralama geleneksel olarak bilinen ve bilinmeyen somatik mutasyonları için test altın standart olmuştur. Sanger sekanslama sınırlamaların bir algılama onun sınırı (~ 10 - WT bir arka içinde% 20, mutant alel) ^1. hassasiyet düzeyi, birkaç dolaşımdaki tümör hücreleri veya kemik iliği (BM) düzensiz olduğu zaman ile premalign dokular ya da hastalardan alınan örneklerde bulunabilen düşük seviyede somatik mutasyonları tespit etmek için uygun değildir. Bu aynı zamanda, tedavi sonrası kalan hastalık teşhisinde ya da tek ^{başına, 2,} geleneksel dizileme ile zor tedavi sırasında gelişen direnç mutasyonları tespit yapar. Kilitli nükleik asit (LNA) geleneksel PCR değiştirerek Sanger dizileme PCR'yi (WTB-PCR) ile bloke vahşi tip aracılı, WT bir arka planda% 0.1 mutant allelin hassasiyetleri ^{2, 3, 4} elde edilebilir. İçindeWT DNA WT DNA, bir avantaj olarak amplifikasyonuna tercihli olarak bağlanan - (14 NT ~ 10) bloke edilmesi (LNA) oligonükleotid WTB-PCR, mutant alelleri için zenginleştirme kısa eklenmesi ile elde edilir. Mutant zenginleştirilmiş WTB-PCR ürünü daha sonra sıralanabilir. WT DNA engelleme yerine belirli mutasyonların seçilerek WTB-PCR, dakikada hücre fraksiyonlarında mevcut bilinen ve bilinmeyen mutasyonlar zenginleştirilmesi için izin verir.

Çeşitli yöntemler halen küçük hücre fraksiyonlarında mutasyonları tespit etmek için kullanılır. Bu, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (DHPLC), taneler, emülsiyonlar, amplifikasyon ve manyetizma (ışık saçan), elektrik alan ile indüklenen serbest bırakılması ve ölçüm (EFIRM) denatüre allel spesifik PCR amplifikasyon refraktör mutasyon sistem (ARMS), yüksek çözünürlük içerir erime noktası ve diğerleri. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğu yanlış pozitiflerin ve sadece deney ⁴ için tasarlanmış bir mutasyon tespit etme yeteneğine sınırlıdır Sup. WTB-PCR, bununla birlikte, çok sayıda mutasyon tipleri tespit edilmesini sağlar ve eserler veya deaminasyon olaylar nedeniyle yanlış pozitif dışlanması yardımcı olabilir dizileme izleri görselleştirmek için olanak sağlar. Yeni dizileme (NGS) konvansiyonel sekanslama için uygun bir alternatif sunmaktadır, bununla birlikte, önemli ölçüde daha yüksek maliyetler, karmaşıklık ve daha uzun deney süresi o birkaç farklı moleküler işaretlerle birçok hastalık tipleri için ya da ortaya çıkan için tedavisi gören hastaların izlenmesi için gereksiz bir seçenek sunmak direnç mutasyonları. % 5'den daha düşük mutant alel frekansları ile Ayrıca, yüksek yanlış pozitif oranlar tespit varyantlar ^6, amplikon bazlı NGS ⁵ için bir problem teşkil edebilir.

Burada Albitar ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi miyeloid farklılaşma faktörü 88 geninde mutasyon taranmasında WTB-PCR ile elde edilen duyarlılık artışı göstermektedir. ³ MyD88 mutations Waldenstrom Makroglobulinemı (WM) bilinmeyen önemi (IgM-MGUS'u) arasında, IgM monoklonal gammapati, dalak marjinal zon lenfoma (SMZL) önemli tanısal ve prognostik faktörlerdir ve büyük B hücreli lenfoma (DBBHL) dağınık. MyD88 mutasyonları WM hemen hemen tüm vakalarda ve İmmünoglobulin M (IgM) MGUS salgılayan olan hastaların yaklaşık% 50'sinde bulunur. Çelişkili, MyD88 mutasyonlar SMZL hastaların sadece% 0-6 bulunan ve çok merkezli miyelom ^{7, 8} mevcut olmayan. Üst üste binen morfolojik, immünofenotipik sitogenetik ve WM ve SMZL ya da çoğu zaman diferansiyel teşhisleri karmaşık IgM, multipl miyelom ile klinik özellikleri nedeniyle, bir MyD88 mutasyonun varlığı faydalı bir tanımlama faktör ⁹ olarak hizmet edebilir. MyD88 ^mutasyonlar, tedavi ⁷ Aşağıdaki DLBCL ve kötü genel sağkalımla hastalarda daha fazla hastalık yükü ile ilişkilidir ^10. Ayrıca, MyD88 mutasyonları daha sık aktive B hücreli benzeri (ABC) DBBHL bulunur çünkü B-hücresi benzeri (GCB) DBBHL veya primer mediastinal B hücreli lenfoma (PMBL), MyD88 mutasyon durumu olarak hizmet edebilir germinal merkez ABC alt tipi ^{11, 12,} surrogate markın.

burada sağlanan detaylı bir protokol, yeni analizler geliştirilebilir ya da Varolan dizilim deneyleri kolayca doğru çeşitli örnek tipler, düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için adapte edilebilir bir şablon olarak hizmet vermektedir. yaklaşım izleme ve tümör veya hasta hedefli bir tedavi ya da antibiyotikler ile tedavi ediliyor ise gelişebilir bakterilerde bile gelişebilir dirençli mutasyonları tespit etmek için kullanılabilmektedir. Ayrıca, adresleri ve özellikle formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) dokusu içinde, mutasyon zenginleştirme ile ilişkili sorunların çoğu ilaçlar.

Protokol

Etik Beyanı: İnsan numunelerinin tamamı test Kurumsal İnceleme Kurulu (KİK) onayı alındıktan sonra yapıldı.

1. FFPE Doku DNA ekstraksiyonu, Periferal Kan ve Kemik İliği aspire

1. DNA, FFPE ekstraksiyon kiti ile kemik iliği FFPE dokusu için
   1. boyanmamış Slaytlardan FFPE doku ile başlayın (5-5, 10 bölümleri - 10 um kalınlıkta).
      Not: Doku talaşı ile başlangıç, 3 kullanıldığında - 5 6 bölümleri - 10 um kalınlıkta ve 1.1.6 adıma geçin.
   2. slayt sepet içinde kayarak ve dört yıkama hazneleri (Ksilen için iki ve% 100 Alkol için iki adet) hazırlanması. Her bir sepetin çözelti 600 mL minimum hacim.
   3. ilk tepsiye 5 dakika ksilen yıkama yaparak slaytlar deparafınize. ilave bir 5 dakika boyunca ikinci bir ksilen yıkama haznesine slaytlar aktarın.
   4. Parafinden arındırmadan sonra, 5 dakika% 100 alkol ile slaytlar yıkayın. ikinci slaytlar aktarınilave bir 5 dakika daha alkol yıkama haznesi.
   5. slaytları mikrosantrifüj tüpe bir jilet ile bunları kazıma önce başlık altında tamamen kurumaya bırakın.
      NOT: Tümör bölgesi ile bir H & E slayt gösterdiyseniz kullanılabilir, slaytlar hizalamak ve sadece tümör bölgesini kazıyın.
   6. Set içinde yer alan üretici sadaka gelen talimatlarla devam edin.
2. BM aspire ve Periferik Kan için
   1. Bu özellikleri ile üreticinin talimatları sadaka göre Özü.
      NOT: çok sayıda ticari olarak temin edilebilir kitler ve FFPE doku ve hücrelerin DNA ekstraksiyonu için yöntemler bulunmaktadır. Pratik olarak, tüm kullanılabilir. Laboratuvarda kurulan bir yöntemi kullanın.
      1. 200 uL periferal kan (PB) ya da 100 uL BM + 100 uL PBS kullanın.
      2. 4 mL RNaz A stok solüsyonu kullanın.
      3. 100 uL yıkama tamponu ile seyreltilir.
3. DNA miktar
   1. (Saf DNA için) yaklaşık 1.8'lik bir 260 nm / 280 nm oranı sağlayan bir spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonları ölçülür. oranı tercihan daha düşük ise, bu, bir sonraki uygulamada engel olabilir protein, fenol veya başka kirleticilerin varlığına işaret edebilir.
   2. uygun bir yıkama tampon maddesi ile 100 ng / uL - yaklaşık 50 DNA konsantrasyonları ayarlayın.

PCR Engelleme 2. Vahşi Tür

1. Astar Tasarım
   1. Daha önce göre ilgili genler için tasarım ve elde primerler PCR primeri dizayn ¹³ genel yönergelere tarif. M13-ileri ve PCR primerleri evrensel geri sekanslama primerleri.
      Not: MyD88 deney MyD88 ekson 5 amplifiye etmek için geliştirilmiştir (G259 - N291) 5' bulunur ve 110 nükleotit primerleri intron 4. ileri bir birleşme bölgesini ve bir kısmını kapsar ve ters intronik bölge bir 5' ile tasarlanmıştır -M13 dizisi (M13-ileri: tgt aaa ACG gcc agt; M13-ters: cag gaa aca GCT ATG ACC) (Malzeme Tablo) tamamlayıcı sıralama primerleri tavlanmasına olanak sağlamak için.
2. Kilitli Nükleik Asit Oligonükleotid Tasarımı
   1. Mutant zenginleştirme istenen WT şablonuna 15 baz uzunluğundadır ve tamamlayıcı - yaklaşık 10 olmak bloke oligonükleotid tasarımı.
      NOT: Daha kısa bir oligo uyuşmazlığı ayrımcılık artıracaktır. yüksek hedef özgüllüğü elde etmek için, bu çok "yapışkan" oligonükleotid neden olabilir çünkü çok fazla engelleme nükleotidleri kullanmak önemlidir. içeriği ve uzunluk ve engelleme nükleotid bloke edilmesi gereken spesifik nükleotid zincirleri göre optimize edilmesi gerekir. Ikincil yapı ödün ve kendiliğinden tamamlayıcı riski olmaksızın yüksek bağlanma özgüllüğü elde etmek için önemlidir.
   2. Uzatma sıcaklığında bir 15 ° C'nin üzerinde - bir _T, 10 için bloke oligo tasarımısı banyosunun sırasında ure. G veya C bazları bloke - (4 bazlar 3) ilave ya da bloke edici bazlar kaldırarak ya da uzun menziller kaçınarak DNA engelleme bazları ikame etmek suretiyle, T _m ayarlayın.
      1. Oligo araçları web sitesine gidin (Materyallerin Tablo bakınız) ve "Oligo Tm Tahmin engelleme" aracını seçin.
      2. "Oligo Dizi" kutusuna bloke edilmesi istenen WT, şablon diziyi yapıştırın. bloker üsleri belirtmek için üsleri önünde "+" ekleyin.
      3. DNA Engelleyici melez yaklaşık _Tm belirlemek için "hesaplama" düğmesine basın.
   3. İkincil yapı oluşumunu veya kendinden dimerleri önlemek için bloke oligo tasarlayın.
      1. Oligo araçları web sitesine gidin (Materyallerin Tablo bakınız) ve "Oligo Optimizer engelleme" aracını seçin.
      2. kutu içine bloke edilmesi istenen WT, şablon diziyi yapıştırma. üsleri engelleme belirtmek için üsleri önünde "+" ekleyin.
      3. "İkincil Yapısı" ve "Sadece Kendini" için iki kutularını seçin. Potansiyel sorunlu ikincil yapıların veya kendi dimerleri gibi oligo gözden için analiz düğmesine basın.
         NOT: skorları _Tm 'ın ikincil yapılar ve kendini dimerlerın çok kaba tahminler temsil eder. Alt skorlar, uygun olan ve engelleyici bloker eşleştirme ile sınırlandırılmasıyla elde edilebilir. amino asitler, Q262-I266 kapsayacak şekilde tasarlanmıştır ve özellikleri bir 3'-ters MyD88 [(TCAGA + AG + C + G + A + C, T + G + A + T + CC / invdT / +) MYD88blocker] engelleme oligonükleotit dT 3'-ekzonükleaz ile DNA polimeraz ve bozulma ile, her iki uzatma inhibe ettikleri gösterilmiştir. Bu özel bloke oligo "+ N" olarak belirtilir 10 bloke bazlarla bir 17 mer olan. Kalan 7 baz sıradan DNA nükleotidlerdir.
3. WTB-PCR, kurulum ve Termodongü
   1. Bir WTB-PCR master mil hazırlanmasıx / 20 mM w _MgCl2, 250 uM dNTP'ler, 0.2 uM ileri 2.5 pL PCR reaksiyon tamponu 10x kullanılarak (MMX) ve ters primer, 1.2 uM MYD88blocker ve DNAse, RNAse içermeyen, ultra saf _H2O nihai oluşturmak reaksiyon başına 21.75 uL çözelti hacmi.
      NOT: Çalışma konsantrasyonları (DNA şablonu ve polimeraz ilavesinden sonra), 25 uL nihai reaksiyon hacminde içindir. Geleneksel PCR MMX sadece engelleyicinin ilave atlanması ile hazırlanır. Tüm protokol safhaları WTB ve geleneksel PCR için birbirinin aynısıdır kalır. Bu doğrulama kullanılabilir ve belirleyici zenginleştirme engelleyicinin ilave edilmesiyle elde.
      1. MMX'in miktarı hesaplanırken (kontaminasyonunu kontrol etmek üzere, pozitif ve negatif kontrol ve bir şablon olmayan kontrol) ve pipetleme hata için en az 1 ilave reaksiyon 3 ek reaksiyonlar için hesap emin hazırlamak.
   2. İyice Girdap MMX. MMX AY kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilirkulak.
   3. MMX'in tepki 0.25 uL Taq DNA polimeraz ilave et ve karıştır için ters. polimeraz MMX eklendikten sonra, buz üzerinde tutun.
   4. her bir reaksiyon için polimeraz ile soğuk plaka ve pipet ile MMX'in 22 uL, yeni bir 96 gözlü PCR plaka koyun.
   5. polimeraz ile MMX ihtiva eden yuvaların her birine 100 ng / ml - 3 uL genomik DNA (50 ekleyin.
   6. Çözelti her bir alt ulaşmasını sağlamak için levha ve kısa bir süre santrifüj kapatın.
   7. Bir ısıl üzerinde PCR plakası yükleyin.
      1. aşağıdaki gibi WTB-PCR reaksiyonu için ısı döngüsü şartları ayarlama: ilk denatürasyon 6 dakika boyunca 95 ° C'de; 1 dakika 20 saniye boyunca 72 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 56 ° C'de 30 saniye, primer tavlama için 95 ° C 'de denatürasyon, ve uzantının 40 döngü; 10 dakika boyunca 72 ° C'de son uzatma.
         NOT: En iyi uygulama amplikon kirlenmesini önlemek için fiziksel olarak ayrı bir alanda protokol kalanını tamamlama içerir in gelecekteki kurulumları.
4. WTB-PCR reaksiyonunun başarılı olup olmadığını belirlemek için ve şablon olmayan kontrol amplifikasyonunun bir eksikliği teyit edebilmek için, daha önce tarif edilen protokollere ^14'e göre jel elektroforezi gerçekleştirin.
5. manyetik boncuklar ile PCR Ürünü saflaştırılması
   1. 4 ° C ila manyetik boncuk çıkarın ve oda sıcaklığına getirin.
   2. yeni bir PCR plakaya 10 uL PCR ürünü aktarın.
   3. Vorteks manyetik boncuklar kuvvetli bir şekilde tam olarak, manyetik tanecikleri yeniden sübyeleştirmek için.
   4. Yeni plaka üzerinde her kuyuya 18 ul manyetik boncuk ekleyin. Pipet 10 kez karıştırın.
   5. 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
   6. çözeltiden ayrı boncuklara 2 dakika boyunca yan etekli mıknatıs plakası üzerine, PCR plaka koyun.
   7. Boncuk pelet kaçınarak, çok kanallı bir pipet ile süpernatant aspire.
   8. her birine 150 uL% 70 etanol de koyun ve oda sıcaklığında fo inkübeen az 30 s r. Bir çok kanallı pipet ile etanol aspire ve ipuçları atın. bir kez daha bu yıkama işlemi tekrarlayın.
   9. Bir 20 uL çok kanallı pipet her bir kalan etanol aspire ipuçları atmak kullanılması.
   10. kuyular (~ 10 dakika), kuru, 15 kez veya girdap Mıknatıs plakasından çıkarın ve her bir oyuğa ve pipet karışımına 40 uL nükleaz serbest su ekleyin.
   11. 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
   12. çözeltiden ayrı boncuklara 1 dakika için mıknatıs plakası üzerine, PCR plaka koyun.
   13. yeni bir PCR plakaya saflaştırılmış ürün devri 35 uL. Bu saflaştırılmış PCR ürünü, artık çift yönlü serisi için kullanılmak üzere hazır olduğunu veya ihtiyaç duyulana kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
       Not: yeni tahlil geliştirme, saflaştırılmış PCR ürünü ölçümü gerekebilir. 1-3 ng / uL amplikon DNA çift yönlü sıralama için en uygunudur. konsantrasyonu sürekli olarak düşükse, PCR ürünü ve manyetik boncuk artırmak orantonally (1: 1.8). konsantrasyonu sürekli olarak yüksek ise, daha büyük bir su hacmi ile elüt.

WTB-PCR Ürünü 3. Sekans

1. Çift Yönlü Sıralama
   NOT: Aşağıdaki protokol az reaktif kullanacak şekilde optimize edilmiştir üreticinin talimatlarına değiştirilmiş şeklidir.
   1. İleri hazırlanması ve geri sekanslama reaksiyonu son bir çözelti oluşturmak için ekleme ve DNAse, RNAse içermeyen, ultra saf _H2O 0.25 uL Hazır Reaksiyon karışımı, 1.88 uL Dizileme Tamponu, 1.78 uM M13-F ya da M13-R sıralama primerleri ile karışır reaksiyon başına 9 uL hacmi. Bu dizileme, reaksiyon karışımı, bir yıla kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
   2. İleri dizileme reaksiyonu için yeni bir 96 gözlü PCR plakanın her oyuğuna ileri dizilenmesi tepkime karışımı pipet 9 uL. Ters dizileme reaksiyonu için ayrı bir plak üzerinde tekrarlayın.
   3. Saflaştırılmış WTB-PCR ürünü, t 1 uL ekleyino her bir öne ve plakalar ters hem.
   4. Çözelti her bir alt ulaşmasını sağlamak için levha ve kısa bir süre santrifüj kapatın.
   5. Bir ısıl üzerinde PCR plakası yükleyin.
      1. aşağıdaki gibi sıralama reaksiyonu için ısı döngüsü şartları ayarlama: 1 dakika için 96 ° C; 10 sn için 96 ° C 30 döngü, 5 s için 50 ° C, 4 dakika için 60 ° C; saflaştırma için hazır olana kadar 4 ° C'de tutun.
2. Sıralama Ürünleri arındırın
   1. 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve% 100 etanol içinde taze 01:25 çözelti hazırlayın.
   2. taze% 70 etanol çözeltisi hazırlayın.
   3. sodyum asetat, 30 uL dizileme plakaları ve pipet karışımı 5 kat hem ileri ve geri her oyuğuna /% 100 etanol çözeltisi ekleyin.
   4. plaka şekilde kapatılıp ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edilir.
   5. 15 dakika boyunca 2,250 x g'de plaka santrifüjleyin.
   6. Plaka kapatıcıyı çıkarın ve atık üzerinde tersbir kap.
      NOT: İnvert sadece bir veya pelet kuyu diplerinde gelen gevşeyebilir.
   7. 1 dakika boyunca 150 x g'de temiz bir kağıt havlu ve santrifüj ile, ters çevrilmiş plakanın yerleştirin.
   8. Her bir oyuğa 150 uL% 70 etanol ekleme.
   9. 5 dakika boyunca 2.250 x g'de plaka ve spin yeniden mühürlemek.
   10. Tekrarlayın 3.2.6 ve 3.2.7 adımları tekrarlayın.
   11. oyuklar tamamen kuru değilse, oda sıcaklığı hava kurumalarına olanak. Kurutma sırasında numuneler ışıktan korumalı olduğundan emin olun.
   12. Her kuyu ve pipet karışımına 10 kez 10 mcL Formamid ekleyin. plaka kapatın.
   13. 5 dakika boyunca 4 ° C'de, ardından 3 dakika süre ile, 95 ° C'de ısıl ile denatüre.
   14. Denatüre sonra imalatçının talimatlarına ^15'e göre sıralama platform üzerinde bölmelerden ve dizisi ile Plaka kapatıcıyı değiştirin.

Ardışık Sonuçlar 4. analizi

1. Bir dizileme dat kullanılarak dizileme izleri Görselleştirinimalatçının talimatlarına ¹⁶ ve ilgili referans dizileri hizalamak için uygun bir analiz yazılımı. NCBI referans bir dizi "NM_002468" için MyD88 hizalayın.

Sonuçlar

Uzantısı boyunca WTB-PCR kavramsal bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir. Bloker-DNA melezi tek nükleotid uyumsuzluğu büyük ölçüde erime sıcaklığını düşürür çünkü (AT _m = 20-30 ° C), WT alel amplifikasyon mutan DNA şablonu uzantısı ¹⁷ tamamlamak için serbesttir ki bu engellenir. WT DNA, lineer yükseltilir ise, bu şekilde, mutan DNA katlanarak yükseltilir.

Tartışmalar

Burada tarif edilen WTB-PCR deneyi uzatma (Şekil 1) sırasında WT DNA'nın amplifikasyonunu engellemek üzere tasarlanmış bir bloke etme oligo primerler genel bir kümesini kullanır. WTB-PCR ürünü daha sonra mutasyon analizi için sekanslanır. WTB-PCR / Sanger yardımcı sadeliği, yüksek hassasiyet ve yüksek verimli olarak bulunur. Burada tarif edilen kurallara kullanılarak, çoğu mevcut Sanger bazlı deneyler sadece büyük ölçüde hassasiyeti artırmak için bir bloke edici oligon?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes	Eppendorf	05-402-25
100% alcohol	VWR	89370-084	Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer	ABI		or equivalent
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils	GeneMate	T-2451-1	For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit	Life Technologies	4337455	For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series	Eppendorf		A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates	Eppendorf	Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100 mM)	Invitrogen	10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet	Thermo Fisher Scientific	12027	For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute	Sigma	E7023	200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools			www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL)	Roche	12032937001	With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus			2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit	Qiagen	180134	Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide	ABI	4311320	For sequencing.
LNA oligonucleotide	Exiqon	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer	ABI		5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer	ABI		5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler	Eppendorf	E950030020
Microcentrifuge Model 5430	Eppendorf		FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer	IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates	GeneMate	T-3107-1
Pipettors			20, 200, 1,000 µL
Plate septa, 96 well	ABI	4315933
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304	For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0	ABI	4474978	For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3 M, pH 5.2)	Sigma	S7899
Sterile filtered pipette tips			20, 200, 1,000 µL
Thermomixer C	Eppendorf	5382000023
Vortex genie	Scientific Industries	SI-0236
Wash reservoir			~ 1,000 mL
Xylene	VWR	89370-088	Histology grade