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要約

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

要約

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

概要

べん毛モーターは、らせん状の細胞外フィラメントを回転させることで泳ぐために細胞を可能にします。モーターは、鞭毛（ すなわち 、粘性負荷）の所定の長さのために生成することができるトルクの量は、遊泳速度を決定します。一方、回転方向を切り替える能力は、化学物質、走化性として知られるプロセスに応じて細胞移動を制御します。走化性及び運動性ある毒性が1-3因子 、鞭毛モーターは年4上で十分に特徴づけされています。証拠は今、モータがメカノとして作用することを示唆している-それは機械的に固体基板5,6の存在を検出します。この能力は、おそらく表面のコロニー形成および感染症5,7を誘発するのに役立ちます。その結果、モータが表面を検知し、シグナル伝達を開始させるメカニズムが有意8,9です。

べん毛モーターは容易にflagellを係留することによって研究することができますumの基板へとセルの回転を観察します。このようなテザリングは、最初の10の抗フック抗体を用いてガラス基板に大腸菌 、正常に取り付けられたフックにpolyhook変異体で働いていたシルバーとサイモン、によって達成されました。係留細胞アッセイは、化学的刺激の様々なモーター・スイッチの応答を研究する研究者を可能にしました。例えば、セガルおよび共同研究者は、化学的イオン導入ピペットを用いてテザー細胞を刺激しました。 CW バイアスの対応する変化（モータは、CWを時計回りに回す時間の割合）は、走化性ネットワーク11,12に適応の動態を測定するためにそれらを可能にしました。係留細胞アッセイは、スイッチの応答を研究する上で有効であったが、唯一の粘性負荷13の限られた範囲にわたって運動力学への洞察を提供することができました。この問題を克服するために、リュおよび共同研究者は、表面に付着した細胞上のフィラメントスタブに球状、ラテックスビーズを係留しました。ビーズがありましたその後、弱い光トラップ14で逆焦点干渉計を使用して追跡。異なるサイズのビーズと協力して、研究者は、負荷のより広い範囲に渡ってモーターを学ぶことができます。このアッセイは、後にレーザー暗視野照明と組み合わせた光電子増倍管ベースのビーズ追跡技術を開発した元とベルク、改善されました。彼らの方法は、外部の粘性抵抗が回転15,16の内部の粘性抵抗に比べて低かったこと（〜60 nm）のように小さなました係留金ナノビーズの追跡を可能にしました。これは、 大腸菌 （〜300ヘルツ）で達成可能な最大速度の測定値につながりました。 V.のalginolyticusでは、同様のビーズアッセイは、中間粘性負荷（〜700 Hz）で17で回転速度の測定を可能にしました。 （無負荷から近いストールに）粘性負荷の全体の可能な範囲での運動反応の測定を可能にすることにより、ビーズアッセイは、トンを理解するための重要な生物物理学的なツールを提供しました可トルク世代のプロセス18,19。

最近、我々は個々のモータ6に精密な機械的刺激を適用することができた光ピンセットを含むように元-Bergのアッセイを修正しました。それらは粘性負荷の変化に応じて改造 - この手法を用いて、モータの回転力発生器が動的mechanosensorsであることを示しました。メカニズムは不明のままであるが、このような負荷感知群がっ細菌への細胞の分化をトリガすることが可能です。直接的な証拠が不足しているものの、他の種におけるべん毛モーターは、また20機械受容していることもありそうです。ここでは、鞭毛フィラメント15につながラテックスビーズの回転を追跡するための光電子増倍管ベース（PMT）のアプローチを議論します。リアルタイムでかつ長期硬膜の上に単一のビーズを追跡することは比較的簡単であるため、超高速カメラで追跡と比較して、光電子増倍管、セットアップが有利です。ション。環境刺激21にべん毛モーター複合体で長時間の再構築を検討する場合に特に便利です。具体的には、大腸菌のための我々詳細プロトコルが、それらは、容易に他の種における鞭毛モーターを研究するために適合させることができます。

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プロトコル

1.細胞の調製

  1. 10mLの新鮮なTBで1：100希釈で接種続いトリプトンブロス（TB、1％ペプトン、0.5％のNaCl）にアレル15,22スティッキーFLICを運ぶ目的の株の一晩培養を成長させます。 OD 600 = 0.5になるまで振とうインキュベーター内で33℃で培養物を成長させます。
  2. 1,500×gで細胞をペレット5から7分と再分散ペレット積極的に濾過滅菌運動性バッファー10mL中（メガバイトを、10 mMリン酸バッファー：0.05から0.06 MのNaCl、10 -4 M EDTA、1μMメチオニン、 pHは7.0）。
  3. 繰り返しステップ1.2をさらに2回と1 mLのMBで最終ペレットを再分散させます。
  4. （ - 長さ12cm、0.58ミリメートル、内径7）ポリエチレン管で接続された21〜23ゲージアダプタで2つのシリンジの間で前後〜75回通過させることにより、懸濁液を剪断。 45秒 - 30にせん断の合計時間を制限します。
  5. 5-7分間1500×gで剪断した細胞を遠心分離し、再分散MBの500μL - 100でペレット。

2.スライドの準備

  1. カバースリップと顕微鏡スライドとの間に2つの両面テープを挟んで撮像チャンバーを準備します。走化性アッセイのために、MBおよび化学的刺激剤の交換を可能にする任意のマイクロ流体チャンバーを採用。
  2. チャンバー内に0.01％ポリ-L-リジンのソリューションを追加し、5分後に静かにMBで表面を洗い流し（80から100μL）。
  3. チャンバー内に細胞懸濁液40μLを追加し、ガラス面への取り付けのための十分な時間を許可（7から8分）。反対側から濾紙で溶液をウィッキングながら、チャンバの一方の側に100μLMBを追加することによって、剥がれた細胞を流出します。
  4. チャンバー内にラテックスビーズの15μL、ビーズに落ち着くと細胞に付着するのに十分な時間を許可 - 10を追加します（7から8分）。静かにバラバラビーズを除去するために、ステップ2.3で説明したように、MBの100μLですすいでください。ビーズ-SIの範囲を使用します良好なコントラストが利用可能である限り、実験のためのZES。

3.ビーズの追跡

  1. 顕微鏡ステージ上にサンプルを置き、モータに取り付けられたビーズのための表面をスキャンします。位相差顕微鏡が必要ではないが観測を行うために40X位相目標を使用します。また、あまりにも長い間、十分なコントラストがはっきりと暗い背景に明るいビーズを区別するために維持されているように明視野イメージングを採用しています。
  2. ビーズが選択されると、 図1Bに示すように、予め定められた隅にビードを配置するために横方向にステージを移動させます。同コーナーで位置ビーズは、ビーズの回転方向が正しく知られていることを確認します。理想的なビーズの軌道はほぼ円形であるが、楕円形の軌道が許容されています。
  3. エイリアシングに関連するエラーを回避するために、モータの二倍回転周波数よりも高いサンプリング周波数を維持します。本研究では、で回転されたモーターを使用10倍（500 Hz）であった周波数で50Hzのサンプルは、滑らかな信号を得ることができます。

4.データ解析

  1. 23を必要に応じて、センターでは、アフィン変換と軌道におけるPMTの出力電圧と、正しい楕円率をスケールと。回転速度17を決定するために、パワースペクトル解析を使用してください。
  2. 極角、θ（トン）= ATAN（Y（t）を/ x（t）を）決定します。モータ速度の変化を決定し、ωを算出することにより、時間を切り替えますfigure-protocol-1854 14。
  3. モータ速度データを平滑化するためにメディアンフィルタを用います。 2回転以上のフィルタウィンドウは23,24を推奨します。

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結果

光電子増倍管のセットアップは図1Aに示されています。光電子増倍管は、関心のビーズによって散乱波長範囲にわたって高い感度を有することが重要です。ここで用いられる光電子増倍管は、可視及び近赤外範囲で動作し、ハロゲン光源によって照明ビードによって散乱された光を検出することができました。最適な照明条件や電源電圧が1セットアップ?...

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ディスカッション

係留ビーズの追跡とモータトルクの正確な推定を容易にするために、以下の情報を見直すべきです。鞭毛細胞でこれらの測定を行う場合、剪断は重要なステップです。シャーリングにより、モータ上の粘性負荷が主にビーズによるものであり、10％の誤差16内に推定することができることを確認して、単なるスタブにべん毛フィラメントを低減します。シャーリングもしっかりと分散?...

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開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

The authors acknowledge Howard Berg for the gift of the bead-tracking microscope/photomultipliers and the Texas A&M Engineering Experiment Station for funds.

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Poly-L-lysine Solution (0.1%)Sigma-AldrichP8920http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
Polybead MicrospheresPolysciences, Inc.7307http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
1 mL Luer Slip Tip SyringeExel Int.26048http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gaugeBecton, Dickinson and Company427565http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
Polyethylene tubingHarvard Apparatus59-8325http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Photomultiplier TubesHamamatsuR7400U-20Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm,  0.78 ns response time 
http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 mm precision slitsEdmund OpticsNT39-9082 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes
OscilloscopeTektronixTBS 1032BAlternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts 
http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8 Pole LP/HP FilterKrohn-Hite3384Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended.   
http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot microscopeNikonNAAny upright or inverted phase microscope can be used.
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Cube BeamsplitterThorLabsBS013

参考文献

  1. Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
  2. Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
  3. Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
  4. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
  5. McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
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  7. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
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  11. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  12. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
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  14. Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
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  23. Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
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  25. Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
  26. Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).

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