הפקה בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן רפואי

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של נוגדן טיפולי מערכת ביטוי יונקת. השיטות שתוארו כוללות הכנת DNA וקטור, transfection היציבה והתאמת סרום ללא של קו תא 293 כליות עוברי אנושי, להקים תרבויות בקנה מידה גדולות טיהור באמצעות כרומטוגרפיה זיקה.

Abstract

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Introduction

ההצלחה של נוגדנים טיפוליים ממשיכה לנסוע השקעה ניכרת לתוך פיתוח נוגדן כגל של הרפוי דור הבאים מתחיל. שוק הנוגדנים צפוי לעצב מחדש מרסיסי נוגדן ^1, conjugates ^2, נוגדני bispecific סמי נוגדן ³ ונוגדנים מהונדסים עם תכונות חיוביות ^4. מחלקה נוספת זוכה להתעניינות מחודשת התרופות הם biosimilars. נוגדני Biosimilar הם "מאוד דומים" לשכפל מוצרים של נוגדן טיפולי קבל אישור רגולטורים כבר. Biosimilar מוצעת חייבת להיות זהה לזו הנוגדן היוזם לגבי המבנה שלה, פונקציה, רעילויות בבעלי חיים, בטיחות ויעילות קליניות, פרמקוקינטיקה אדם (PK), פרמקודינמיקה (PD) ו חיסוני ^{5, 6.}

האישור rאטס של נוגדני biosimilar היה איטי בשל האילוצים הקפדנים על האיכות הסופית של המוצר. תהליכי הייצור המדויקים כגון ספציפי קווי תאים ותנאי culturing ועד השלבים לעיבוד הסופיים יכולים להישאר קניינית. יתרה מזאת, בייצור של נוגדני מטבעו כרוך מידה של השתנות אשר יכולים להוסיף האתגר בייצור מוצר דומה מאוד. אפיון physiochemical ו biophysical מקיף והשוואה קשה למדי, עדיין מספר מחקרים הוכחת המאפיינים של נוגדנים biosimilar הם מתעוררים בספרות ^{7, 8, 9.}

יצירת נוגדנים טיפוליים מתחילה עם transfection של תאים לארח יונקים עם וקטור הנושא את הגנים של הנוגדן בהתאמה. תנאי עיצוב וקטור, שורת התאים וההתרבות הם שיקולים מרכזיים להקמה לשעברמערכת pression.

רצפי DNA של נוגדנים ניתן מקורות מבנק והתרופות (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) או פרסומי מחקר לרבות פטנטים. לדוגמה, את הרצף של trastuzumab זמין באמצעות בנק והתרופות (ID DB: DB00072). רצף החומצות האמינו של האזורים המשתנים יכול לעבור עיצוב גן ואופטימיזציה לסינתזה של פונדקאי הרצוי. חשוב נוגדן biosimilar ששום שינוי הוא עשה את רצף החומצות האמיניות. לאחר מסונתז, גני נוגדן ניתן subcloned לתוך הווקטור המתאים בחירה.

נוגדני IgG אדם מורכבים משתי שרשרות כבדות זהות ושתי רשתות אור זהות. בחוזקה ביטוי מוסדר הן שרשראות חיוני לייצור אופטימלי של חלבון IgG Heterologous בתאי יונקים ^10. התוך וכן אג"ח דיסולפיד הבין-שרשרת צריך להיווצר ומספר שלאחר translational שינויים צריך להיותtroduced במהלך ביוסינתזה חלבון. מספר הווקטורים זמינים אשר עוצב במיוחד כדי לבטא גני נוגדן (עיינו בטבלה של חומרים). וקטורי נוגדנים ספציפיים אלה בדרך כלל להביע האזורים המתמידים הוא שרשרות כבדות ואור כך שרק האזורים המשתנים של כל שרשרת דורשים שיבוט.

Transfection של תאים עם שני מבנים עצמאיים (-transfection שיתוף) הוא הגישה הנפוצה ביותר להעברת גני קידוד שרשרת כבדה וקלים. כלומר, כל גן הוא מונע על ידי אמרגן משלה עבד כמו שרשרות נוגדן נפרדות בטרם התכנס reticulum endoplasmic. מצד השני, וקטורים רבים cistronic יש אתר כניסה הריבוזום (IRES) אלמנטים משולבים המאפשרים ביטוי של גנים מרובים כמו תעתיק mRNA יחיד עם תרגום מותר מאזורים פנימיים של mRNA ^11. במקרה זה, הגנים המקודדים-שרשרת כבדה ואור הם מצמידים בבית arrangement להשיג ביטוי שיתוף של שני שרשראות נוגדן ^{10, 12.}

בעוד תאי transfected זמני להניב מספיק חלבון כדי לבצע מספר מוגבל של ניסויים, שורות תאי transfected ביציבות שעברו בחירה לשילוב הגנום יכולות לספק תשואות גבוהות יותר. כמויות חלבון גבוהות לאפשר התפתחות assay הנוגעת אפיון במבחנה יכולות לספק אינדיקציה של איכות נוגדן בתמורת יישומים במורד כגון שורת תאים משובטת ובחירת מועמד מובילה.

מטרת מאמר זה היא לתאר את הביטוי וטיהור היציבים של נוגדן רפואי היוצר מערכת ביטוי יונקת. אכן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על הביטוי של נוגדן biosimilar. השיטה יכולה לשמש עבור האפיון הראשוני של נוגדנים לפני שתמשיך הלאה אל קריטי, אם כי זמן רב STEps של זיהוי שיבוט רצוי לייצור בקנה מידה גדול יותר. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לבטא חלבונים אחרים ולא רק נוגדנים.

הפרוטוקול המפורט הבא מתאר את הביטוי של trastuzumab נוגדנים הטיפולי. זה מורכב של הכנת DNA וקטור ואחריו transfection יציבה שורת תאים HEK-293 וטיהור של חלבון נוגדנים על ידי שיטה chromatographic אוטומטיות.

Protocol

הערה: וקטור ביטוי יונקים מתאים חייב לשמש בפרוטוקול זה. הנה, מבנה יחיד המכיל שתי קלטות ביטוי משמש (כלומר כבד וביטוי שרשרת אור הוא מונע על ידי יזמים נפרדים). שרשראות כבדות ואור הרצפטין היו משובטים בעבר לתוך וקטור. וקטור זה היה מתנה אנדרו Beavil, שהושג באמצעות מאגר פלסמיד לא למטרות רווח ^13.

שחזור 1. סולם-אפ של ה- DNA וקטור

הערה: וקטור DNA התקבל כתרבות דקירה אגרה רכה Escherichia coli XL-1 זן הכחול; וקטור מבצע התנגדות hygromycin.

1. הכנס דקירה או לולאה חיסון סטרילי לתוך אגר רך של התרבות דקירה ואז פס לוריא Bertani (LB) צלחת אגר מוכן עם 75 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin עבור מושבות מבודדות. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 18-24 שעות.
2. לחסן מושבה יחיד לתוך 5 מ"ל מרק נהדר (TB) המכיל hygromycin 75 מיקרוגרם / מ"ל. Incuבייט התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18-24 שעות עם 225 סל"ד רועד.
3. השתמש תרבות לילה כדי להכין מלאי גליצרול של DNA וקטור ידי ערבוב בעדינות 800 μl של תרבות עם גליצרול 200 μl 80% בתוך cryovial ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס.
   1. הוספת 100 μl של תרבות לילה 100 מ"ל TB המכיל 75 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin בבקבוק שייקר נבוך (כלומר 1 / 1,000 דילול). דגירת התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18-24 שעות עם 225 סל"ד רועד.
4. לאחר תרבות הלילה, לחלץ ולטהר את ה- DNA על פי הוראות היצרן של ערכת הכנת midi / מקסי למעט הבא; במהלך DNA צעד, elute או גלולה הסופי עם מים (pH 7.0-8.5).
5. בדקו ריכוז טוהר DNA על ידי קריאות ספיגה ב ננומטר 260 ו -280 מכן לאחסן DNA ב -20 ° C.
   הערה: אופציונלי (מומלץ): רצף ה- DNA באמצעות פריימרים ספציפיים וקטור מנת לאמת את הזהות.

2. Transfection היציבה של תאי HEK-293

1. לצמוח ולשמור על תאי HEK-293 (תאי השעיה) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים סרום ללא מדיה בתוספת 0.1% פעילים שטח בלתי יוני צלוחיות Erlenmeyer. לשמור על 2 x 10 ⁵ תאים / מ"ל ו תת בכל יום רביעי. התרבות תאים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ וסיבוב סל"ד 120.
   הערה: תאים צריכים להיות בתרבות במשך לא פחות מ -4 ימים ולא יותר מ -4 שבועות לפני transfection. HEK-293 תאים שגודלו כמו monolayers ב מדיה המכילה סרום יכול לשמש גם לצורך הליך זה.
2. ביום לפני transfection, זרע HEK-293 תאים ב 3 x 10 ⁵ תאים / מ"ל ב הבארות של צלחת 12 גם ב 2 מ"ל של מדיה הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר חום מומת ( FBS). ביום transfection, לבדוק תאים הגיעו 80-90% confluency
3. לדלל דנ"א polyethylenimine (PEI) בנפרד התקשורת transfection ואז לערבב יחד.
   1. לדלל 1.25 מיקרוגרם וקטור DNA לכל טוב (15 מיקרוגרם עבור 12 בארות) ב 300 התקשורת transfection μl. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
   2. לדלל 2.5 μl של 1 מ"ג / מ"ל פתרון PEI (30 μl עבור 12 בארות, כלומר 1: 2 יחס של DNA כדי PEI) ב 300 התקשורת transfection μl. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
   3. להוסיף DNA מדולל ל PEI מדולל, ומערבבים בעדינות דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
4. הוסף 50 μl של dropwise תערובת DNA / PEI היטב כל הצלחת. Rock the הצליח בעדינות כדי לפזר את תערובת transfection ואז למקם את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 24 שעות.
5. הוסף 50 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin B לכל טוב ולחזור צלחת ל -37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 10 ימים.
   הערה: לפי יום 10, תאים בלתי-טרנספקציה ימותו ומנותק מפני השטח של הצלחת, ואילו תאים-transfected ביציבות יהיו קיימא מצורף הצלחת.
6. החלף את המדיה בבארות עם1/4 התקשורת נפח חופשי בסרום DMEM נפח 3/4 בתוספת 10% FBS (כלומר 0.5 מ"ל סרום ללא מדיה + 1.5 מ"ל DMEM = 7.5% ריכוז בסרום סופי) ו דגירה של 4 ימים.
7. החלף את המדיה בבארות עם 1/2 סרום ללא מדיה נפח DMEM נפח 1/2 בתוספת 10% FBS (כלומר 1 מ"ל סרום ללא מדיה + 1 מ"ל DMEM = 5% ריכוז בסרום סופי) ו דגירה של 4 ימים.
8. החלף את המדיה בבארות עם 3/4 סרום ללא מדיה נפח DMEM נפח 1/4 בתוספת 10% FBS (כלומר 1.5 מ"ל סרום ללא מדיה + 0.5 מ"ל DMEM = 2.5% ריכוז בסרום סופי) ו דגירה של 4 ימים.
9. החלף את המדיה בבארות עם 2 מ"ל של סרום ללא מדיה בתוספת 0.1% פעילי שטח בלתי יוניים (כלומר 0% ריכוז בסרום סופי) ו דגירה של 4 ימים.
   הערה: שמרו על 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin B לחץ סלקטיבי על התאים במהלך הסתגלות סרום ללא. תאים מותאמים מדיה בסרום ללא לנתק מפני השטח של בארות ועשויים אשכול iהשעית n. עיין בשלב 2.1 התנאים תרבות עם תוספת נוספת של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin B.
10. בעזרת פיפטה, לערבב בעדינות התרבויות להשעית תאי 12-גם הצלחת וברכה לתוך צינור נפרד.
    1. באמצעות hemocytometer, למנות תאים ונקווה וזרעי ב 30 מ"ל סרום ללא מדיה בבקבוק Erlenmeyer ב 2 x 10 ⁵ תאים / מ"ל. התרבות תאים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ וסיבוב סל"ד 120. תת ולהרחיב כל יום רביעי.
11. להמשיך ולהרחיב גודל תרבות צפיפות התאים הנדרשת להשגת 10 בקבוקונים של 1 x 10 ⁷ תאים / בקבוקון עבור cryopreservation בחנקן נוזלי. להקפיא את התאים סרום ללא מדיה המכילה 10% dimethylsulfoxide (DMSO).
    הערה: אוויר מדיה המכילה נוגדן ניתן לקצור בכל תת לאשר ייצור חלבון או משתמש כדי לייעל את תנאי טיהור. כדי לקצור תקשורת מותנית ולתחזק תאים תת, צנטריפוגות התרבות בXG 300 במשך 5 דקות ואז לסנן לעקר supernatant דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. supernatant המסונן נשמר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות או -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך יותר.

3. בקנה מידה גדול ייצור נוגדנים מן אצווה לגדול תרבות

הערה: ייצור נוגדנים ניתן בעקבות על משלב 2.11 שבו תאים קיימים יורחבו אל צפיפות התאים הנדרשת המבוססת על נפח התרבות יצווה לגדול להיות התקנה. אחרת, תאים שעברו מופשר מ cryopreservation מתחילים בשלב זה התרחב פעם צפיפות תאים מתאימה ונפח. תוספי תרבות שונים ניתן להשתמש כדי לייעל את ייצור נוגדנים; שימוש tryptone כדי להגדיל את תשואת נוגדן מודגמת בפרוטוקול זה.

1. תאי זרע ב 2 x 10 ⁵ תאים / מ"ל ב סרום ללא מדיה 100 מ"ל בשתי צלוחיות Erlenmeyer (להשוות תשואות נוגדן מ בלתי בתוספת ותרבויות-השלימו מזין). תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ו -120 סל"ד.
2. לאחר 24 שעות, להוסיף tryptone לריכוז סופי של 0.5% לרמה של תרבות מזין השלים. להשוות נפח של תרבות בלתי השלימו עם סרום ללא מדיה.
3. מהיום 8, לבצע ספירת תאים של התרבויות יומיות באמצעות hemocytometer לפקח כדאיויות תא. קציר supernatants התרבות פעם כדאי תא היא פחות מ -80%.
   1. supernatant קציר על ידי צנטריפוגה של תרבויות ב 3000 XG במשך 15 דקות ואז לסנן לעקר את supernatant (נוגדן המכיל) דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. אחסן את supernatants ב 4 ° C (לטווח קצר) או להקפיא ב -20 ° C (לטווח ארוך).

4. טיהור נוגדן ידי כרומטוגרפיה זיקת שימוש כרומטוגרפיה נוזלית חלבון המהיר אוטומטי (FPLC) מערכת

הערה: ההליך הבא יכול להיות מיושם בדרך כלל למערכות האוטומטיות ביותר. טיהור יכול להתבצע בטמפרטורת החדר או 4 ° C (אם מערכת FPLC נשמר בחדר קריר).סדרת בדיקות צופיות ניתן לבצע כדי לזהות את תנאי טיהור האופטימליים כולל מטריצת עמודה מתאימה, חיץ מחייב, חיץ elution pH כדי להבטיח התאוששות מקסימלית של נוגדנים מטוהרים מן התקשורת מותנית (ראה סעיף תוצאות). התנאים האופטימליים תלויים הנוגדן או החלבון מיטהרים. Purifications בוצע על מערכת FPLC אוטומטית. Purifications בוצעו בטמפרטורת החדר באמצעות חלבון 5 מ"ל טור.

1. הכן את החוצצים הבאים באמצעות מים ultrapure ולהתאים את ה- pH המומלץ ואז לסנן דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.
   1. הכן 1 ליטר של בופר פוספט (PBS) pH 7.4 (חיץ מחייב) על ידי ערבוב את הדברים הבאים: 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.01 M Na ₂ HPO ₄ ו 0.001 M KH ₂ PO _4. התאם את ה- pH במידת הצורך לפני סינון למאגר.
   2. הכן 500 מ"ל של 0.1 מ '2.7 pH גליצין-HCl (חיץ elution). התאם את ה- pH לפני סינון בעירוםאה.
   3. הכן 50 מ"ל של 1 M טריס pH 9.0 (חיץ נטרול).
2. ודא כי כל חיבורי החשמל ותקשורת המערכת עם מחשב מבוצעים. התקנים צריכים להיות גלויים בתוכנת מודול 'מערכת הבקרה'. ודא תא UV מוגדר ב 280 ננומטר אורך גל. אופציונלי: כיול מד pH אם קשר לשמש.
3. לטבול צינורות כניסה של A, B ו- משאבת מדגם במי ultrapure כדי לשטוף את המערכת. טהר את משאבות עם מזרק אם יש אוויר בצינור או חשד של אוויר במערכת. לשטוף את המערכת עם מים על ידי הפעלה ידנית באמצעות בקר המערכת או באמצעות שיטה אוטומטית. שים לב כי לחץ, מוליכות, מעקב UV280 ו- pH להישאר עקבי כי מגבלת לחץ הטור היא לא חרג לפי מפרט יצרן.
   הערה: חריגות עשויות להצביע על אוויר או סתימה במערכת שראוי להפנות לפני שתמשיך.
4. במודול מבקר מערכת, הפעל את flowrate ב 1מיליליטר / דקה באופן ידני באמצעות משאבה או עומס (עקיפת לולאת מדגם) או להזריק (דרך מדגם הלולאה) עמד להתחיל להתקשר הטור. צינורות מערכת ניתקים על כניסת טור העמדה ולהסיר את הפקק מחובר כניסת הטור.
   1. אפשר למים לזרום מן dropwise צינורות מערכת על גבי בעמודה ולאחר מכן לצרף את צינורות המערכת לעמודה. לאחר כניסת טור כניסת הולם גדותיו עם טיפות מים מבטיחה חיבור ללא בועות אוויר.
5. צרף לשקע העמודה במוצא במורד ולאמת את כל האביזרים מהודקים בחוזקה. עם חברה בעמודה מחוברת למערכת, לא יעלה על גבולות גבול לחץ מקסימלית flowrate כפי שמתואר מפרטי עמודה.
6. לשטוף טור עם 5 כרכים עמודה (CV) של מים. במידת הצורך, להמשיך לשטוף טור עד העקיבה UV280 התייצב.
7. לטבול צינורות כניסת א ב חיץ מחייב, לינה ב Elution חיץ מדגם המשאבה t במאגר מחייבo לאזן את מערכת מאגרים נכונים. ממלאים את צינורות היניקה עם חיץ באמצעות PumpWash ידי להפעלה ידנית.
8. במודול 'עורך השיטות "של התוכנה, השתמש באשף שיטת התקנת שיטת כרומטוגרפיה זיקת העמודה נועדה לשמש.
   הערה: אוטומטיות מערכות FPLC לבוא עם שיטות מראש מלא את ההגדרות המומלצות (flowrate כלומר ולהגביל לחץ) ולהפעיל צעדים מבוססים על העמודה (יצרן, מטריקס וגודל) שנבחרה עבור טיהור.
   1. בצע את השלבים הבאים בטווח עבור חלבון כרומטוגרפיה זיקה:
      1. לאזן מערכת עם 5 קורות חיים של חיץ מחייב ולאסוף flowthrough לתוך מיכל פסולת.
      2. טענו מדגם על הטור (נפח להיות טעון מצוין ידני בשיטה) ולאסוף flowthrough לתוך מיכל נפרד.
      3. מערכת לשטוף עם 5 קורות חיים של חיץ מחייב ולאסוף flowthrough לתוך מיכל נפרד.
      4. טור Elute עם 5 CV isocratחלוקת ic באמצעות הצפת elution ולאסוף מדגם נוגדנים מטוהר כשברים ידי אספן חלק.
      5. לאזן מערכת עם 5 קורות חיים של חיץ מחייב ולאסוף flowthrough לתוך מיכל פסולת.
9. לאחר השיטה כבר התקנה, ציין את היקף התקשורת מותנה להיות מיושם על העמודה ולשמור השיטה.
   הערה: היקף המפורטים השיטה צריכה להיות 5-10 מ"ל פחות נפח בפועל כדי למנוע כניסת אוויר בזמן הריצה המדגם. היקף שצוין להשתמש בפרוטוקול זה הוא 90-120 מ"ל.
10. להטביע את צינורות מדגם המשאבה לתוך כלי המכיל התקשורת מותנה.
11. כן במכל נפרד לאסוף flowthrough מדגם דרך הצינורות לשקע שצוינו.
    הערה: חשוב לאסוף את flowthrough במקרה שמתרחשת שגיאה בזמן הריצה או קיבולת המחייב של הטור היא חריגה המחייבת flowthrough כדי ליישם מחדש לעמודה או r טיהורepeated.
12. הכן צינורות אוסף של אספן חלק. הוספת 100 μl של חיץ נטרול לכל נפח שבריר 1 מ"ל. מערכת FPLC באופן אוטומטי elute את השברים לתוך הצינורות האוספים.
13. במודול 'מערכת הבקרה "של התוכנה, פתח את השיטה שיופעל.
    הערה: בטווח השיטה הוא יזמת סדרה של דפים הכוללים בדיקת המשתנים של התקנת אספן השיטה, חלק והגדרה שם תוצאת קובץ ומיקום אחסון.
14. לחץ על התחל כדי להתחיל את הריצה. הריצה ניתן לנטר במודול 'מערכת הבקרה'.
15. בסיום הריצה טיהור, לבדוק את הכרומתוגרמה וכתוצאה מכך את המודול 'הערכה' ב תוכנת המערכת.
16. מערבבים את כל שברים המכילים חלבון לתוך חילופי צינור, חיץ נפרד ולהתרכז ב PBS באמצעות מכשיר מסנן צנטריפוגלי עם 30 משקל מולקולרי kDa מנותקים. בצע צעדי צנטריפוגה פי יצרןהוראות.
17. מדוד ריכוז נוגדן באמצעות assay חומצה bicinchoninic (BCA) על פי הוראות היצרן.
18. אם בטווח טיהור נוספת הוא להתבצע, ממשלת צינורות מדגם המשאבה במאגר עקידה וחזרו על שלבי 4.9-4.14.
19. בסיום ריצות טיהור, לטבול צינורות כניסה של A, B ו- משאבת מדגם במי ultrapure ולשטוף את המערכת ועמודה כפי שבוצע בשלב 3.
20. לצלול A, B ו- מדגם צינורות המשאבה 20% הליך לשטוף אתנול וחזור לאחסון של מערכת ועמודה.
21. ניתקתי את העמודה משקע במורד ולהחליף פקק טור, ולאחר מכן ניתק טור על הכניסה ולהחליף פקק, חבר מחדש צינורות למערכת. אחסן את הטור על 4 מעלות צלזיוס.

תוצאות

ייצור יציב של trastuzumab ידי תאי HEK-293 טרנספקציה אושר באמצעות אינטרפרומטריה השכבתי ביו (BLI) כמוצג באיור 1. עקומת תקן IgG נוצר על ידי מדידת קצב מחייב בין תקן נוגדן IgG ו חלבון biosensor (איור 1 א). מדגם supernatant הגולמי נמדד באופן דומה, אז ריכוזו אינטרפו...

Discussion

פרוטוקול זה מפרט את transfection, ביטוי וטיהור יציב של נוגדן רפואי בתאי HEK-293. ביטוי יציב של גני נוגדן הוא הצעד הראשון ביצירת קו תא מייצר נוגדנים לפיתוח והייצור של נוגדנים טיפוליים. בעוד שחלה של אוגר סיני (CHO) תאים נשארים פלטפורמת הביטוי מועדף על חלבונים תרופתיים, שורת תאי HEK-29...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pFUSE vector series	InvivoGen	N/A	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series	ACYTE Biotech Pty Ltd.		Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector	N/A	N/A	Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series	Lonza		Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	Addgene	61883	Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar	Jomar Life Research	fas-hg-s	Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB	Jomar Life Research	fas-hg-l	Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin.
Glycerol, BioXtra, ≥99%	Sigma-Aldrich	G6279	Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	Astral Scientific	G221020	Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells	Life Technologies	R790-07	HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium	Life Technologies	12338-018	Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188	Sigma-Aldrich	K4894	Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
DMEM, high glucose	Life Technologies	11995-065
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum	Life Technologies	10082-147
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000	Polysciences, Inc.	23966	Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use.
OptiPro SFM	Life Technologies	12309-050	Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution	Jomar Life Research	ant-hg-1
Dimethylsulphoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	AJA2225
Tryptone (casein peptone)	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml	Astral Scientific	09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column	Sigma-Aldrich	GE17-0403-01
AKTApurifier 100	GE Healthcare	28406266	Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl	Sigma-Aldrich	G2879
Citric Acid, monohydrate	Astral Scientific	BIOC2123
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate	Astral Scientific	BIOCB0035
1 M Tris-HCl solution pH 9.0	Astral Scientific	BIOSD8146
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)	Merck Millipore	UFC803008/UFC903008	Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
BLItz System	fortéBIO	45-5000	Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors	fortéBIO	18-5010
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution	Astral Scientific	786-502
Ammonium Persulfate (APS)	Astral Scientific	AM0486
TEMED	Astral Scientific	AM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250	Astral Scientific	786-498
Precision Plus Dual-Color Protein Standard	Bio-Rad	1610374