Caracterização biofísica das funções Flagellar motor

Resumo

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Resumo

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Introdução

motores flagelares permitir que as células para nadar girando filamentos extracelulares helicoidais. A quantidade de torque do motor pode gerar para um dado comprimento do flagelo (isto é, a carga viscosa) determina as velocidades de natação. Por outro lado, a sua capacidade de mudar o sentido de rotação controla a migração celular em resposta a produtos químicos, um processo conhecido como quimiotaxia. Quimiotaxia e motilidade sendo fatores de virulência ^1-3, motores flagelares foram bem caracterizado ao longo dos anos ^4. Evidências crescentes agora sugere que o motor actua como um mechanosensor - lo mecanicamente detecta a presença de substratos sólidos ^5,6. Esta capacidade provável ajuda no desencadeamento de colonização superfície e infecções ^5,7. Como resultado, os mecanismos pelos quais o motor sentidos superfícies e iniciados de sinalização são de importância ^8,9.

O motor flagelar pode ser facilmente estudado por amarrar o flagellhum a um substrato e observando a rotação celular. Esta operação foi primeiramente alcançada por Silverman e Simon, que trabalhou com um mutante polyhook em E. coli e ganchos ligados com sucesso para substratos de vidro com anticorpos anti-gancho ^10. O ensaio de célula tethered permitiu aos investigadores a estudar as respostas de o interruptor do motor a uma variedade de estímulos químicos. Por exemplo, Segall e co-trabalhadores quimicamente estimulado células conectada com o auxílio de pipetas iontoforéticos. As alterações correspondentes no _viés CW (a fração dos motores tempo de rotação no sentido horário, CW) lhes permitiu medir a cinética de adaptação na rede quimiotaxia ^11,12. Enquanto o ensaio de células tethered foi eficaz em estudar respostas de switch, ele só foi capaz de oferecer insights sobre a mecânica do motor através de uma gama limitada de cargas viscosos ^13. Para ultrapassar este problema, Ryu e colaboradores tethered esféricas, esferas de látex de filamento topos sobre as células presas às superfícies. Os grânulos eramentão rastreados usando interferometria de back-focal com fracos armadilhas ópticas ^14. Ao trabalhar com contas de diferentes tamanhos, os pesquisadores poderiam estudar o motor ao longo de uma gama muito maior de cargas. Este ensaio foi posteriormente melhorado por Yuan e Berg, que desenvolveu uma técnica de talão-de rastreamento baseado photomultiplier combinada com iluminação a laser de campo escuro. Seu método de rastreamento habilitado de nanobeads tethered de ouro que foram tão pequena (~ 60 nm) que as resistências viscosos externos foram menores em comparação com as resistências viscosos internos para rotação ^15,16. Isto conduziu às medições das velocidades máxima alcançável em E. coli (~ 300 Hz). Em V. alginolyticus, ensaios talão semelhantes permitiu medições das taxas de fiação em cargas intermédias viscosos (~ 700 Hz) ^17. Ao permitir que as medições de respostas motoras ao longo de toda a gama possível de cargas viscoso (a partir de zero a carga de quase-box), os ensaios de Bead-forneceu uma ferramenta importante para compreender a biofísica tprocesso orque geração ^18,19.

Recentemente, nós modificamos o ensaio Yuan-Berg para incluir pinças ópticas que nos permitiram aplicar estímulos mecânicos precisos para motores individuais ^6. Usando esta técnica, nós mostramos que a força-geradores que giram o motor são mechanosensors dinâmicos - eles remodelar em resposta às mudanças nas cargas viscosos. É possível que tal sensor de carga provoca a diferenciação de células em bactérias enxame, embora os mecanismos permanecem obscuros. Também é provável que os motores flagelares em outras espécies também são mechanosensitive ^20, apesar de evidência directa que falta. Aqui, discutimos a abordagem baseada em fotomultiplicador (PMT) para acompanhar a rotação de esferas de látex amarrados a filamentos de flagelar ^15. Em comparação com o acompanhamento com câmeras ultra-rápidos, o fotomultiplicador-setup é vantajoso porque é relativamente simples para rastrear esferas individuais em tempo real e mais longa durações. É particularmente útil quando se estuda a longo tempo remodelação em complexos motor flagelar devido a estímulos do meio ambiente ^21. Embora nós detalhe protocolos específicos para E. coli, que pode ser facilmente adaptado para estudar motores flagelares em outras espécies.

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Protocolo

1. Preparação de células

1. Crescer culturas de uma noite da estirpe desejada carregando a fliC pegajoso alelo ^15,22 em Caldo de triptona (TB, 1% de peptona, 0,5% de NaCl), seguida de inoculação a diluição 1: 100 em 10 mL de TB fresco. Crescer a cultura a 33 ° C numa incubadora agitadora até _DO600 = 0,5.
2. Agregar as células a 1500 xg durante 5-7 minutos e re-dispersar vigorosamente o sedimento em 10 mL de tampão de filtro esterilizado motilidade (MB; 10 mM de tampão de fosfato: 0,05-0,06 M de NaCl, 10 ^-4 M de EDTA, 1 | iM de metionina, pH 7,0).
3. Repita o passo 1.2 mais duas vezes e re-dispersar o sedimento final em 1 ml MB.
4. Cisalhamento da suspensão, passando para trás e para a frente ~ 75 vezes entre duas seringas com 21 a 23 adaptadores calibre ligados por tubos de polietileno (7 - 12 cm de comprimento, diâmetro 0,58 mm interno). Limitar o tempo total para corte de 30 - 45 s.
5. Centrifugar as células cortadas a 1.500 g durante 5-7 minutos e voltar a dispersar apelete em 100 - 500 mL de MB.

2. Deslize Preparação

1. Preparar uma câmara de imagem imprensando duas fitas adesivas de dupla face entre um cover-derrapante e uma lâmina de microscópio. Para ensaios de quimiotaxia, empregar qualquer câmara de microfluidos que permite a troca de MB e estimulantes químicos.
2. Adicionar solução de 0,01% de poli-L-lisina na câmara e depois de 5 min lave as superfícies com MB (80-100 mL).
3. Adicionar 40 ul de suspensão de células para dentro da câmara e permitir tempo suficiente para a ligação à superfície do vidro (7-8 min). Fluxo de Saída células unstuck pela adição de 100 uL MB de um lado da câmara, enquanto wicking a solução com um papel de filtro a partir do outro lado.
4. Adicionam-se 10 - 15? L de esferas de látex para dentro da câmara e permitir que as esferas de tempo suficiente para se estabelecer e anexar as células (7-8 min). Lave com 100 ul de MB, tal como descrito na etapa 2.3, para remover descolar grânulos. Use uma gama de talão-sizes para as experiências tanto tempo como um bom contraste está disponível.

3. Acompanhamento Bead

1. Colocar a amostra em um estágio do microscópio e digitalizar a superfície para grânulos ligados a motores. Utilize uma objectiva de 40x fase para fazer observações, embora microscopia de fase não é necessário. Alternativamente, empregam imagem de campo brilhante, desde que contraste suficiente é mantida a distinguir claramente um grânulo brilhante sobre um fundo escuro.
2. Uma vez que um grânulo tenha sido seleccionado, mover a fase lateralmente para posicionar o grânulo em um canto pré-determinado, como mostrado na Figura 1B. grânulos posição na mesma curva para garantir que o sentido de rotação do grânulo é correctamente conhecido. A trajetória talão ideal é aproximadamente circular, mas trajetórias elípticas são admissíveis.
3. Manter a frequência de amostragem mais elevada do que duas vezes a frequência de rotação do motor para evitar erros associados com serrilhado. Neste trabalho, utilizar um motor que foi rotativo a50 Hz e a amostra a frequências que eram 10 vezes mais elevada (500 Hz), para obter um sinal bom.

Análise 4. Dados

1. Centro e escalar as tensões de saída PMT e elipticidade correta nas trajetórias com transformações afins, se necessário ^23. Use uma análise de poder de espectro para determinar as taxas de rotação ^17.
2. Determinar ângulos polares, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Determinar as variações de velocidades do motor e mudar ao longo do tempo por meio do cálculo ω ^14.
3. Empregar um filtro de mediana para alisar os dados de velocidade do motor. Uma janela de filtro de mais de duas rotações completas é recomendado ^23,24.

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Resultados

A configuração do fotomultiplicador é mostrado na Figura 1A. É importante que os PMTs ter alta sensibilidade ao longo do intervalo de comprimentos de onda dispersa pelas esferas de interesse. Os PMTs empregadas aqui operam nas faixas visíveis e do infravermelho próximo, e foram capazes de detectar a luz dispersa pelas esferas iluminadas por uma fonte de luz halógena. As condições de iluminação ideais e tensões de alimentação irá variar de uma instalação ...

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Discussão

A fim de facilitar tethered talão de rastreamento e estimativa correcta do motor-torques, as seguintes informações devem ser revistos. Ao realizar essas medições com células flageladas, corte é um passo crítico. Cisalhamento reduz o filamento flagelar a um mero topo, assegurando desse modo que a carga no motor viscoso é predominantemente devido ao cordão e pode ser estimado dentro de erro de 10% ^16. Shearing também melhora as chances de encontrar trajetórias circulares com excentricidades bem dist...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-lysine Solution (0.1%)	Sigma-Aldrich	P8920	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	7307	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
1 mL Luer Slip Tip Syringe	Exel Int.	26048	http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge	Becton, Dickinson and Company	427565	http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	59-8325	http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Photomultiplier Tubes	Hamamatsu	R7400U-20	Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm,  0.78 ns response time  http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 mm precision slits	Edmund Optics	NT39-908	2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes
Oscilloscope	Tektronix	TBS 1032B	Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts  http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8 Pole LP/HP Filter	Krohn-Hite	3384	Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended.    http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot microscope	Nikon	NA	Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Cube Beamsplitter	ThorLabs	BS013