Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Özet

Bu protokol, bir memeli ekspresyon sistemi içinde terapötik bir antikor üretimini tarif eder. Tarif edilen yöntemler, afinite kromatografisi kullanılarak, büyük ölçekli kültür ve saflaştırma ayarlamak vektör DNA, kararlı transfeksiyonu ve bir insan embriyonik böbrek 293 hücre hattı serumsuz adaptasyon hazırlanmasını içerir.

Özet

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Giriş

terapötik antikorların başarılı nesil terapötik bir dalga başlar Antikor gelişme içine önemli miktarda yatırım sürmeye devam eder. Antikor pazar uygun özelliklere ⁴ antikor fragmanları ^1, antikor-ilaç konjugatlarının ² bispesifik antikorlar ³ ve işlenmiş antikorlar suretiyle yeniden beklenmektedir. İlaç ilgi kazanıyor başka sınıf biyobenzerler vardır. Biyobenzer antikorlar zaten düzenleyici onayı almış bir terapötik antikorun ürünlerini çoğaltmak 'son derece benzer'. Önerilen bir Biyobenzer yapısı, fonksiyon, hayvan toksisite, klinik güvenlik ve etkinliği, insan farmakokinetik (PK), farmakodinamik (PD) ve immünojenite ^{5, 6} ile ilgili olarak yaratıcısı antikoru ile uyumlu olmalıdır.

onay rBiyobenzer antikorların ates nedeniyle ürünün nihai kalitesi üzerinde sıkı kısıtlamalar yavaş olmuştur. Böyle son işlem adımlarına yoluyla hücre hatları ve kültürleme koşulları belirli tam olarak üretim süreçlerinin tescilli kalabilir. Dahası, antikor üretimi doğal oldukça benzer bir ürün üretme meydan ekleyebileceğiniz değişkenlik derecesi gerektirir. Kapsamlı bir fizikokimyasal ve biyofizik karakterizasyonu ve karşılaştırma oldukça zordur, ancak Biyobenzer antikorların özelliklerini gösteren bir dizi çalışma literatürde ^{7, 8, 9} ortaya çıkıyor.

terapötik bir antikor üretme ilgili antikor için geni taşıyan bir vektör ile memeli konakçı hücrelerinin transfeksiyonu ile başlar. Vektör tasarımı, hücre dizisi ve kültür koşulları eski kurmak için anahtar faktörlerdirpression sistemi.

antikorların DNA dizileri İlaç Bankası (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ya da patent dahil olmak üzere araştırma yayınlarından kaynaklı olabilir. Örneğin, trastuzumab sırası İlaç Bankası (: DB00072 DB ID) aracılığıyla kullanılabilir. değişken bölgelerinin amino asit dizisi istenen konakçı türlerinde sentezi için gen tasarımı ve optimizasyonu geçirebilmektedir. Bu hiçbir değişiklik amino asit sekansına yapılan bir biyobenzer antikor için önemlidir. sentezlenmiş sonra, antikor genleri seçim uygun bir vektör içine alt klonlanabilir.

İnsan IgG antikorları iki özdeş ağır zincir ve iki özdeş hafif zincirlerin oluşur. Her iki zincir sıkı bir biçimde düzenlenmesi sentezleme memeli hücrelerinde ¹⁰ heterolog IgG proteini optimal üretimi için gereklidir. arası zincirli disülfid bağının oluşmaması gerekir ve post-translasyonel modifikasyonlar, bir dizi olması hem de İçiprotein biyosentezi sırasında troduced. vektörlerin bir dizi antikor genleri (Malzeme Tablo bakın) ifade etmek için özel olarak tasarlanmış olduğunu mevcuttur. Bu antikor özel vektörler, genellikle, her zincirin bu nedenle sadece değişken bölgeleri klonlama gerektirir ağır hem de hafif zincirlerin sabit bölgeleri ifade eder.

iki bağımsız yapıların (ko-transfeksiyon) ile hücrelerin transfeksiyonu, ağır ve hafif zincir kodlayan genlerin verilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Başka bir deyişle, her bir genin endoplazmik retikulum içinde birleştirilmeden önce, kendi promoter tarafından tahrik edilen ve ayrı antikor zincirleri olarak transkripsiyonu. Diğer taraftan, çoklu-sistronik vektörler mRNA ¹¹ iç bölgelerinden izin çeviri ile tek bir mRNA transkripti olarak birden fazla genin ifadesini izin dahil dahili ribozom giriş sahası (IRES) elemanları vardır. Bu durumda, ağır ve hafif zincir kodlayan genler arrang bağlanmış olanHer iki antikor zincirlerinin ^{10, 12} eş ifadesini elde etmek için ası,.

geçici olarak transfekte hücreler, deney sınırlı sayıda gerçekleştirmek için yeterli protein elde birlikte, genom entegrasyonu için seçim geçiren stabil olarak transfekte edilmiş hücre hatları daha yüksek verim verebilir. Daha yüksek protein miktarlarının in vitro karakterizasyonu ile ilgili deney geliştirme sağlar ve klonal hücre hattı ve kurşun aday seçimi gibi alt uygulamalar dikkate antikor kalitesinin bir göstergesini sağlar.

Bu maddenin amacı, bir memeli ekspresyon sisteminde üretilmiş bir terapötik antikorun kararlı ifadesi ve saflaştırılması tarif etmektir. Gerçekten de, bu yöntem, biyobenzer antikorun ifadesine uygulanabilir. yöntem, zaman alıcı ste olsa önemli için devam etmeden önce, antikorların başlangıç ​​karakterizasyonu için kullanılabilirdaha büyük ölçekli üretimi için bir arzu klon belirleme ps. Dahası, bu yöntem diğer proteinleri ve sadece antikorların ifade edilmesi için kullanılabilir.

Aşağıdaki detaylı protokol terapötik antikor trastuzumab ifadesini açıklar. Bu, otomatik bir kromatografik yöntem ile, HEK-293 hücre hattı ve antikor proteininin saflaştırılmasına kararlı transfeksiyonu takiben vektör DNA'nın hazırlanması oluşur.

Protokol

NOT: uygun bir memeli ifade vektörü, bu protokol için kullanılmalıdır. Burada, iki ekspresyon kasetleri içeren tek bir yapı kullanılmıştır (örneğin ağır ve hafif zincir ekspresyon ayrı promoterler tarafından tahrik edilir). Trastuzumab, ağır ve hafif zincirler, daha önce vektörüne klonlanmıştır. Bu vektör bir değil, kar amacı gütmeyen plazmid depo ¹³ ile elde edilen Andrew Beavil bir hediye oldu.

1. geri kazanımı ve vektör DNA ölçek büyütme

Not: Vektör DNA, Escherichia coli XL-1 Mavi suşu bir yumuşak agar levha kültür olarak alınmıştır; Vektör higromisin direnç taşımaktadır.

1. Daha sonra çizgi bir Luria Bertani (LB) agar plaka 75 mikrogram ile hazırlanan bıçak kültürünün yumuşak agar içine steril bir aşılama bıçak ya da döngü takın / izole koloniler için ml higromisin. 18-24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plakası.
2. 75 ug / ml higromisin içeren 5 ml Terrific suyu (TB) içine tek bir koloni inoküle. incu225 rpm çalkalanarak 18-24 saat boyunca 37 ° C 'de kesmek kültürü.
3. yavaşça -80 ° C de meydana gelmekteydi ve dondurularak 200 ul% 80 gliserol ile kültür, 800 ul karıştırılarak vektör DNA, bir gliserol stokundan hazırlamak için bir gece boyunca kültür kullanın.
   1. Ihtiva eden 100 mi TB gecelik kültüründen 100 ul ekle 75 ug / bölmeli bir çalkalama şişesinde (örneğin 1/1000 seyrelti) içinde higromisin ml. 225 rpm çalkalanarak 18-24 saat boyunca 37 ° C 'de kültür inkübe edin.
4. bir gece kültürden sonra, ayıklamak ve şu istisna ile MIDI / maksi hazırlama kiti üreticinin talimatlarına göre DNA saflaştırılması; su (pH 7,0-8,5) ile son adım, elute veya tekrar süspansiyon DNA sırasında.
5. daha sonra -20 ° C de, DNA depolamak 260 ve 280 nm 'de konsantrasyon ve absorbans okumaları ile DNA saflığı kontrol edin.
   NOT: İsteğe bağlı (tavsiye): Sıra DNA kimliğini doğrulamak için vektör-spesifik primerler kullanılarak.

2. HEK-293 hücrelerinin kararlı transfeksiyonu

1. Büyüme ve Erlenmeyer şişelerinde% 0.1 noniyonik yüzey aktif madde ile takviye edilmiş serumsuz ortamda, standart protokollere göre, HEK-293 hücreleri (süspansiyon hücreleri) korur. 2 x 10 ⁵ hücre / ml ve alt kültür her dördüncü gün koruyun. % 5 _CO2 ve 120 rpm dönme ile 37 ° C 'de kültür hücreleri.
   Not: Hücreler, en az 4 gün boyunca kültür edilmiş ve transfeksiyondan en fazla 4 hafta önce olmalıdır. Serum içeren ortam içinde mono-tabaka olarak yetiştirilen HEK-293 hücreleri bu işlem için kullanılabilir.
2. Günde, transfeksiyondan önce, tohum, HEK-293 hücreleri, bir 12-yuvalı plakanın yuvaları içinde 3 x 10 ⁵ hücre / ml'de 2% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Ortamı (DMEM) içinde mi ( FBS). Transfeksiyon gününde, hücreler% 80-90 konfluent ulaşmış kontrol
3. Daha sonra karıştırın transfeksiyon medyada ayrı ayrı DNA ve polietilenimin (PEI) seyreltin.
   1. 300 ul transfeksiyon medyada kuyu başına 1.25 mikrogram vektör DNA (12 kuyuları için 15 mikrogram) seyreltin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
   2. (12 kuyu 30 ul, yani 1: PEI DNA 2 oran) 1 mg / ml PEI solüsyonu 2.5 ul seyreltilir 300 ul transfeksiyon ortamı içinde. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
   3. hafifçe karıştırın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe, seyreltilmiş PEI seyreltilmiş DNA ekleyin.
4. plakanın her oyuğuna DNA / PEI karışımı damla damla 50 ul ekle. 24 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 _CO2 transfeksiyon karışımı daha sonra plaka yer dağıtılması için hafifçe plaka sallayın.
5. Oyuk başına B higromisin ve 10 gün boyunca 37 ° C'de,% 5 _CO2 ile plaka dönüş ml / 50 ug ekleyin.
   Not: kararlı bir şekilde transfekte edilmiş hücrelerde, uygulanabilir ve plakaya eklenir ise 10. günde, un transfekte edilmiş hücreler, plaka yüzeyindeki öldü ve müstakil olacaktır.
6. ile kuyularda medya değiştirin1/4 hacim serumsuz ortam ve 3/4 hacim DMEM% 10 FBS (örneğin, 0.5 mi serumsuz ortam + 1.5 ml DMEM =% 7.5 nihai serum konsantrasyonu) ve 4 gün boyunca inkübe ile takviye edilmiştir.
7. % 10 FBS (+ 1 mi DMEM =% 5 son serum konsantrasyonu, yani 1 mi serumsuz ortam) ile desteklenmiş 1/2 hacim serumsuz ortam ve 1/2 hacim DMEM ile kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin.
8. % 10 FBS (örneğin, 1.5 mi serumsuz ortam + 0.5 mi DMEM =% 2.5 nihai serum konsantrasyonu) ile desteklenmiş 3/4 hacim serumsuz ortam ve 1/4 hacim DMEM ile kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin.
9. % 0.1 noniyonik yüzey aktif madde (örneğin,% 0 son serum konsantrasyonu) ile desteklenmiş serumsuz ortam 2 ml kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin.
   Not: serumsuz uyarlanması sırasında hücreler üzerinde 50 ug / ml higromisin B seçici bir basınç muhafaza edin. serum ücretsiz medya adapte Hücreler kuyuların yüzeyinden ayırmak ve i küme olabilirn süspansiyon. 50 ug ek takviyesi ile kültür koşulları için 2.1 adıma bakın / B. ml higromisin
10. Bir pipet kullanarak, hafifçe ayrı tüp içine 12 oyuklu plaka ve havuz hücre süspansiyon kültürleri karıştırın.
    1. Bir hemasitometre kullanarak, 2 x 10 ⁵ hücre / ml bir Erlenmeyer şişesi içinde 30 ml serumsuz ortam içinde toplanmış hücreleri ve tohum numaralandırmak. % 5 _CO2 ve 120 rpm dönme ile 37 ° C 'de kültür hücreleri. Altkültür ve her dördüncü gün genişletin.
11. / 1 x 10 ⁷ hücre 10 şişe elde etmek için gerekli hücre yoğunluğu kültür boyutunu genişletmek sıvı azot içinde dondurulması için şişeyi devam edin. % 10 dimetilsülfoksit (DMSO) ihtiva eden serumsuz ortam hücreleri dondurun.
    Not: antikor içeren koşullu ortam, protein üretimini teyit etmek için her bir alt kültür hasat veya saflaştırma koşulları optimize etmek için kullanılabilir. klimalı ortam hasat ve alt kültür hücreleri korumak, en kültürünü santrifüj5 dakika boyunca 300 x g daha sonra bir 0.22 mikron filtre içinden süpernatan filtre-sterilize edin. Filtre yüzer 1-2 hafta veya daha uzun süreli depolama için -20 ° C, 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.

Toplu kaplamak Kültür 3. Büyük Ölçekli Antikor Üretimi

NOT: Antikor üretimi mevcut hücreler kurulum toplu kaplamak kültür hacmine dayalı gerekli hücre yoğunluğuna genişletilir adım 2.11 dan takip edilebilir. Aksi takdirde, soğukta korunan çözülmüş olan hücreler bir kez uygun bir hücre yoğunluğuna ve hacmine genişletilmiş bu aşamada başlar. Çeşitli kültür takviyeleri antikor üretimini optimize etmek için kullanılabilir; tripton kullanımı antikor verimi Bu protokolde gösterilmiştir artırmak için.

1. Tohum hücreler iki Erlenmeyer şişelerinde 100 mi serumsuz ortam içinde 2 x 10 ⁵ hücre / ml'de (takviye un ve besin takviye kültürlerden antikor verimlerini karşılaştırmak üzere). 37 ° C'de Kültür ° C,% 5 _CO2 ve 120 rpm.
2. 24 saat sonra, besin takviye kültüre% 0.5 bir son konsantrasyona tripton ekleyin. serum serbest medya ile un takviye kültür hacmini eşitlemek.
3. Gün 8, hücre canlılığı izlemek için bir hemositometre kullanılarak, günlük kültürlerin hücre sayımı gerçekleştirin. hücre canlılığı, 80% 'den daha az bir kez kültür süpernatanlarının hasat.
   1. 3,000 xg 15 dakika için kültürlerin santrifüj ile hasat yüzer madde daha sonra 0.22 um'lik bir filtreden süpernatan içeren (antikoru) filtre-sterilize edin. 4 ° C (kısa süreli) olarak süpernatantlar saklayın veya -20 ° C (uzun vadeli) donma.

Bağlantı Kromatografisi ile saflaştırma 4. Antikor otomatik bir hızlı protein sıvı kromatografi kullanarak (FPLC) Sistem

Not: Aşağıdaki prosedür, genel olarak, çoğu otomatik sistemlere uygulanabilir. Saflaştırma, oda sıcaklığında gerçekleştirilir ya da 4 ° C 'de (FPLC sistemi serin bir odada muhafaza edilir ise) olabilir.keşif bir dizi test (Sonuçlar bölümüne bakınız) koşullandırılmış ortamdan saflaştırıldı antikorun en iyileşme sağlamak için tampon elüsyon tampon ve pH, bağlayıcı uygun sütun matrisi içeren uygun saflaştırma koşulları belirlemek için gerçekleştirilebilir. Optimal koşullar, antikor veya protein arındırılmadan bağlıdır. Saflaştırma otomatik bir FPLC sistemi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma 5 ml'lik bir Protein A kolonu kullanılarak oda sıcaklığında yapıldı.

1. ultra saf su kullanılarak, aşağıdaki tamponlar hazırlamak ve daha sonra bir 0.22 mikron filtre içinden filtre tavsiye edilen pH ayarlamak.
   1. 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCI, 0.01 M _Na-2 HPO ₄ 0.001 M KH ₂ PO _4: aşağıdakileri karıştırarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), pH 7.4 (bağlanma tamponu) 1 L hazırlayın. tampon filtreleme önce gerekirse pH ayarlayın.
   2. 0.1 M glisin-HCI pH 2.7 (elüsyon tamponu), 500 ml hazırlayın. buff filtreleme önce pH ayarlayıner.
   3. 1 M Tris pH 9.0 (nötralizasyon tamponu) 50 ml hazırlayın.
2. yapılan bilgisayar ile tüm sistem güç ve iletişim bağlantılarını sağlamak. Cihazlar yazılımı 'Sistem Denetimi' modülünde görünür olmalıdır. Emin UV cep 280 nm dalga boyunda ayarlanır. İsteğe bağlı: Bağlı ve kullanılacak eğer pH metre kalibre.
3. sistemin yıkanması, aşırı saf su içinde A, B ve örnek pompa giriş tüpleri bırakın. boru içindeki hava veya sistemde bir hava şüphe varsa bir şırınga ile pompaları temizleyin. sistem kontrolörü üzerinden veya otomatik yöntemiyle manuel kullanıma su ile sistemi yıkayın. Bu basınç, iletkenlik, UV280 izleme ve pH tutarlı kalır ve sütun için basınç limiti üreticinin şartnamesine göre aşmamak gözlemleyin.
   NOT: anormallikleri devam etmeden önce ele alınması gereken sistemde hava veya tıkanıklığa işaret eder.
4. sistem kontrol modülü, 1 de debi başlatmakml / dk manuel ya yük pompa A yoluyla (örnek döngü atlayarak) veya sütun bağlayan başlamak için pozisyon (örnek döngü yoluyla) enjekte edilir. Kes sistem sütun konumunu girişinde boru ve sütun girişine bağlı tıpa kaldırın.
   1. Su daha sonra kolona sistemi boru eklemek sütununun tepesine sistem boru damla damla akmasına izin verir. Sütun girişi olan ve giriş uydurma su damlaları ile taşan hava kabarcıkları serbest bir bağlantı sağlar.
5. mansap çıkışında sütun çıkışını takın ve tüm parçaları sıkıca tutturulmuş emin olun. Sütun artık sisteme bağlı sütun şartnamesinde belirtildiği gibi, maksimum basınç sınırı ve debi sınırlarını aşmamaktadır.
6. su, 5 kolon hacminde (CV) ile kolon yıkanır. Gerekirse UV280 izleme stabilize kadar, kolon yıkama devam ediyor.
7. tampon Bağlama A'nın giriş tüpleri daldırın, Tasfiye B tampon ve Ciltleme tampon t örnek pompasıo doğru tamponlarda sistemi dengeye. manüel işlemle PumpWash kullanarak tamponu ile giriş tüpleri doldurmak.
8. Yazılımın 'yöntemi Editörün' modülünde, kurulum için bir yöntem sihirbaz kullanılmak üzere tasarlanmıştır sütun için bir afinite kromatografisi yöntemi kullanın.
   NOT: Otomatik FPLC sistemler yöntemleri önerilen ayarlar (yani debi ve basınç sınırı) ile önceden doldurulmuş ve saflaştırılması için seçilen sütunun (üretici, matris ve boyut) dayalı adım koşmak ile birlikte gelir.
   1. Protein A afinite kromatografisi için aşağıdaki çalışma adımları kullanın:
      1. Bağlama tamponu 5 CV ile sisteme dengelenmesi ve atık kabına flowthrough toplamak.
      2. Sütun üzerine yük numune ve ayrı bir kabın içine flowthrough toplamak (hacim yöntemi elle belirtilen yüklenecek).
      3. Bağlama tampon çözeltiden 5 CV ile yıkama sistemi, ayrı bir kap içine flowthrough toplar.
      4. 5 CV isocrat ile elüt sütunuElüsyon tamponu ve fraksiyon toplayıcı tarafından fraksiyonları gibi saflaştırılmış antikor numune toplamak kullanarak IC fraksiyonasyon.
      5. Bağlama tamponu 5 CV ile sisteme dengelenmesi ve atık kabına flowthrough toplamak.
9. yöntem kurulumu edildikten sonra, koşullu ortamın hacmi kolonuna uygulanacak belirtmek ve yöntem kaydedin.
   Not: Yöntem belirtilen birim örnek akımı boyunca hava giriş önlemek için, gerçek hacmi 5-10 mi az olmalıdır. Bu protokolde kullanılan belirtilen hacim 90-120 ml.
10. klimalı ortamı içeren kabına numune pompa hortumunu Batmak.
11. Belirtilen çıkış boru ile örnek flowthrough toplanması için ayrı bir kap hazırlanır.
    NOT: sütun veya arıtma r uygulanamayacağı için flowthrough gerektiren aşıldığında bir hata çalıştırmak veya sütun bağlama kapasitesi sırasında oluşması durumunda flowthrough toplamak için önemlidirepeated.
12. fraksiyon toplayıcı toplama tüpleri hazırlayın. 1 mi fraksiyon hacim başına nötralizasyon tampon 100 ul ekle. FPLC sistem otomatik toplama tüpleri içine kesirler Zehir.
13. Yazılımın 'Sistem Kontrolü' modülünde, yöntem açmak çalıştırılacak.
    NOT: yöntem çalışma yöntemi, fraksiyon toplayıcı kurulum değişkenleri kontrol ve sonuç dosya adını ve depolama konumunu tanımlayan dahil sayfaların bir dizi başlatılır.
14. Çalışmayı başlatmak için BAŞLAT tıklayın. run 'Sistem Denetimi' modülünde izlenebilir.
15. arıtma çalışmasının bitiminde, sistem yazılımı 'Değerlendirme' modülünde sonuçlanan kromatogramı kontrol edin.
16. Ayrı bir tüp, tampon değişimi içine tüm protein ihtiva eden fraksiyonlar birleştirilir ve kesik 30 kDa molekül ağırlığına sahip bir santrifüj filtre cihazı kullanılarak PBS içinde konsantre edilir. üreticinin göre santrifüj adımları uygulayıntalimatlar.
17. üreticinin talimatlarına göre bisinkoninik asit analizi (BCA) kullanılarak antikor konsantrasyonu ölçümü.
18. Başka bir arıtma çalıştırmak yapılacak ise, Bağlama tampon ve tekrar başbakan örnek pompa hortumu 4.9-4.14 adımları.
19. saflaştırma çalışır tamamlanmasından sonra, aşırı saf su içinde A, B ve örnek pompa giriş tüpleri daldırın ve adım 3'te yapılan gibi bir sistem ve sütun yıkayın.
20. sistem ve kolonun depolanması için% 20 etanol ve tekrar yıkama prosedüründe A, B ve örnek pompa hortumunu Batmak.
21. aşağı prizden sütun ayırın ve sütun stoper yerine, daha sonra girişinde sütun ayırın ve stoper yerine, sisteme boru bağlayın. 4 ° C'de sütun saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1 'de gösterildiği gibi transfekte edilmiş HEK-293 hücreleri ile trastuzumab kararlı üretim biyo-tabakalı interferometrik (BLI) kullanılarak teyit edilmiştir. Bir IgG standart eğrisi IgG antikoru standart ve Protein A biyosensör (Şekil 1A) arasındaki bağlanma oranı ölçülerek elde edilmiştir. Ham yüzer kısım Örnek Benzer ölçülmüş, daha sonra da konsantrasyonu, standart bir eğrisi (Şekil 1B) arasın...

Tartışmalar

Bu protokol, HEK-293 hücrelerinde transfeksiyon, stabil ekspresyon ve bir terapötik antikorun saflaştırılması göstermektedir. antikor genlerinin kararlı tanımının, bir terapötik antikorun geliştirilmesi ve üretimi için bir antikor üreten hücre hattı oluşturmak için ilk adımdır. Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücreleri, terapötik proteinler için tercih edilen sentezleme platformu kalırken, HEK-293 hücre hattı mesaj açısından bu hücrelerde üretilen proteinler, doğal insan proteini olarak...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
pFUSE vector series	InvivoGen	N/A	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series	ACYTE Biotech Pty Ltd.		Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector	N/A	N/A	Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series	Lonza		Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	Addgene	61883	Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar	Jomar Life Research	fas-hg-s	Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB	Jomar Life Research	fas-hg-l	Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin.
Glycerol, BioXtra, ≥99%	Sigma-Aldrich	G6279	Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	Astral Scientific	G221020	Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells	Life Technologies	R790-07	HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium	Life Technologies	12338-018	Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188	Sigma-Aldrich	K4894	Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
DMEM, high glucose	Life Technologies	11995-065
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum	Life Technologies	10082-147
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000	Polysciences, Inc.	23966	Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use.
OptiPro SFM	Life Technologies	12309-050	Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution	Jomar Life Research	ant-hg-1
Dimethylsulphoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	AJA2225
Tryptone (casein peptone)	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml	Astral Scientific	09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column	Sigma-Aldrich	GE17-0403-01
AKTApurifier 100	GE Healthcare	28406266	Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl	Sigma-Aldrich	G2879
Citric Acid, monohydrate	Astral Scientific	BIOC2123
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate	Astral Scientific	BIOCB0035
1 M Tris-HCl solution pH 9.0	Astral Scientific	BIOSD8146
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)	Merck Millipore	UFC803008/UFC903008	Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
BLItz System	fortéBIO	45-5000	Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors	fortéBIO	18-5010
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution	Astral Scientific	786-502
Ammonium Persulfate (APS)	Astral Scientific	AM0486
TEMED	Astral Scientific	AM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250	Astral Scientific	786-498
Precision Plus Dual-Color Protein Standard	Bio-Rad	1610374