مختبر إنتاج مقياس وتنقية من الأجسام المضادة العلاجية

Summary

يصف هذا البروتوكول إنتاج الأجسام المضادة العلاجية في نظام التعبير الثدييات. وتشمل الأساليب المذكورة إعداد الحمض النووي ناقلات، ترنسفكأيشن مستقرة والتكيف المصل خالية من الجنينية خط الخلية الكلى 293 البشري، وإنشاء الثقافات على نطاق واسع وتنقية باستخدام تقارب اللوني.

Abstract

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Introduction

استمر نجاح الأجسام المضادة العلاجية لدفع استثمارات كبيرة في تطوير الأجسام المضادة كوسيلة لموجة من العلاجات الجيل القادم تبدأ. ومن المتوقع أن يتم إعادة تشكيل بشظايا الضد ^1، تقارن الضد المخدرات ^2، والأجسام المضادة bispecific ³ والأجسام المضادة هندسيا مع خصائص مواتية ⁴ السوق الأجسام المضادة. فئة أخرى كسب الفائدة الدوائية هي البدائل الحيوية. الأجسام المضادة بدائل حيوية هي "مشابهة للغاية" تكرار المنتجات من الأجسام المضادة العلاجية التي حصلت بالفعل على موافقة الجهات التنظيمية. يجب أن تكون بدائل حيوية المقترحة قابلة للمقارنة مع الأجسام المضادة المنشئ فيما يتعلق بنيته، وظيفة، سمية الحيوانية والسلامة السريرية والفعالية والدوائية الإنسان (PK)، الدوائية (PD) والمناعية ^{5، 6.}

موافقة صوقد آتش الأجسام المضادة بدائل حيوية بطيئا بسبب القيود الصارمة على الجودة النهائية للمنتج. عمليات التصنيع الدقيقة مثل خطوط الخلايا وشروط زراعة محددة وصولا إلى خطوات المعالجة النهائية يمكن أن تبقى الملكية. ما هو أكثر من ذلك، تصنيع الأجسام المضادة ينطوي بطبيعته على درجة من التباين التي يمكن أن تضيف إلى التحدي المتمثل في إنتاج منتج مماثل للغاية. توصيف والمقارنة الفيزيائية والفيزياء الحيوية شامل من الصعب جدا، ولكن عددا من الدراسات مما يدل على خصائص الأجسام المضادة بدائل حيوية تظهر في الأدب ^{7، 8، 9.}

توليد الأجسام المضادة العلاجية يبدأ ترنسفكأيشن من الخلايا المضيفة الثدييات مع ناقلات تحمل جينات الأضداد منها. تصميم ناقلات، خط الخلية والثقافة الشروط هي الاعتبارات الأساسية لإعداد السابقنظام الضغط و.

تسلسل الحمض النووي من الأجسام المضادة يمكن أن يكون مصدر من البنك المخدرات (www.drugbank.ca)، IMGT (www.igmt.org) أو المنشورات البحثية بما فيها براءات الاختراع. على سبيل المثال، وتسلسل تراستوزوماب يتوفر من خلال بنك المخدرات (ID DB: DB00072). تسلسل الأحماض الأمينية من المناطق المتغيرة يمكن أن يخضع تصميم الجينات والاستغلال الامثل للتركيب في الأنواع المضيفة المطلوب. من المهم بالنسبة الأجسام المضادة بدائل حيوية أن يتم إجراء أي تعديل لتسلسل الأحماض الأمينية. مرة واحدة توليفها، الجينات الأجسام المضادة يمكن subcloned في ناقلات المناسبة في الاختيار.

تتكون الأجسام المضادة البشرية من سلسلتين الثقيلة متطابقة وسلسلتين ضوء متطابقة. التعبير ينظم بإحكام كل السلاسل هو ضروري لإنتاج الأمثل للمغاير البروتين مفتش في خلايا الثدييات ^10. داخل الإقليم مثل جيدا يجب أن تشكل السندات ثاني كبريتيد بين سلسلة وعدد من التعديلات بعد متعدية يجب أن تكون فيعرضوا خلال الحيوي البروتين. تتوفر التي تم تصميمها خصيصا للتعبير عن الجينات الأجسام المضادة (الرجوع إلى جدول المواد) وهناك عدد من ناقلات. هذه النواقل الضد محددة عادة ما تعبر عن ومناطق ثابتة لسلاسل حد سواء الثقيلة والخفيفة وذلك فقط في مناطق مختلفة من كل سلسلة تتطلب الاستنساخ.

ترنسفكأيشن من الخلايا مع اثنين من بنيات المستقلة (شارك في ترنسفكأيشن) هو النهج الأكثر شيوعا لإيصال الجينات الثقيلة والخفيفة ترميز السلسلة. وهذا هو، هو الدافع وراء كل جين من قبل المروج الخاص بها ونسخها كما سلاسل الأجسام المضادة منفصلة قبل أن يتم تجميعها في الشبكة الإندوبلازمية. من ناحية أخرى، ناقلات متعددة cistronic لها العناصر الداخلية الريبوسوم دخول موقع (IRES) تأسست التي تسمح التعبير عن الجينات متعددة كما نسخة مرنا واحد مع ترجمة المسموح بها من المناطق الداخلية للمرنا ^11. في هذه الحالة، تقترن جينات ترميز السلسلة الثقيلة والخفيفة في arrangement لتحقيق التعاون في التعبير عن كل من سلاسل الأجسام المضادة ^{10 و 12.}

في حين أن الخلايا transfected عابر إنتاج البروتين الكافي لإنجاز عدد محدود من التجارب، وخطوط الخلايا ستابلي التي خضعت لاختيار التكامل الجينوم يمكن أن يحقق عائدات أعلى. ارتفاع كميات البروتين تسمح للتنمية فحص المتعلقة في المختبر توصيف ويمكن أن توفر مؤشرا على نوعية الأجسام المضادة في الاعتبار لتطبيقات المصب مثل خط خلية نسيلي والرائدة اختيار المرشحين.

والهدف من هذه المقالة هو لوصف التعبير مستقر وتنقية الأجسام المضادة العلاجية التي تنتج في نظام التعبير الثدييات. في الواقع، يمكن تطبيق هذه الطريقة للتعبير عن الأجسام المضادة بدائل حيوية. ويمكن استخدام طريقة لتوصيف الأولي من الأجسام المضادة قبل الشروع في لالحرجة، وإن كان الظريف تستغرق وقتا طويلاملاحظة تحديد استنساخ المرغوب فيه التصنيع على نطاق أوسع. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم للتعبير عن البروتينات الأخرى، وليس الأجسام المضادة فقط.

يصف بروتوكول مفصلة التالية التعبير عن تراستوزوماب الأجسام المضادة العلاجية. وهذا يتكون من إعداد الحمض النووي ناقلات تليها ترنسفكأيشن مستقرة في خط خلية كلوة-293 و تنقية البروتين الأجسام المضادة باستخدام أسلوب الكروماتوغرافي الآلي.

Protocol

ملاحظة: يجب استخدام ناقلات التعبير الثدييات مناسبة لهذا البروتوكول. هنا، يتم استخدام بناء واحد يحتوي على اثنين من أشرطة التعبير (أي هو الدافع وراء التعبير سلسلة الثقيلة والخفيفة من قبل المروجين منفصلة). تم استنساخ سلاسل الثقيلة والخفيفة تراستوزوماب سابقا في ناقلات. وكان هذا ناقلات هدية من أندرو Beavil، التي تم الحصول عليها من خلال الأرباح غير هادفة للبلازميد مستودع ^13.

1. الإنعاش ومقياس المتابعة من ناقلات الحمض النووي

ملاحظة: كان في استقبال ناقلات الحمض النووي كثقافة طعنة أجار لينة في سلالة كولاي XL-1 الأزرق؛ ناقلات تحمل المقاومة هيغروميسين.

1. اضافة الى وجود طعنة التلقيح المعقمة أو حلقة في أجار لينة من ثقافة طعنات متتالية ثم لوريا Bertani (LB) لوحة أجار أعدت مع 75 ميكروغرام / مل هيغروميسين للمستعمرات معزولة. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة.
2. تلقيح مستعمرة واحدة في 5 مل مرق رائع (السل) التي تحتوي على 75 ميكروغرام / مل هيغروميسين. Incuباتي الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة مع 225 دورة في الدقيقة تهتز.
3. استخدام الثقافة بين عشية وضحاها لإعداد المخزون الجلسرين من الحمض النووي ناقلات عن طريق خلط بلطف 800 ميكرولتر من ثقافة مع 200 ميكرولتر 80٪ الجلسرين في cryovial وتجميد في -80 درجة مئوية.
   1. إضافة 100 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 100 مل السل التي تحتوي على 75 ميكروغرام / مل هيغروميسين في قارورة شاكر حيرة (أي 1/1000 تمييع). احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة مع 225 دورة في الدقيقة تهتز.
4. بعد ثقافة بين عشية وضحاها، واستخراج وتنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة من إعداد مجموعة ميدي / ماكسي مع الاستثناء التالي. خلال هذه الخطوة، أزل أو و resuspend الحمض النووي النهائي مع الماء (درجة الحموضة 7،0-8،5).
5. تحقق التركيز والنقاء من الحمض النووي عن طريق قراءات الامتصاصية في 260 و 280 نانومتر ثم تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
   ملاحظة: اختياري (يوصى): تسلسل الحمض النووي باستخدام بادئات ناقلات محددة لتأكيد الهوية.

2. ترنسفكأيشن مستقرة من كلوة-293 الخلايا

1. النمو والحفاظ على كلوة-293 الخلايا (خلايا تعليق) وفقا لبروتوكولات موحدة في وسائل الإعلام المصل خالية تستكمل مع 0.1٪ السطحي غير الأيونية في قوارير زجاجية أخرى. الحفاظ على 2 × 10 ⁵ خلية / مل وثقافة فرعية كل يوم الرابع. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ و 120 دوران دورة في الدقيقة.
   كان ينبغي أن يكون خلايا في الثقافة لمدة لا تقل عن 4 أيام وقبل ما لا يزيد عن 4 أسابيع لترنسفكأيشن: ملاحظة. ويمكن أيضا كلوة-293 الخلايا كما نمت الطبقات الوحيدة في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل أن تستخدم لهذا الإجراء.
2. في اليوم قبل ترنسفكأيشن والبذور كلوة-293 الخلايا في 3 × 10 ⁵ خلية / مل في الآبار من لوحة ال 12 أيضا في 2 مل من Dulbecco لتعديل النسر وسائل الإعلام (DMEM) تستكمل مع 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني ( FBS). يوم ترنسفكأيشن، تأكد من أن الخلايا قد وصلت 80-90٪ confluency
3. تخفيف الحمض النووي وpolyethylenimine (PEI) على حدة في وسائل الإعلام ترنسفكأيشن ثم تخلط معا.
   1. تمييع 1.25 ميكروغرام ناقلات الحمض النووي لكل بئر (15 ميكروغرام لمدة 12 بئرا) في 300 وسائل الإعلام ترنسفكأيشن ميكرولتر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   2. تمييع 2.5 ميكرولتر من 1 ملغ حل / مل جزيرة الأمير إدوارد (30 ميكرولتر لمدة 12 بئرا، أي 1: 2 نسبة الحمض النووي لجزيرة الأمير إدوارد) في 300 وسائل الإعلام ترنسفكأيشن ميكرولتر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   3. إضافة الحمض النووي المخفف إلى المخفف جزيرة الأمير إدوارد، مزيج بلطف واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
4. إضافة 50 ميكرولتر من الحمض النووي / جزيرة الأمير إدوارد خليط قطرة قطرة إلى كل بئر من لوحة. صخرة لوحة بلطف لتوزيع الخليط ترنسفكأيشن ثم وضع لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 24 ساعة.
5. إضافة 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين B لكل بئر والعودة لوحة إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 10 يوما.
   ملاحظة: قبل يوم 10، سيكون قد مات خلايا الامم المتحدة وtransfected وفصل من سطح اللوحة، في حين أن الخلايا ستابلي، ستكون قادرة على البقاء وتعلق على لوحة.
6. استبدال وسائل الإعلام في الآبار مع1/4 حجم وسائل الإعلام الحرة المصل و3/4 حجم DMEM تستكمل مع FBS 10٪ (أي 0.5 مل سائل الإعلام الحرة المصل + 1.5 مل DMEM = 7.5٪ تركيز مصل النهائي)، واحتضان لمدة 4 أيام.
7. استبدال وسائل الإعلام في الآبار مع 1/2 حجم وسائل الإعلام الحرة المصل و1/2 حجم DMEM تستكمل مع FBS 10٪ (أي وسائل الإعلام الحرة المصل 1 مل + 1 مل DMEM = 5٪ تركيز مصل النهائي)، واحتضان لمدة 4 أيام.
8. استبدال وسائل الإعلام في الآبار مع 3/4 حجم وسائل الإعلام الحرة المصل و1/4 حجم DMEM تستكمل مع FBS 10٪ (أي 1.5 مل سائل الإعلام الحرة المصل + 0.5 مل DMEM = 2.5٪ تركيز مصل النهائي)، واحتضان لمدة 4 أيام.
9. استبدال وسائل الإعلام في الآبار مع 2 مل من وسائل الاعلام المصل خالية تستكمل مع 0.1٪ غير الأيونية بالسطح (تركيز مصل النهائي 0٪ أي)، واحتضان لمدة 4 أيام.
   ملاحظة: الحفاظ على 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين B ضغط انتقائي على الخلايا خلال التكيف خالية من المصل. خلايا تتكيف مع وسائل الإعلام الحرة المصل فصل من سطح الآبار وقد تتجمع طن تعليق. الرجوع إلى الخطوة 2.1 لظروف التربية مع ملحق إضافي من 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين B.
10. باستخدام ماصة، المزيج بلطف الثقافات تعليق في الخلايا لوحة وتجمع ال 12 أيضا في أنبوب منفصل.
    1. باستخدام عدادة الكريات، تعداد خلايا المجمعة والبذور في 30 مل سائل الإعلام خالية من المصل في دورق مخروطي في 2 × 10 ⁵ خلية / مل. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ و 120 دوران دورة في الدقيقة. ثقافة فرعية وتوسيع كل يوم الرابع.
11. مواصلة توسيع حجم الثقافة لكثافة الخلايا المطلوبة للحصول على 10 قارورة في 1 × 10 ⁷ خلايا / قارورة لحفظ البرودة في النيتروجين السائل. تجميد الخلايا في وسائل الإعلام المصل خالية تحتوي على 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
    ملاحظة: مكيفة وسائل الإعلام التي تحتوي على الأجسام المضادة يمكن أن تحصد في كل ثقافة فرعية لتأكيد إنتاج البروتين أو استخدامها لتحسين الظروف تنقية. حصاد سائل الإعلام مكيفة والحفاظ على الخلايا لثقافة فرعية، الطرد المركزي الثقافة في300 x ج لمدة 5 دقائق ثم يصفى تعقيم طاف من خلال مرشح 0.22 ميكرون. يجوز إبقاء طاف تصفيتها عند 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع أو -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.

3. على نطاق واسع جسم إنتاج من دفعة اكتسى الثقافة

ملاحظة: يمكن اتباعها إنتاج الأجسام المضادة على من الخطوة 2.11 حيث يتم توسيع الخلايا الموجودة لكثافة الخلايا المطلوبة على أساس دفعة حجم ثقافة اكتسى أن يكون الإعداد. خلاف ذلك، والخلايا التي تم إذابة من الحفظ بالتبريد تبدأ في هذه المرحلة مرة واحدة موسعة لكثافة الخلية المناسبة والحجم. ويمكن استخدام المكملات ثقافة مختلفة لتحسين إنتاج الأضداد. استخدام تريبتون لزيادة يتجلى العائد الأجسام المضادة في هذا البروتوكول.

1. خلايا البذور في 2 × 10 ⁵ خلية / مل في وسائل الإعلام الحرة المصل 100 مل في اثنين من قوارير مخروطي (للمقارنة بين عائدات الضد من ثقافات الامم المتحدة وتستكمل وتستكمل المواد الغذائية). الثقافة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ و 120 دورة في الدقيقة.
2. بعد 24 ساعة، إضافة تريبتون إلى تركيز النهائي من 0.5٪ إلى ثقافة تستكمل المغذيات. تعادل حجم ثقافة تستكمل الامم المتحدة مع وسائل الإعلام خالية من المصل.
3. من يوم 8، نفذ عدد الخلايا من الثقافات يوميا باستخدام عدادة الكريات لمراقبة سلامة الخلية. حصاد supernatants الثقافة مرة واحدة بقاء الخلية أقل من 80٪.
   1. حصاد طاف بواسطة الطرد المركزي من الثقافات في 3000 x ج لمدة 15 دقيقة ثم يصفى تعقيم طاف (التي تحتوي على الأجسام المضادة) من خلال مرشح 0.22 ميكرون. تخزين supernatants في 4 درجات مئوية (قصيرة الأجل) أو تجميد في -20 درجة مئوية (على المدى الطويل).

4. الأجسام المضادة تنقية من الانجذاب اللوني باستخدام الآلي البروتين سريع اللوني السائل نظام (FPLC)

ملاحظة: عموما يمكن أن يطبق الإجراء التالي على أكثر الأنظمة الآلية. تنقية لا يمكن أن يؤديها في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية (إذا كان يتم الاحتفاظ نظام FPLC في غرفة باردة).سلسلة من الاختبارات الكشفية لا يمكن أن يؤديها لتحديد الظروف المثلى لتنقية بما في ذلك مصفوفة الأعمدة المناسبة، العازلة، شطف العازلة ودرجة الحموضة ملزمة لضمان استرداد الحد الأقصى من الأجسام المضادة تنقيته من وسائل الإعلام مكيفة (يرجى الرجوع إلى قسم النتائج). الظروف المثلى تعتمد على الأجسام المضادة أو البروتين يجري تنقيتها. أجريت التنقيات على نظام FPLC الآلي. أجريت التنقيات في درجة حرارة الغرفة باستخدام البروتين 5 مل عمود.

1. إعداد مخازن التالية باستخدام الماء عالى النقاء والتكيف مع درجة الحموضة أوصى ثم تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
   1. إعداد 1 لتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 (العازلة ملزمة) عن طريق خلط ما يلي: 0.14 M كلوريد الصوديوم، 0.0027 M بوكل، 0.01 م نا ₂ هبو ₄ و 0.001 M KH ₂ PO _4. ضبط درجة الحموضة إذا لزم الأمر قبل تصفية العازلة.
   2. إعداد 500 مل من 0.1 M الجلايسين حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 2.7 (شطف العازلة). ضبط درجة الحموضة قبل تصفية برتقاليإيه.
   3. تجهيز 50 مل من 1 M تريس درجة الحموضة (العازلة تحييد) 9.0.
2. ضمان كافة الاتصالات السلطة ونظام الاتصالات مع الكمبيوتر مصنوعة. وينبغي أن تكون أجهزة مرئية في برنامج وحدة "نظام التحكم". ومن المقرر ضمان خلية للأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر الطول الموجي. اختياري: معايرة درجة الحموضة متر وإذا كان متصلا واستخدامها.
3. تزج أنابيب مدخل من A، B ومضخة العينة في الماء عالى النقاء لغسل النظام. تطهير مضخات مع حقنة حالة وجود الهواء في الأنبوب أو اشتباه في الهواء في النظام. يغسل النظام مع المياه من خلال التشغيل اليدوي عن طريق وحدة تحكم النظام أو عبر طريقة تلقائية. نلاحظ أن ضغط، الموصلية، تتبع UV280 ودرجة الحموضة على ثبات وأن الحد الضغط عن العمود لا يتم تجاوز وفقا لمواصفات الشركة الصانعة.
   ملاحظة: شذوذ قد تشير إلى الهواء أو انسداد في النظام التي ينبغي معالجتها قبل المتابعة.
4. في وحدة تحكم النظام، بدء معدل التدفق في 1مل / دقيقة يدويا عن طريق مضخة وإما في الحمل (تجاوز عينة حلقة) أو حقن (خلال الحلقة العينة) موقف لبدء ربط العمود. أنابيب نظام قطع الاتصال عند مدخل موضع العمود وإزالة سدادة متصلا مدخل عمود.
   1. السماح لتدفق المياه من قطرة قطرة نظام الأنابيب على رأس العمود ثم إرفاق أنابيب نظام إلى العمود. وجود مدخل عمود ومدخل المناسب تفيض مع قطرات من الماء يضمن اتصال خالية من فقاعات الهواء.
5. إرفاق منفذ عمود في منفذ المصب والتحقق يتم تثبيتها بإحكام جميع التجهيزات. مع العمود تعلق الآن على النظام، لا تتجاوز حدود الحد الأقصى الضغط ومعدل التدفق على النحو المبين في مواصفات العمود.
6. غسل العمود مع 5 أحجام العمود (CV) من الماء. إذا لزم الأمر، ومواصلة غسل العمود حتى استقر UV280 البحث عن المفقودين.
7. تزج أنابيب مدخل من ألف في التجليد عازلة، B في شطف العازلة ومضخة العينة في المخزن ر ملزمس تتوازن النظام في مخازن الصحيحة. ملء أنابيب مدخل مع العازلة باستخدام PumpWash من التشغيل اليدوي.
8. في وحدة في "محرر أسلوب 'من البرنامج، استخدم معالج طريقة لإعداد وسيلة اللوني تقارب للعمود الذي يهدف إلى استخدامها.
   ملاحظة: الأنظمة الأوتوماتيكية لFPLC تأتي مع أساليب ما قبل مليئة الإعدادات الموصى بها (أي معدل التدفق والحد من الضغط) وتشغيل الخطوات بناء على عمود (الصانع، مصفوفة وحجم) التي اختيرت لتنقية.
   1. اتبع الخطوات التالية لتشغيل البروتين واللوني تقارب:
      1. تتوازن النظام مع 5 السيرة الذاتية العازلة ملزمة وجمع flowthrough في حاوية النفايات.
      2. عينة الحمل على العمود (حجم ليتم تحميلها يتم تحديد يدويا في طريقة) وجمع flowthrough في وعاء منفصل.
      3. يغسل النظام مع 5 السيرة الذاتية العازلة ملزمة وجمع flowthrough في وعاء منفصل.
      4. العمود أزل مع isocrat 5 السيرة الذاتيةجيم تجزئة باستخدام شطف العازلة وجمع عينة الأجسام المضادة النقاء كما الكسور جامع الكسر.
      5. تتوازن النظام مع 5 السيرة الذاتية العازلة ملزمة وجمع flowthrough في حاوية النفايات.
9. مرة واحدة كانت طريقة الإعداد، تحديد حجم وسائل الإعلام مكيفة ليتم تطبيقها على العمود وحفظ الأسلوب.
   ملاحظة: يجب أن يكون حجم المحدد في طريقة 5-10 مل أقل من الحجم الفعلي لتجنب إدخال الهواء أثناء تشغيل العينة. وحدة التخزين المحددة المستخدمة في هذا البروتوكول هو 90-120 مل.
10. غمر أنابيب ضخ العينة في الإناء الذي يحتوي على وسائل الإعلام مكيفة.
11. تحضير وعاء منفصل لجمع flowthrough عينة عن طريق الأنابيب منفذ محدد.
    ملاحظة: من المهم لجمع flowthrough في حالة حدوث خطأ أثناء التشغيل أو قدرة ربط العمود تجاوز تتطلب flowthrough إلى إعادة تطبيق إلى العمود أو ص تنقيةepeated.
12. إعداد أنابيب جمع في جامع الكسر. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة تحييد لكل 1 مل حجم الكسر. سيقوم النظام FPLC أزل تلقائيا الكسور في أنابيب جمع.
13. في وحدة 'مكافحة النظام' من البرنامج، افتح طريقة ليتم تشغيلها.
    ملاحظة: يتم بدء تشغيل الأسلوب في سلسلة من الصفحات التي تشمل فحص متغيرات طريقة، والإعداد جامع جزء وتحديد اسم الملف نتيجة وموقع التخزين.
14. انقر فوق ابدأ لبدء التشغيل. ويمكن رصد التشغيل في وحدة 'مكافحة النظام'.
15. عند الانتهاء من تشغيل تنقية، والتحقق من اللوني مما أسفر عن وحدة 'تقييم' في برنامج النظام.
16. الجمع بين جميع الكسور التي تحتوي على البروتين في أنبوب، وتبادل عازلة منفصل والتركيز في برنامج تلفزيوني باستخدام جهاز الطرد المركزي فلتر مع 30 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع. تنفيذ الخطوات الطرد المركزي وفقا لالصانعتعليمات.
17. قياس تركيز الأجسام المضادة باستخدام فحص الحمض bicinchoninic (BCA) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
18. إذا المدى تنقية آخر هو أن يقوم رئيس وأنابيب ضخ العينة في المخزن ملزمة وكرر الخطوات 4،9-4،14.
19. عند الانتهاء من يدير تنقية، تزج أنابيب مدخل من A، B ومضخة العينة في الماء عالى النقاء ويغسل نظام والعمود كما يؤديها في الخطوة 3.
20. غمر ألف وباء وعينة مضخة الأنابيب في 20٪ من الإيثانول وتكرار إجراء غسيل للتخزين للنظام والعمود.
21. فصل عمود من منفذ المصب واستبدال العمود سدادة، ثم قطع عمود في مدخل واستبدال سدادة، إعادة أنابيب إلى النظام. تخزين العمود في 4 درجات مئوية.

النتائج

وأكد إنتاج مستقر من تراستوزوماب التي كتبها transfected خلايا كلوة-293 باستخدام التداخل طبقة الحيوي (BLI) على النحو المبين في الشكل 1. تم إنشاء منحنى قياسي مفتش عن طريق قياس معدل ملزم بين مستوى الأجسام المضادة مفتش والبروتين وجهاز الاستشعار البيولوج...

Discussion

تفاصيل هذا البروتوكول ترنسفكأيشن والتعبير مستقر وتنقية الأجسام المضادة العلاجية في كلوة-293 الخلايا. التعبير مستقر للجينات الجسم المضاد هو الخطوة الأولى في توليد خط الخلية المنتجة للأجسام المضادة لتطوير وتصنيع الأجسام المضادة العلاجية. في حين الصيني الهامستر المبي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pFUSE vector series	InvivoGen	N/A	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series	ACYTE Biotech Pty Ltd.		Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector	N/A	N/A	Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series	Lonza		Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	Addgene	61883	Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar	Jomar Life Research	fas-hg-s	Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB	Jomar Life Research	fas-hg-l	Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin.
Glycerol, BioXtra, ≥99%	Sigma-Aldrich	G6279	Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	Astral Scientific	G221020	Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells	Life Technologies	R790-07	HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium	Life Technologies	12338-018	Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188	Sigma-Aldrich	K4894	Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
DMEM, high glucose	Life Technologies	11995-065
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum	Life Technologies	10082-147
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000	Polysciences, Inc.	23966	Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use.
OptiPro SFM	Life Technologies	12309-050	Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution	Jomar Life Research	ant-hg-1
Dimethylsulphoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	AJA2225
Tryptone (casein peptone)	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml	Astral Scientific	09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column	Sigma-Aldrich	GE17-0403-01
AKTApurifier 100	GE Healthcare	28406266	Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl	Sigma-Aldrich	G2879
Citric Acid, monohydrate	Astral Scientific	BIOC2123
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate	Astral Scientific	BIOCB0035
1 M Tris-HCl solution pH 9.0	Astral Scientific	BIOSD8146
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)	Merck Millipore	UFC803008/UFC903008	Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
BLItz System	fortéBIO	45-5000	Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors	fortéBIO	18-5010
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution	Astral Scientific	786-502
Ammonium Persulfate (APS)	Astral Scientific	AM0486
TEMED	Astral Scientific	AM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250	Astral Scientific	786-498
Precision Plus Dual-Color Protein Standard	Bio-Rad	1610374