实验室规模的生产和治疗性抗体的纯化

摘要

这个协议描述在哺乳动物表达系统中生产的治疗性抗体的。所描述的方法包括制备载体DNA，稳定转染和人胚肾293细胞系的无血清适应的，设置大规模培养和纯化使用亲和层析组成。

摘要

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

引言

治疗性抗体的成功将继续推动大量投资进入的抗体开发为下一代疗法的浪潮开始。抗体市场预期由抗体片段^1，抗体-药物偶联物^2，双特异性抗体³和工程化抗体具有有利性质⁴重塑。另一类获得医药感兴趣的是生物仿制药。生物仿制药抗体是"高度相似"复制这种已经获得监管部门的批准治疗性抗体产品。拟议的生物仿制药必须是就其结构，功能，动物毒性，临床安全性和有效性，人体药代动力学（PK），药效学（PD）和免疫原性^5,6鼻祖抗体相媲美。

批准ř生物仿制药的抗体的茨一直缓慢由于在产品的最终质量的严格限制。确切的制造过程，如通过对最终的处理步骤的特定细胞系和培养条件可以保持专有的。更重要的是，抗体的制造固有涉及程度可变性的可加至生产高度类似产品的挑战。全面理化和生物物理表征和比较是相当困难的，但许多研究表明生物仿制药的抗体的特性出现在文献^7，8，9。

产生治疗性抗体便从哺乳动物宿主细胞用携带的基因的各抗体的载体的转染。载体设计，细胞系和培养条件是建立前的关键考虑因素PRESSION系统。

抗体的DNA序列可以从药物银行（www.drugbank.ca），IMGT（www.igmt.org）或研究的出版物，包括专利中采购。例如，曲妥单抗的序列，可通过药物银行（DB编号:DB00072）。可变区的氨基酸序列可经历基因设计和优化用于合成在所需宿主物种。它是没有修饰的氨基酸序列制成的生物仿制药抗体重要。一旦合成，抗体基因可亚克隆到所选择的合适的载体。

人IgG抗体由两条相同的重链和两个相同的轻链组成。两条链的紧密调节表达是用于在哺乳动物细胞¹⁰的异源抗体蛋白的最佳生产的关键。帧内以及链间二硫键必须形成和一些翻译后修饰的需要成为在蛋白质的生物合成过程中troduced。许多载体是已专为表达抗体基因（参考材料表）可用。这些特定抗体 - 载体通常表示为重链和轻链，以便仅在每个链的可变区所需要克隆的恒定区。

有两个独立的构建体（共转染）细胞的转染是用于输送重和轻链编码基因的最常见的方法。也就是说，每个基因通过其自身的启动子被组装的内质网前驱动和转录为单独的抗体链。另一方面，多顺反子载体具有掺入内部核糖体进入位点（IRES）元件，使多个基因作为与由mRNA ¹¹的内部区域允许翻译单一的mRNA转录物的表达。在这种情况下，重链和轻链编码基因被连接在一个arrangEMENT同时实现抗体链^10,12的共表达。

而瞬时转染细胞产生足够的蛋白来执行的实验的数量有限，已经经过选择基因组整合稳定转染的细胞系可以提供更高的产量。较高的蛋白质的量允许为涉及体外表征检测开发，并能提供在考虑抗体质量为下游应用的指示，如克隆细胞系和铅候选选择。

本文的目的是描述在哺乳动物表达系统中产生的治疗性抗体的稳定表达和纯化。事实上，这种方法可以适用于一生物仿制药抗体的表达。该方法可用于抗体的初始特性继续到关键的，尽管是费时STE之前确定一个理想的克隆用于大规模生产的PS。此外，这种方法可用于表达其它蛋白质，而不只是抗体。

下面的详细方案描述的治疗性抗体曲妥单抗的表达。这包括制备载体DNA随后在HEK-293细胞系和抗体蛋白质的纯化稳定转染通过自动化色谱法的。

研究方案

注:合适的哺乳动物表达载体，必须使用该协议。这里，使用含有两个表达盒的单个构建体（ 即重链和轻链表达由单独的启动子驱动）。曲妥单抗重和轻链先前克隆到载体中。这个载体是从安德鲁Beavil的礼物，通过一个不以营利为目的质粒库¹³获得。

1.恢复和载体DNA的规模化发展

注:载体DNA收到大肠杆菌 XL-1蓝色株软琼脂穿刺培养;载体携带潮霉素抗性。

1. 将无菌接种刺伤或循环进入穿刺培养，然后连胜75微克准备了卢里亚BERTANI（LB）琼脂平板上的软琼脂/ ml潮霉素的单菌落。孵育在37℃的板18-24小时。
2. 接种单个菌落到5ml了不起肉汤（TB）的含有75微克/毫升潮霉素。 INCU大怒的文化，在37℃，18〜24小时，225转摇晃。
3. 使用过夜培养轻轻用200μl80％甘油混和并冷冻在-80℃下混合800微升培养以制备载体DNA的甘油。
   1. 将100μl过夜培养物加至100毫升结核病含75微克/一个挡板摇瓶中（ 即 1/1000稀释）ml潮霉素。孵育在37℃下培养18至24小时，以225 rpm振摇。
4. 过夜培养后，提取和纯化根据与以下异常的midi / MAXI制备试剂盒的制造商的说明将DNA;期间与水（pH 7.0-8.5）中的最后一步，洗脱或重悬的DNA。
5. 检查浓度与由吸光度读数的DNA纯度在260和280nm，然后储存的DNA在-20℃。
   注:可选的（强烈推荐）:DNA序列使用载体特异性引物，以确认身份。

2。 HEK-293细胞的稳定转染

1. 生长并保持根据在补充有在锥形瓶中的0.1％的非离子表面活性剂的无血清培养基的标准协议HEK-293细胞（悬浮细胞）。保持在2×10 ^5个细胞/ ml传代培养每第四天。培养细胞在37℃，5％的CO ₂和120rpm的旋转。
   注:细胞应已在培养不少于4天，不超过4周前，转染。生长在含有血清的培养基单层的HEK-293细胞也可以用于此过程。
2. 在转染前一天，种子的HEK-293细胞以3×10 ^5个细胞/在12孔平板的孔中毫升2-毫升Dulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM）中的补充有10％热灭活的胎牛血清（ FBS）。在转染日，检查细胞达到80-90％汇合
3. 稀释转染媒体DNA和聚乙烯亚胺（PEI）分别然后混合在一起。
   1. 稀释300微升转染媒体每孔1.25微克载体DNA（15微克的12口井）。在室温下孵育5分钟。
   2. 稀释的1mg / ml的PEI溶液2.5微升（30μl的12口井， 即 1:PEI的2比的DNA）在300微升转染培养基。在室温下孵育5分钟。
   3. 稀释的DNA添加至稀释的PEI，轻轻混合并在室温下孵育15分钟。
4. 加入50μl的DNA / PEI混合物滴加至板的各孔中。轻轻摇动平板分发然后转染混合物放置板在37℃，5％CO ₂的24小时。
5. 加50微克/ ml潮霉素，每孔B和返回板37℃，5％CO ₂的10天。
   注意:通过第10天，未转染的细胞将死亡和拆卸从板的表面上，而稳定地转染的细胞将是可行的，并附着到板上。
6. 在水井更换介质1/4体积的无血清培养基和3/4体积的DMEM补充有10％FBS（ 注:0.5 ml无血清培养基+ 1.5的10ml DMEM = 7.5％的最终血清浓度），并孵育4天。
7. 用补充有10％FBS（ 即 1毫升无血清培养基+ 1的10ml DMEM = 5％的最终血清浓度）1/2体积的无血清培养基和1/2体积的DMEM替换在孔中的媒体并孵育4天。
8. 用补充有10％FBS（ 即 1.5毫升无血清培养基+ 0.5的10ml DMEM = 2.5％的最终血清浓度）3/4体积的无血清培养基和1/4体积的DMEM替换在孔中的媒体并孵育4天。
9. 用2ml补充有0.1％的非离子表面活性剂（即0％的最终血清浓度）的无血清培养基的更换在孔中的媒体并孵育4天。
   注:保持无血清适应过程中50μg/ ml的潮霉素B的选择性细胞上的压力。适应于无血清培养基的细胞从孔表面分离，并且可以第一组ñ停牌。参见步骤2.1培养条件与50微克的额外补充/ ml潮霉素B.
10. 使用移液管，轻轻在12孔板和池细胞悬浮培养物混合到一个单独的管中。
    1. 使用血细胞计数器，枚举汇集细胞和种子在30毫升无血清培养基中一个锥形烧瓶中，在2×10 ^5个细胞/ ml。培养细胞在37℃，5％的CO ₂和120rpm的旋转。亚文化，每第四天扩大。
11. 继续扩大培养规模到所需细胞密度为1×10 ⁷个细胞，以获得10小瓶/小瓶在液氮冷冻保存。冻结细胞在含有10％二甲基亚砜（DMSO）的无血清培养基。
    注:空调含有抗体媒体可以在每个传代培养收获确认蛋白质生产或用于优化纯化条件。收获条件培养基和维护传代细胞，离心在文化300 XG 5分钟，然后用0.22微米的过滤器过滤消毒上清液。过滤的上清液可保持在4℃下1-2周或-20℃下长期储存。

3.大规模抗体生产批量从长满文化

注:抗体的生产可以从步骤2.11，其中现有的单元格扩展到基于批处理长满培养体积上所需的细胞密度是设置应遵循的。否则，已经从冷冻解冻细胞开始在该阶段，一旦扩大到合适的细胞密度和体积。各种培养补充剂可用于优化抗体生产;利用蛋白胨，增加抗体产量是表现在这个协议。

1. 种子细胞在两个Erlenmeyer烧瓶的100ml无血清培养基2×10 ^5个细胞/ ml（以比较从非补充和营养补充培养抗体的产量）。文化在37 ℃，5％CO ₂的和120转。
2. 24小时后，加入胰蛋白胨为0.5％的终浓度向营养补充培养。均衡与无血清培养基未补充的文化音量。
3. 从第8天，进行使用血球监测细胞生存力每日培养物的细胞计数。收获培养上清一次细胞存活率小于80％。
   1. 收获上清液通过培养物离心以3000 xg离心15分钟，然后通过0.22微米的过滤器过滤，消毒上清液（含有抗体）。存储上清在4℃（短期），或在-20°C（长期）冻结。

4.抗体纯化通过亲和层析法使用自动化快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统

注:以下步骤一般可以适用于大多数的自动化系统。纯化可在室温下或在4℃下（如果FPLC系统被保持在阴凉室）中进行。可以进行一系列的侦察测试，以找出最佳纯化条件包括适当的列矩阵，结合缓冲液，洗脱缓冲液和pH值，以确保从条件培养基纯化的抗体的最大恢复（参见结果部分）。最优条件取决于被纯化的抗体或蛋白质。纯化了一个自动化FPLC系统上进行。纯化用5ml的蛋白A柱在室温下进行。

1. 使用超纯水制备下列缓冲液和调整到推荐pH值，然后通过0.22微米的过滤器进行过滤。
   1. 0.14 M氯化钠，0.0027米氯化钾，0.01M _的 Na ₂ HPO ₄和0.001摩尔KH ₂ PO _4:通过混合下列制备1升磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4的（结合缓冲液）的。过滤缓冲区之前必要时进行调整pH值。
   2. 制成500毫升之0.1M甘氨酸 - 盐酸pH值2.7（洗脱缓冲液）的。过滤的buff前调节pH值呃。
   3. 准备50ml的摩尔Tris pH值9.0（和缓冲液）的。
2. 确保计算机是由系统电源和通讯连接。设备应在软件"系统控制"模块可见。确保UV单元被设定在280nm波长。可选的:如果连接，也可以使用校准pH计。
3. 沉浸A，B和采样泵的入口管超纯水冲洗系统。清除泵用注射器是否有空气管道或空气的系统中的一个怀疑。通过系统控制器或经由自动化的方法，通过手工操作用水冲洗该系统。观察到压力，导电性，UV280跟踪和pH保持一致，并且该列中的压力限制不超过根据制造商的规范。
   注:异常可能表明空气或堵塞应该在继续之前加以解决系统。
4. 在系统控制器模块，从1开始的流速毫升/分钟通过手动在任何负载泵A（绕过样品环）或注射（通过样品环）的位置，开始连接列。在列位置入口断开系统管道和删除连接到柱入口塞子。
   1. 允许水从系统管滴流在塔的顶部则系统管道连接到柱上。具有柱的入口和与水滴入口配件溢流确保无气泡的连接。
5. 连接柱子出口的下游出口，并确认所有的配件都紧紧系住。与列现在连接至系统，如在列规范概述不超过最大压力极限和流量限制。
6. 用的水5倍柱体积（CV）的洗涤塔。如果有必要，继续洗柱，直到UV280跟踪已趋于稳定。
7. 沉浸A的入口管结合缓冲液，B在洗脱缓冲液和结合缓冲器T采样泵Ø平衡系统在正确的缓冲区。使用PumpWash通过手动操作缓冲填充进气管。
8. 在软件的"方法编辑器"模块中，使用该方法的向导设置为，目的是要使用的柱的亲和色谱法。
   注:自动化系统FPLC配方法预先填充推荐的设置（ 即流量和压力限制），并运行基于选定净化柱（制造商，矩阵和大小）的步骤。
   1. 使用蛋白质A亲和层析以下运行步骤:
      1. 平衡系统用5CV结合缓冲液，并收集到流出液废物容器。
      2. 负载样品上柱（体积要加载手动指定的方法），并收集流过到一个单独的容器中。
      3. 洗系统用5CV的结合缓冲液，并收集流过到一个单独的容器中。
      4. 用5CV isocrat柱洗脱IC分离使用洗脱缓冲液，并收集纯化抗体样品由馏分收集器部分。
      5. 平衡系统用5CV结合缓冲液，并收集到流出液废物容器。
9. 一旦该方法已经设置，指定的条件培养基的体积要施加到列和保存方法。
   注:在该方法中指定的体积应比实际体积，以避免样品运行期间引入空气少5-10毫升。在这个协议中指定的卷是90-120毫升。
10. 浸没样品泵管到含有经调节的培养基的容器中。
11. 准备一个单独的容器通过指定的出口管收集样品流出液。
    注:收集在运行或柱的结合能力过程中发生错误的情况下的流过液是很重要的超过需要的流过液被重新应用到列或外净化epeated。
12. 在馏分收集器准备收集管。加入100微升每毫升体积分数和缓冲的。在FPLC系统将自动洗脱馏分进入收集管中。
13. 在软件的"系统控制"模块，打开方法来运行。
    注:该方法运行在一系列的包括检查的方法中，馏分收集器安装程序的变量和定义的结果的文件名和存储位置的页面启动。
14. 点击START开始运行。运行可以在"系统控制"模块中进行监控。
15. 在净化运行完成后，检查所生成的色谱系统软件的"评估"模块中。
16. 将所有含蛋白质的分数到一个单独的管，缓冲交换和使用离心过滤装置与切断30 kDa的分子量在PBS集中。根据制造商的执行离心步骤说明。
17. 使用根据制造商的说明双金鸡宁酸测定法（BCA）测定抗体浓度。
18. 如果另一个净化运行是要执行，主要在结合缓冲液，并重复采样泵管步骤4.9-4.14。
19. 在纯化轮次的完成，沉浸A，B和样品泵的入口管在超纯水中，并如在步骤3中进行清洗系统和柱。
20. 淹没A，B和泵管在20％乙醇，重复洗涤程序对系统和列存储。
21. 断开从下游出口列和替换柱塞，然后在入口断开柱和更换塞子，重新连接管连接到该系统。储存在4℃下的列。

结果

使用生物层干涉（BLI）转染HEK-293细胞的稳定生产单抗的结果确认， 如图1中。通过测量IgG抗体标准和蛋白质的生物传感器（ 图1A）之间的结合率产生的IgG的标准曲线。粗制上清液样品类似地测量，那么其浓度从标准曲线（ 图1B）内插。上清液的浓度测得为大约25微克/毫升双周（从传代培养收集50毫升取样）的无血清适应之后和之前为?...

讨论

该协议细节的转染，稳定表达和治疗性抗体的纯化在HEK-293细胞。抗体基因的稳定表达是在产生用于治疗性抗体的开发和制造的抗体产生细胞系的第一步。而中国仓鼠卵巢（CHO）细胞仍然是治疗性蛋白质的选择的表达平台，HEK-293细胞系获得突出的实现，在这些细胞中产生的蛋白质是天然存在的人类蛋白质更匹配，在后方面-translational修改和功能^14,15。

...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
pFUSE vector series	InvivoGen	N/A	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series	ACYTE Biotech Pty Ltd.		Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector	N/A	N/A	Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series	Lonza		Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	Addgene	61883	Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar	Jomar Life Research	fas-hg-s	Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB	Jomar Life Research	fas-hg-l	Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin.
Glycerol, BioXtra, ≥99%	Sigma-Aldrich	G6279	Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	Astral Scientific	G221020	Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells	Life Technologies	R790-07	HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium	Life Technologies	12338-018	Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188	Sigma-Aldrich	K4894	Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
DMEM, high glucose	Life Technologies	11995-065
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum	Life Technologies	10082-147
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000	Polysciences, Inc.	23966	Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use.
OptiPro SFM	Life Technologies	12309-050	Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution	Jomar Life Research	ant-hg-1
Dimethylsulphoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	AJA2225
Tryptone (casein peptone)	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml	Astral Scientific	09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column	Sigma-Aldrich	GE17-0403-01
AKTApurifier 100	GE Healthcare	28406266	Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl	Sigma-Aldrich	G2879
Citric Acid, monohydrate	Astral Scientific	BIOC2123
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate	Astral Scientific	BIOCB0035
1 M Tris-HCl solution pH 9.0	Astral Scientific	BIOSD8146
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)	Merck Millipore	UFC803008/UFC903008	Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
BLItz System	fortéBIO	45-5000	Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors	fortéBIO	18-5010
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution	Astral Scientific	786-502
Ammonium Persulfate (APS)	Astral Scientific	AM0486
TEMED	Astral Scientific	AM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250	Astral Scientific	786-498
Precision Plus Dual-Color Protein Standard	Bio-Rad	1610374