JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Abstract

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Introduction

المحركات سوطي تمكن خلايا السباحة عن طريق تناوب خيوط الخلية حلزونية. كمية من عزم الدوران المحرك يمكن أن تولد لمدة معينة من السوط (أي الحمل لزج) يحدد سرعة السباحة. من ناحية أخرى، قدرته على تبديل اتجاه دوران تسيطر هجرة الخلايا في الاستجابة للمواد الكيميائية، وهي عملية تعرف باسم الكيميائي. الكيميائي والحركة كونها عوامل الفوعة 1-3، والمحركات سوطي تم التعرف بشكل جيد على مدى 4 سنوات. وتشير أدلة متزايدة الآن أن المحرك بمثابة mechanosensor - يكشف ميكانيكيا وجود ركائز متينة 5،6. هذه القدرة على الأرجح يساعد في إحداث الاستعمار السطحية والالتهابات 5،7. ونتيجة لذلك، فإن الآليات التي تستشعر المحرك الأسطح ويبادر إشارات ذات مغزى 8،9.

المحرك سوطي يمكن دراستها بسهولة عن طريق الربط في flagellأم إلى الركيزة ومراقبة دوران الخلية. وقد تحقق هذا الربط لأول مرة من قبل سيلفرمان وسيمون، الذي عمل مع متحولة polyhook في كولاي والسنانير تعلق بنجاح إلى ركائز الزجاج مع أضداد هوك 10. تمكين فحص خلايا المربوطة الباحثين لدراسة ردود المحرك التحول إلى مجموعة متنوعة من المحفزات الكيميائية. على سبيل المثال، سيغال وزملاء العمل حفز كيميائيا الخلايا المربوطة مع المعونة من الماصات iontophoretic. التغييرات المقابلة في التحيز CW (جزء من المحركات الوقت تدور في اتجاه عقارب الساعة، CW) مكنهم من قياس حركية التكيف في شبكة الكيميائي 11،12. في حين كان فحص الخلايا المربوطة فعال في دراسة ردود التبديل، وكان قادرا على تقديم نظرة ثاقبة ميكانيكا السيارات على نطاق محدود من الأحمال لزجة 13 فقط. للتغلب على هذه المشكلة، المربوطة ريو وزملاء العمل كروية، والخرز اللاتكس لخيوط بذرة على خلايا تمسك السطوح. وكانت حباتثم تتبعها باستخدام التداخل العودة التنسيق مع ضعف الفخاخ البصرية 14. من خلال العمل مع حبات من مختلف الأحجام، يمكن للباحثين دراسة المحرك على نطاق أوسع بكثير من الأحمال. تم تحسين هذا الاختبار في وقت لاحق من قبل يوان وبيرغ، الذي طور تقنية حبة تتبع القائم على مضخم جنبا إلى جنب مع إضاءة الليزر الظلام الميدان. طريقتهم تتبع تمكين من nanobeads المربوطة الذهب التي كانت صغيرة جدا (~ 60 نانومتر) أن المقاومة لزجة الخارجية كانت أقل مقارنة مع المقاومة لزجة الداخلية للتناوب 15،16. وأدى ذلك إلى قياسات أقصى سرعة للتحقيق في كولاي (~ 300 هرتز). في الخامس alginolyticus، المقايسات حبة مماثلة مكنت قياسات لمعدلات الغزل في الأحمال المتوسطة لزجة (~ 700 هرتز) 17. من خلال تمكين قياس الاستجابات الحركية على مجموعة كاملة ممكن من الأحمال لزجة (من صفر-تحميل لشبه كشك)، قدمت المقايسات حبة أداة الفيزيائية الحيوية الهامة لفهم رعملية توليد orque-18،19.

في الآونة الأخيرة، فإننا تعديل فحص يوان بيرغ لتشمل ملاقط البصرية التي مكنتنا من تطبيق مؤثرات الميكانيكية الدقيقة لمحركات الفردية 6. باستخدام هذه التقنية، أظهرنا أن مولدات القوة التي تدوير المحرك هي mechanosensors ديناميكية - أنها إعادة تشكيلها في استجابة للتغيرات في الأحمال لزجة. فمن الممكن أن هذا استشعار الحمل يؤدي إلى تمايز الخلايا البكتيريا يحتشدون، على الرغم من أن الآليات لا تزال غير واضحة. ومن المرجح أيضا أن المحركات سوطي في الأنواع الأخرى هي أيضا mechanosensitive 20، على الرغم من الأدلة المباشرة غير موجودة. هنا، نحن نناقش النهج القائم على مضخم (PMT) لتتبع دوران من الخرز اللاتكس المربوطة إلى خيوط سوطي 15. بالمقارنة مع تتبع مع الكاميرات فائق السرعة، ومضخم-الإعداد هو مفيد لأنه واضح ومباشر نسبيا لتعقب الخرز واحد في الوقت الحقيقي، وأكثر من الجافية طويلةستعقد. وهي مفيدة بشكل خاص عند دراسة طويلة وقت إعادة عرض في المجمعات المحرك سوطي بسبب المحفزات البيئية 21. على الرغم من أننا بروتوكولات التفاصيل خصيصا لكولاي، ويمكن تكييفه بسهولة لدراسة المحركات سوطي في الأنواع الأخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. خلية التحضير

  1. تنمو الثقافات بين عشية وضحاها من سلالة المطلوب تحمل فليك زجة أليل 15،22 في تريبتون مرق (السل، 1٪ ببتون، و 0.5٪ كلوريد الصوديوم)، يليه التلقيح في 1: 100 التخفيف في 10 مل السل جديدة. تنمو ثقافة في 33 درجة مئوية في حاضنة شاكر حتى OD 600 = 0.5.
  2. بيليه الخلايا في 1500 x ج لمدة 5-7 دقائق وإعادة تفريق بيليه بقوة في 10 مل من فلتر تعقيم العازلة الحركة (MB و 10 ملي الفوسفات عازلة: 0،05-0،06 M كلوريد الصوديوم، و 10 -4 M EDTA، 1 ميكرومتر ميثيونين، 7.0 درجة الحموضة).
  3. كرر الخطوة 1.2 مرتين أخريين وإعادة تفريق بيليه النهائي في 1 MB مل.
  4. القص والتعليق من المارة ذهابا وإيابا ~ 75 مرات بين اثنين من المحاقن مع 21 إلى 23 محولات قياس متصلة بواسطة البولي ايثيلين أنابيب (7-12 سم، وقطره 0.58 ملم الداخلي). الحد من الوقت الكلي لتقطيع إلى 30 - 45 ق.
  5. الطرد المركزي الخلايا المنفصمة في 1500 x ج لمدة 5-7 دقائق وإعادة تفريق للبيليه في 100-500 ميكرولتر من MB.

2. الانزلاق التحضير

  1. إعداد غرفة التصوير التي يقحم اثنين من أشرطة لاصقة على الوجهين بين غطاء الانزلاق وشريحة المجهر. لفحوصات الكيميائي، وتوظيف أي غرفة الموائع الدقيقة التي تمكن من تبادل MB والمنشطات الكيميائية.
  2. إضافة 0.01٪ بولي-L-يسين الحل في الغرفة وبعد 5 دقائق شطف بلطف الأسطح MB (80-100 ميكرولتر).
  3. إضافة 40 ميكرولتر من تعليق خلية في الغرفة وإتاحة الوقت الكافي للمرفق إلى سطح الزجاج (7-8 دقيقة). تتدفق الخلايا فاشل بإضافة 100 ميكرولتر MB على جانب واحد من الغرفة، في حين فتل الحل مع ورقة مرشح من الجانب الآخر.
  4. إضافة 10-15 ميكرولتر من الخرز اللاتكس في غرفة والسماح حبات الوقت الكافي لتسوية ونعلق على الخلايا (7-8 دقيقة). شطف بلطف مع 100 ميكرولتر من MB، كما هو موضح في الخطوة 2.3، لإزالة فاشل الخرز. استخدام مجموعة من حبة الاشتراكيةZES للتجارب طويلة حتى يتوفر النقيض جيدة.

3. تتبع الخرزة

  1. ضع العينة على مرحلة المجهر ومسح سطح حبات تعلق على المحركات. استخدام هدفا 40X مرحلة لإبداء الملاحظات على الرغم من أن المرحلة المجهري ليست ضرورية. بدلا من ذلك، تستخدم التصوير مشرق الميدان طالما يتم الحفاظ على النقيض كافية للتمييز بوضوح حبة مشرق على خلفية داكنة.
  2. مرة واحدة وقد تم اختيار حبة، نقل مرحلة أفقيا لوضع حبة في زاوية محددة مسبقا كما هو مبين في الشكل 1B. حبات موقف في نفس الزاوية لضمان أن اتجاه دوران حبة يعرف بشكل صحيح. حبة مسار المثالي هو دائري تقريبا ولكن مسارات بيضاوية هي مقبولة.
  3. الحفاظ على وتيرة أخذ العينات أعلى من ضعف وتيرة دوران المحرك لتجنب الأخطاء المرتبطة التعرج. في هذا العمل، واستخدام السيارات التي كانت الدورية في50 هرتز وعينة على ترددات التي كانت أعلى 10 مرات (500 هرتز)، للحصول على إشارة على نحو سلس.

تحليل 4. البيانات

  1. مركز ومقياس الفولتية الناتج PMT والإهليليجية الصحيح في مسارات مع التحولات أفيني إذا لزم الأمر 23. استخدام تحليل قوة الطيف لتحديد معدلات دوران 17.
  2. تحديد الزوايا القطبية، θ (ر) = ATAN (ذ (ر) / س (ر)). تحديد الاختلافات في سرعات المحرك وتبديل مع مرور الوقت عن طريق حساب ω figure-protocol-3882 14.
  3. توظيف مرشح متوسطي لضمان سلاسة البيانات سرعة المحرك. ينصح نافذة تصفية أكثر من التناوب الكاملة 23،24.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يظهر الإعداد مضخم في الشكل 1A. ومن المهم أن هذه الفرق لديها حساسيات عالية على مجموعة من موجات متفرقة عن طريق حبات من الفائدة. هذه الفرق يعملون هنا تعمل في نطاقات المرئية والأشعة تحت الحمراء القريبة، وكانت قادرة على كشف الضوء المتناثرة التي ك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

من أجل تسهيل المربوطة حبة تتبع وتقدير الصحيح من المحركات عزم الدوران، يجب مراجعة المعلومات التالية. عند إجراء هذه القياسات مع خلايا سوطي، والقص هو خطوة حاسمة. قص يقلل من خيوط سوطي إلى مجرد كعب، وبالتالي ضمان أن يكون الحمل لزج على المحرك يرجع في الغالب إلى حبة ويمكن تق...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors acknowledge Howard Berg for the gift of the bead-tracking microscope/photomultipliers and the Texas A&M Engineering Experiment Station for funds.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Poly-L-lysine Solution (0.1%)Sigma-AldrichP8920http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
Polybead MicrospheresPolysciences, Inc.7307http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
1 mL Luer Slip Tip SyringeExel Int.26048http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gaugeBecton, Dickinson and Company427565http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
Polyethylene tubingHarvard Apparatus59-8325http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Photomultiplier TubesHamamatsuR7400U-20Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm,  0.78 ns response time 
http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 mm precision slitsEdmund OpticsNT39-9082 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes
OscilloscopeTektronixTBS 1032BAlternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts 
http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8 Pole LP/HP FilterKrohn-Hite3384Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended.   
http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot microscopeNikonNAAny upright or inverted phase microscope can be used.
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Cube BeamsplitterThorLabsBS013

References

  1. Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
  2. Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
  3. Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
  4. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
  5. McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
  6. Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
  7. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
  8. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  9. Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
  10. Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
  11. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  12. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
  13. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  14. Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
  15. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  16. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
  17. Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
  18. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  19. Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
  20. Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
  21. Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).
  22. Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
  23. Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
  24. Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
  25. Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
  26. Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

119 mechanosensing

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved