Laboratorio de producción a gran escala y purificación de un anticuerpo terapéutico

Resumen

Este protocolo describe la producción de un anticuerpo terapéutico en un sistema de expresión de mamífero. Los métodos descritos incluyen la preparación del ADN del vector, transfección estable y la adaptación libre de suero de una línea celular de riñón embrionario humano 293, puesta en marcha de cultivos a gran escala y la purificación mediante cromatografía de afinidad.

Resumen

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Introducción

El éxito de anticuerpos terapéuticos continúa impulsando la inversión sustancial en el desarrollo de anticuerpos como comienza una ola de terapias de próxima generación. Se espera que el mercado de anticuerpo que se ha reformado por fragmentos de anticuerpos ^1, conjugados de anticuerpo-fármaco ^2, anticuerpos biespecíficos ³ y anticuerpos diseñados con propiedades favorables ^4. Otra clase ganando interés farmacéutico son bioequivalentes. anticuerpos biosimilares son "muy similares" replicar productos de un anticuerpo terapéutico que ya ha recibido la aprobación regulatoria. A biosimilar propuesto debe ser comparable con el anticuerpo iniciador con respecto a su estructura, la función, la toxicidad animal, la seguridad clínica y eficacia, farmacocinética (PK) humanos, la farmacodinámica (PD) y la inmunogenicidad ^{5, 6.}

La aprobación rAtes de anticuerpos biosimilares han sido lentos debido a las limitaciones estrictas sobre la calidad final del producto. Los procesos de fabricación exactas tales como líneas celulares y condiciones de cultivo específico a través de las etapas de procesamiento finales pueden permanecer propietario. Lo que es más, la fabricación de anticuerpos implica inherentemente un grado de variabilidad que se puede agregar al desafío de producir un producto muy similar. Una caracterización fisicoquímica y biofísica exhaustiva y la comparación es bastante difícil, sin embargo, una serie de estudios que demuestran las características de los anticuerpos biosimilares están surgiendo en la literatura ^{7, 8, 9.}

Generación de un anticuerpo terapéutico comienza con la transfección de células huésped de mamífero con un vector que lleva los genes para el anticuerpo respectivo. diseño del vector, de línea y de cultivo celular condiciones son consideraciones clave para la creación de la exsistema de compresión.

Las secuencias de ADN de anticuerpos pueden ser obtenidos de Banco de Drogas (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) o publicaciones de investigación, incluidas las patentes. Por ejemplo, la secuencia de trastuzumab está disponible a través del Banco de Drogas (DB ID: DB00072). La secuencia de aminoácidos de las regiones variables puede someterse a diseño y optimización de genes para la síntesis en las especies huésped deseadas. Es importante para un anticuerpo biosimilar que ninguna modificación se hace a la secuencia de aminoácidos. Una vez sintetizados, los genes de anticuerpos se pueden subclonar en el vector apropiado de elección.

anticuerpos IgG humanos consisten en dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Expresión estrictamente regulados de ambas cadenas es esencial para la producción óptima de la proteína heteróloga IgG en células de mamíferos ^10. Intra, así como enlaces disulfuro entre cadenas tienen que ser formado y una serie de modificaciones posteriores a la traducción tiene que estar enintrodujo durante la biosíntesis de proteínas. Una serie de vectores están disponibles que se han diseñado específicamente para expresar genes de anticuerpos (consulte la Tabla de Materiales). Estos vectores en anticuerpos específicos por lo general expresan las regiones constantes de las cadenas tanto pesada y ligera de modo que sólo las regiones variables de cada cadena requieren clonación.

La transfección de células con dos constructos independientes (co-transfección) es el método más común para la entrega de genes pesados ​​y ligeros de la cadena que codifica. Es decir, cada gen es conducido por su propio promotor y transcribe como cadenas de anticuerpo separados antes de ser montado en el retículo endoplásmico. Por otra parte, los vectores de multi-cistrónicos tienen elementos internos sitio de entrada al ribosoma (IRES) incorporados que permiten la expresión de múltiples genes como un único transcrito de ARNm con la traducción permitida de las regiones internas del mRNA ^11. En este caso, los genes de cadena pesada y ligera que codifica se acoplan en un arrangement para lograr la co-expresión de ambas cadenas de anticuerpo ^{10, 12.}

Mientras que las células transfectadas transitoriamente rendimiento de proteína suficiente para realizar un número limitado de experimentos, las líneas celulares transfectadas de manera estable que han sido sometidos a selección para la integración del genoma pueden ofrecer rendimientos más altos. Las cantidades de proteína más altos permiten para el desarrollo del ensayo relativo a la caracterización in vitro y pueden proporcionar una indicación de la calidad del anticuerpo en consideración para aplicaciones posteriores tales como la línea celular clonal y la selección de candidatos de plomo.

El objetivo de este artículo es describir la expresión estable y purificación de un anticuerpo terapéutico producido en un sistema de expresión de mamífero. De hecho, este método se puede aplicar a la expresión de un anticuerpo biosimilar. El método puede ser utilizado para la caracterización inicial de los anticuerpos antes de proceder a la crítica, aunque ste tiempops de identificar un clon deseable para la fabricación a mayor escala. Por otra parte, este método se puede utilizar para expresar otras proteínas y no sólo los anticuerpos.

El siguiente protocolo describe la expresión detallada de trastuzumab anticuerpo terapéutico. Esta consiste en la preparación de ADN del vector seguido de transfección estable en la línea celular HEK-293 y la purificación de la proteína de anticuerpo por un método de cromatografía automatizado.

Protocolo

NOTA: Un vector de expresión de mamífero adecuada debe ser utilizado para este protocolo. Aquí, se utiliza una única construcción que contiene dos casetes de expresión (es decir, expresión de la cadena pesada y ligera es impulsado por promotores separados). cadenas pesada y ligera se clonaron Trastuzumab previamente en el vector. Este vector fue un regalo de Andrew Beavil, obtenida a través de una organización sin fines de lucro plásmido repositorio ^13.

1. La recuperación y ampliación del ADN del vector

NOTA: El ADN del vector fue recibido como un cultivo de agar blando de arma blanca en la cepa de Escherichia coli XL-1 Blue; vector lleva resistencia a la higromicina.

1. Inserte una puñalada inoculación estéril o bucle en el agar suave de la cultura puñalada entonces consecutivas una placa de agar Luria Bertani (LB) preparado con 75 mg / ml de higromicina para colonias aisladas. Incubar la placa a 37 ° C durante 18-24 horas.
2. Se inocula una sola colonia en 5 ml de caldo Terrific (TB) que contiene 75 mg / ml de higromicina. Incubate el cultivo a 37 ° C durante 18-24 horas con agitación 225 rpm.
3. Utilice el cultivo de una noche para preparar un stock de glicerol de DNA vector mediante la mezcla suavemente a 800 l de cultivo con 200 l 80% de glicerol en un criovial y se congelan a -80 ° C.
   1. Añadir 100 ml de cultivo de una noche a 100 ml de TB que contenía 75 mg / ml de higromicina en un matraz agitador desconcertado (dilución es decir, 1 / 1.000). Incubar el cultivo a 37 ° C durante 18-24 horas con agitación 225 rpm.
4. Después de cultivo durante la noche, extraer y purificar el ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante de kit de preparación de midi / maxi con la siguiente excepción; durante la última etapa del ADN, o volver a suspender eluyen con agua (pH 7,0-8,5).
5. Compruebe concentración y pureza del ADN por lecturas de absorbancia a 260 y 280 nm entonces almacenar ADN a -20 ° C.
   NOTA: Opcional (muy recomendable): Secuencia de ADN utilizando cebadores específicos del vector para confirmar la identidad.

2. Transfección estable de células HEK-293

1. Crecer y mantener las células HEK-293 (células en suspensión) de acuerdo con protocolos estándar en medio libre de suero suplementado con agente tensioactivo no iónico 0,1% en matraces Erlenmeyer. Mantener a 2 x 10 ⁵ células / ml y subcultivo cada cuatro días. Células de cultivo a 37 ° C con 5% de _CO2 y 120 rpm de rotación.
   Nota: Las celdas deberían haber estado en cultivo durante no menos de 4 días y no más de 4 semanas antes de la transfección. células HEK-293 que crecen como monocapas en medios que contienen suero también se pueden utilizar para este procedimiento.
2. En el día antes de la transfección, las células de semillas HEK-293 a 3 x 10 ⁵ células / ml en pocillos de una placa de 12 pocillos en 2 ml de Dulbecco modificado de Eagle Media (DMEM) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% ( FBS). En el día de la transfección, comprobar que las células han alcanzado el 80-90% de confluencia
3. Diluir el ADN y polietilenimina (PEI) por separado en el medio de transfección a continuación, mezclar juntos.
   1. Diluir 1,25 g vector de ADN por pocillo (15 g de 12 pocillos) en 300 l medio de transfección. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
   2. Diluir 2,5 l de 1 mg / ml solución PEI (30 l para 12 pocillos, es decir, proporción de 1: 2 de ADN para PEI) en 300 l medio de transfección. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
   3. Añadir DNA diluido para diluida PEI, mezclar suavemente y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min.
4. Añadir 50 l de ADN / PEI mezcla gota a gota a cada pocillo de la placa. Oscilar suavemente la placa para distribuir la mezcla de transfección y posicionar la placa a 37 ° C, 5% de _CO2 durante 24 horas.
5. Añadir 50 g / ml de higromicina B por pocillo y la placa de volver a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 10 días.
   NOTA: Para el día 10, las células transfectadas-un habrán muerto y separado de la superficie de la placa, mientras que las células transfectadas establemente serán viables y unida a la placa.
6. Vuelva a colocar los medios de comunicación en los pozos con1/4 medio libre de suero de volumen y 3/4 volumen de DMEM suplementado con FBS al 10% (es decir, 0,5 ml de medio libre de suero + 1,5 ml de DMEM = 7,5% de concentración final de suero) y se incuba durante 4 días.
7. Reemplazar los medios de comunicación en los pozos con 1/2 medio libre de suero y de volumen medio DMEM volumen suplementado con 10% FBS (medio libre de suero es decir, 1 ml + 1 ml de DMEM = 5% de concentración final de suero) y se incuba durante 4 días.
8. Reemplazar los medios de comunicación en los pozos con 3/4 medio libre de suero de volumen y 1/4 volumen de DMEM suplementado con FBS (+ 0,5 ml de DMEM = concentración sérica es decir, 1,5 ml de medio libre de suero 2,5% final) 10% e incubar durante 4 días.
9. Reemplazar los medios de comunicación en los pocillos con 2 ml de medio libre de suero suplementado con 0,1% de tensioactivo no iónico (concentración final de suero es decir, 0%) y se incuba durante 4 días.
   NOTA: Mantener 50 mg / presión selectiva ml higromicina B en las células durante la adaptación libre de suero. Las células adaptadas a medios libres de suero se desprenden de la superficie de los pozos y pueden agruparse in suspensión. Consulte el paso 2.1 para las condiciones de cultivo con el suplemento adicional de 50 mg / ml de higromicina B.
10. Con una pipeta, mezclar suavemente los cultivos en suspensión en las células de la placa y la piscina de 12 pocillos en un tubo separado.
    1. El uso de un hemocitómetro, enumerar células agrupadas y semilla en 30 ml de medio libre de suero en un matraz Erlenmeyer a 2 x 10 ⁵ células / ml. Células de cultivo a 37 ° C con 5% de _CO2 y 120 rpm de rotación. Subcultura y ampliar cada cuatro días.
11. Continuar ampliando el tamaño de la cultura a la densidad celular requerida para obtener 10 viales a las células 1 x 10 ⁷ / vial de crioconservación en nitrógeno líquido. Congelar las células en medio libre de suero que contiene 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
    NOTA: acondicionado medios que contienen anticuerpos pueden ser cosechadas en cada subcultivo para confirmar la producción de proteínas o se utilizan para optimizar las condiciones de purificación. Para cosechar los medios condicionados y mantener las células de la subcultura, centrifugar el cultivo a300 xg durante 5 min luego filtrar-esterilizar sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micras. sobrenadante filtrado puede mantenerse a 4 ° C durante 1-2 semanas o -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo.

3. Gran Escala Producción de anticuerpos a partir de lotes overgrow Cultura

NOTA: La producción de anticuerpos se puede seguir en el paso de 2.11 donde las células existentes se expanden a la densidad celular requerida sobre la base del volumen de cultivo por lotes overgrow ser de configuración. De lo contrario, las células que han sido descongelados de criopreservación comienzan en esta etapa una vez expandido a una densidad celular apropiada y volumen. Varios suplementos de cultivo se pueden usar para optimizar la producción de anticuerpos; el uso de triptona para aumentar el rendimiento del anticuerpo se demuestra en este protocolo.

1. Se siembran las células a 2 x 10 ⁵ células / ml en medio libre de suero de 100 ml en dos matraces Erlenmeyer (para comparar los rendimientos de anticuerpos a partir de cultivos de la ONU-complementado y completado en nutrientes). Cultivo a 37 ° C, 5% de CO ₂ y 120 rpm.
2. Después de 24 h, añadir triptona a una concentración final de 0,5% a cultivo nutriente suplementado. Igualar el volumen de la cultura no-suplementado con medio libre de suero.
3. De día 8, lleve a cabo los recuentos de células de los cultivos diariamente usando un hemocitómetro para monitorizar la viabilidad celular. Recoger los sobrenadantes de cultivo una vez que la viabilidad celular es menor que 80%.
   1. Cosecha sobrenadante por centrifugación de los cultivos a 3.000 xg durante 15 min a continuación, filtrar-esterilizar el sobrenadante (que contiene el anticuerpo) a través de un filtro de 0,22 micras. Almacenar los sobrenadantes a 4 ° C (a corto plazo) o se congelan a -20 ° C (a largo plazo).

4. Purificación de anticuerpos por cromatografía de afinidad El uso de una cromatografía de líquidos automatizado de proteínas Fast System (FPLC)

NOTA: El siguiente procedimiento general se puede aplicar a sistemas más automatizados. La purificación se puede realizar a temperatura ambiente o a 4 ° C (si el sistema de FPLC se mantiene en una habitación fresca).Una serie de pruebas de exploración se puede realizar para identificar las condiciones óptimas de purificación incluyendo matriz de columna apropiada, tampón, tampón de elución y pH de unión para asegurar la máxima recuperación de anticuerpo purificado a partir de medio condicionado (consulte la sección Resultados). Las condiciones óptimas dependen del anticuerpo o proteína que se purifican. Las purificaciones se realizaron en un sistema de FPLC automatizado. Las purificaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente usando una proteína de 5 ml una columna.

1. Preparar los siguientes tampones usando agua ultrapura y ajustar el pH recomendado para luego filtrar a través de un filtro de 0,22 micras.
   1. Preparar 1 L de solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 (tampón de unión) mediante la mezcla de los siguientes: M NaCl 0,14, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na ₂ HPO ₄ y 0,001 M KH ₂ PO _4. Ajustar el pH si es necesario antes de filtrar la memoria intermedia.
   2. Preparar 500 ml de pH 2,7 (tampón de elución) 0,1 M glicina-HCl. Ajustar el pH antes de filtrar la piel de anteer.
   3. Preparar 50 ml de M Tris pH (tampón de neutralización) 9,0 1.
2. Asegurar que todas las conexiones de alimentación y del sistema de comunicación con el ordenador se realizan. Los dispositivos deben ser visibles en el módulo "Control System 'software. Asegúrese de célula UV se fija en 280 nm longitud de onda. Opcional: Calibre metros pH si está conectado y para ser utilizado.
3. Sumergir los tubos de entrada de A, B y la bomba de muestra en agua ultrapura para lavar el sistema. Purgar las bombas con una jeringa si hay aire en el tubo o una sospecha de aire en el sistema. Lavar el sistema con agua por la operación manual a través del controlador del sistema o a través de un método automatizado. Observe que la presión, conductividad, pH y rastreo UV280 se mantienen consistentes y que el límite de presión de la columna no se excede según la especificación del fabricante.
   NOTA: Las anomalías pueden indicar el aire o el bloqueo en el sistema que debe ser tratada antes de continuar.
4. En el módulo controlador del sistema, inicie el caudal a 1ml / min de forma manual a través de la bomba A, ya sea en la carga (sin pasar por el loop de muestra) o inyectar (a través de la muestra circular) condiciones de iniciar la conexión de la columna. sistema de tubos de desconexión en la entrada de posición de la columna y retirar el tapón conectado a la entrada de la columna.
   1. Permitir que el agua fluya desde el tubo de gota a gota sistema en la parte superior de la columna a continuación, conectar el tubo del sistema a la columna. Tener la entrada de la columna y el accesorio de entrada desbordante de gotas de agua asegura una conexión libre de burbujas de aire.
5. Una la salida de la columna en la salida de aguas abajo y verifique que todos los accesorios están bien apretados. Con la columna que ahora se atribuye al sistema, no superarán los límites aplicables límite máximo de presión y caudal como se indica en las especificaciones de las columnas.
6. Lavar la columna con 5 volúmenes de columna (CV) de agua. Si es necesario, continúe hasta que la columna de lavado UV280 trazado se ha estabilizado.
7. Sumergir los tubos de entrada de A en tampón de unión, B en el tampón de elución y la bomba de la muestra en tampón de unión to equilibrar el sistema en tampones correctos. Llenar los tubos de entrada con tampón utilizando PumpWash por la operación manual.
8. En el módulo del software del 'Editor de métodos', utilice el asistente método para configurar un método de cromatografía de afinidad por la columna que está destinado a ser utilizado.
   NOTA: Los sistemas automatizados de FPLC vienen con métodos pre-llenados con la configuración recomendada (es decir, caudal y presión límite) y ejecutar medidas en base a la columna (fabricante, matriz y tamaño) seleccionada para la purificación.
   1. Utilice los siguientes pasos de ejecución para la proteína A cromatografía de afinidad:
      1. el sistema se equilibre con 5 VC de tampón de unión y recoger caudal contínuo en un contenedor de residuos.
      2. Cargar la muestra en la columna (volumen se va a cargar manualmente se especifica en el método) y recoger caudal contínuo en un recipiente separado.
      3. Sistema de lavado con 5 VC de tampón de unión y recoger caudal contínuo en un recipiente separado.
      4. la columna se eluye con 5 CV isocratfraccionamiento ic usando tampón de elución y tomar la muestra anticuerpo purificado como fracciones de colector de fracciones.
      5. el sistema se equilibre con 5 VC de tampón de unión y recoger caudal contínuo en un contenedor de residuos.
9. Una vez que el método ha sido configurado, especificar el volumen de medio acondicionado que ha de aplicarse a la columna y guardar el método.
   Nota: El volumen especificado en el método debe ser 5 a 10 ml menor que el volumen real para evitar la introducción de aire durante la carrera de la muestra. El volumen específico utilizado en este protocolo es de 90-120 ml.
10. Sumergir el tubo de la bomba de la muestra en el recipiente que contiene el medio condicionado.
11. Preparar un recipiente separado para recoger flujo a través de la muestra a través de la tubería de salida especificado.
    NOTA: Es importante recoger el caudal contínuo en el caso de que ocurra un error durante la ejecución o la capacidad de fijación de la columna se supera el caudal contínuo que requiere volver a aplicar a la columna o la purificación repeated.
12. Preparar los tubos de recogida en el colector de fracciones. Añadir 100 l de tampón de neutralización por 1 ml de volumen de fracción. El sistema FPLC se eluir automáticamente las fracciones en los tubos de recogida.
13. En el módulo del software del "Sistema de Control", abra el método que se ejecute.
    NOTA: El desarrollo del método se inicia en una serie de páginas que incluyen la comprobación de las variables del método, la configuración de colector de fracciones y la definición de nombre de archivo de resultados y la ubicación de almacenamiento.
14. Haga clic en Inicio para iniciar la carrera. La carrera se puede controlar en el módulo "Control System '.
15. En la terminación de la ejecución de la purificación, comprobar el cromatograma resultante en el módulo "Evaluación" en el software del sistema.
16. Combinar todas las fracciones que contienen proteínas en un tubo, intercambio de tampón separar y concentrar en PBS usando un dispositivo de filtración centrífuga con 30 kDa de peso molecular de corte. Realice los pasos de centrifugación de acuerdo con el fabricante delinstrucciones.
17. Medir la concentración de anticuerpos usando el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) según las instrucciones del fabricante.
18. Si otro purificación de ejecución se va a realizar, el primer tubo de la bomba de la muestra en tampón de unión y repita los pasos 4.9 a 4.14.
19. En la terminación de carreras de purificación, sumergir tubos de entrada de A, B y la bomba de muestra en agua ultrapura y se lava el sistema y la columna tal como se realizó en el paso 3.
20. Sumergir A, B y tubería de la bomba de la muestra en un 20% de etanol y repita el procedimiento de lavado para el almacenamiento del sistema y la columna.
21. Desconectar la columna de la toma de corriente abajo y vuelva a colocar el tapón de columna, a continuación, desconecte la columna en la entrada y vuelva a colocar el tapón, vuelva a conectar la tubería al sistema. Almacenar la columna a 4 ° C.

Resultados

Producción estable de trastuzumab por las células HEK-293 transfectadas se confirmó usando interferometría bio-capa (BLI) tal como se presenta en la Figura 1. Una curva estándar de IgG se generó mediante la medición de la tasa de unión entre un estándar de anticuerpo IgG y proteína A biosensor (Figura 1A). La muestra de sobrenadante crudo se midió de manera similar, a continuación, su concentración interpolada a partir de la curva estándar ...

Discusión

Este protocolo se detalla la transfección, la expresión estable y la purificación de un anticuerpo terapéutico en las células HEK-293. La expresión estable de genes de anticuerpos es el primer paso en la generación de una línea celular productora de anticuerpos para el desarrollo y fabricación de un anticuerpo terapéutico. Mientras ovario de hámster chino (CHO) siguen siendo la plataforma de expresión de elección para proteínas terapéuticas, la línea celular HEK-293 está ganando importancia con la compr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
pFUSE vector series	InvivoGen	N/A	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series	ACYTE Biotech Pty Ltd.		Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector	N/A	N/A	Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series	Lonza		Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	Addgene	61883	Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar	Jomar Life Research	fas-hg-s	Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB	Jomar Life Research	fas-hg-l	Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin.
Glycerol, BioXtra, ≥99%	Sigma-Aldrich	G6279	Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	Astral Scientific	G221020	Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells	Life Technologies	R790-07	HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium	Life Technologies	12338-018	Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188	Sigma-Aldrich	K4894	Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
DMEM, high glucose	Life Technologies	11995-065
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum	Life Technologies	10082-147
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000	Polysciences, Inc.	23966	Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use.
OptiPro SFM	Life Technologies	12309-050	Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution	Jomar Life Research	ant-hg-1
Dimethylsulphoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	AJA2225
Tryptone (casein peptone)	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml	Astral Scientific	09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column	Sigma-Aldrich	GE17-0403-01
AKTApurifier 100	GE Healthcare	28406266	Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl	Sigma-Aldrich	G2879
Citric Acid, monohydrate	Astral Scientific	BIOC2123
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate	Astral Scientific	BIOCB0035
1 M Tris-HCl solution pH 9.0	Astral Scientific	BIOSD8146
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)	Merck Millipore	UFC803008/UFC903008	Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
BLItz System	fortéBIO	45-5000	Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors	fortéBIO	18-5010
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution	Astral Scientific	786-502
Ammonium Persulfate (APS)	Astral Scientific	AM0486
TEMED	Astral Scientific	AM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250	Astral Scientific	786-498
Precision Plus Dual-Color Protein Standard	Bio-Rad	1610374