Biophysikalische Charakterisierung von Flagellenmotors Funktionen

Zusammenfassung

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Zusammenfassung

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Einleitung

Flagellenmotoren ermöglichen Zellen durch Drehen Schraubenextrazellulären Filamente zu schwimmen. Der Betrag des Drehmoments des Motors für eine gegebene Länge des Flagellums erzeugen kann (dh die viskose Last) bestimmt die Schwimmgeschwindigkeit. Auf der anderen Seite, seine Fähigkeit, die Drehrichtung steuert, die Zellmigration in Reaktion auf Chemikalien, ein Verfahren bekannt, wie Chemotaxis zu wechseln. Chemotaxis und Beweglichkeit sind Virulenzfaktoren ^1-3, Flagellenmotoren wurden ⁴ über die Jahre gut charakterisierte. Montage Hinweise darauf , nun , dass der Motor als Mechanosensor wirkt - es erkennt , mechanisch das Vorhandensein von festen Substraten ^5,6. Diese Fähigkeit hilft wahrscheinlich bei der Auslösung von Oberflächenbesiedlung und Infektionen ^5,7. Als Ergebnis, wobei die Mechanismen die Motoroberflächen und initiiert Signalisierungs Sinne sind von Bedeutung ^8,9.

Der Flagellenmotors kann leicht durch Anbinden der flagell untersucht werdenum auf ein Substrat und das Beobachten Zellrotation. Solche Anbinden wurde zuerst von Silverman und Simon erreicht, der mit einer polyhook Mutante in E. coli und erfolgreich befestigt Haken auf Glassubstrate mit anti-hook Antikörper ¹⁰ gearbeitet. Die tethered-Zell-Assay Forschern ermöglicht, die Antworten des Motorschalter in einer Vielzahl von chemischen Stimuli zu studieren. Zum Beispiel Segall et al chemisch gebundenen Zellen mit Hilfe von iontophoretischen Pipetten stimuliert. Die entsprechenden Änderungen in CW _bias (der Bruchteil der Zeit Motoren drehen im Uhrzeigersinn CW) ermöglichte es ihnen ^11,12 die Kinetik der Anpassung in der Chemotaxis - Netzwerk zu messen. Während die tethered - Zell - Assay in Studium Schalter Reaktionen wirksam war, war es nur in der Lage Einblicke in Motormechanik ¹³ über einen begrenzten Bereich von viskosen Belastungen zu bieten. Um dieses Problem zu überwinden, Ryu et al gebunden sphärisch, Latexperlen stubs auf Zellen an Oberflächen geklebt Filaments. Die Perlen wurdendann zurückverfolgt Brenn Interferometrie mit schwachen optischen Fallen ¹⁴ verwendet wird . Durch die Arbeit mit Perlen unterschiedlicher Größe, könnten Forscher untersuchen den Motor über eine viel breitere Palette von Lasten. Dieser Assay wurde später verbessert durch Yuan und Berg, der einen Photovervielfacher-basierte bead-Verfolgungstechnik mit Laser-Dunkelfeldbeleuchtung in Kombination entwickelt. Ihre Methode ermöglicht Verfolgung von tethered Gold Nanobeads , die so klein waren (~ 60 nm) , dass die externen viskoser Widerstände waren niedriger im Vergleich zu den inneren viskosen Widerstände gegen Rotation ^15,16. Dies führte zu den Messungen der maximal erreichbaren Geschwindigkeiten in E. coli (~ 300 Hz). In V. alginolyticus, ähnlich Perle Assays Messungen der Spinngeschwindigkeiten bei Zwischen viskos Lasten (~ 700 Hz) ¹⁷ aktiviert. Durch die Aktivierung Messungen der motorischen Reaktionen über den gesamten möglichen Bereich von viskosen Lasten (von Null-Last bis nahen Stall), vorausgesetzt, die Wulst-Assays ein wichtiges Werkzeug, um die biophysikalischen t zu verstehen,orque-Erzeugungsprozess ^18,19.

Vor kurzem geändert wir den Yuan-Berg - Test optische Pinzette aufzunehmen , die uns präzise mechanische Reize auf einzelne Motoren ⁶ anwenden aktiviert. Unter Verwendung dieser Technik haben wir gezeigt, daß die Kraftgeneratoren, die den Motor dynamisch sind Mechanosensoren drehen - sie remodellieren in Reaktion auf Änderungen in viskoser Lasten. Es ist möglich, dass solche Load-Sensing-Zelldifferenzierung in Schwärmen Bakterien ausgelöst wird, obwohl die Mechanismen unklar bleiben. Sie ist auch wahrscheinlich , dass die Flagellenmotoren in anderen Spezies sind auch mechanosensitive ^20, direkte Beweise fehlen. Hier diskutieren wir die Photomultiplier-basierte (PMT) Ansatz zur Verfolgung der Rotation von Latex - Kügelchen gebunden an Flagellen Fäden ^15. Im Vergleich mit ultraschnellen Kameras Verfolgung der Photomultiplier-Aufbau ist vorteilhaft, da es relativ einfach ist, einzelne Perlen in Echtzeit und über lange dura zu verfolgengen. Es ist besonders nützlich , wenn ²¹ Umbau in Flagellenmotors Komplexe durch Umweltreize seit langer Zeit zu studieren. Obwohl wir Detail Protokolle speziell für E. coli, können sie leicht für das Studium Flagellenmotoren in anderen Arten angepasst werden.

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Protokoll

1. Zellpräparation

1. Wachsen über Nacht Kulturen der gewünschten Stamm der klebrigen fliC Allel ^15,22 in Trypton - Bouillon tragen (TB, 1% Pepton, 0,5% NaCl) , gefolgt von der Inokulation bei 1: 100 Verdünnung in 10 ml frischem TB. Die Kultur bei 33 ° C in einem Schüttelinkubator bis OD ₆₀₀ = 0,5.
2. Pelletieren Sie die Zellen bei 1.500 xg für 5 bis 7 min und re-dispergieren das Pellet kräftig in 10 ml filtersterilisiert Motilität Puffer (MB; 10 mM Phosphatpuffer: 0,05-0,06 M NaCl, 10 ^-4 M EDTA, 1 & mgr; M Methionin, pH 7,0).
3. Wiederholen Sie Schritt 1.2 zwei weitere Male und das endgültige Pellet in 1 ml MB wieder zu dispergieren.
4. Scher die Suspension durch durch Polyethylenschlauch verbunden mit 21 bis 23 Manometeradaptern hin und her ~ 75 mal zwischen zwei Spritzen vorbei (7 bis 12 cm lang, 0,58 mm Innendurchmesser). Begrenzen Sie die Gesamtzeit für die auf 30 Scheren - 45 s.
5. Zentrifugieren Sie die geschert Zellen bei 1.500 × g für 5-7 Minuten und wieder zu dispergieren diePellet in 100-500 ul MB.

2. Schieben Vorbereitung

1. Bereiten Sie eine Imaging-Kammer durch zwei doppelseitige Klebebänder zwischen einem Deckglas zwischen sich und einem Objektträger. Für die Chemotaxis-Assays einsetzen jede mikrofluidischen Kammer, die den Austausch von MB und chemischen Stimulanzien ermöglicht.
2. 0.01% Poly-L-Lysin-Lösung in der Kammer und nach 5 min sanft spülen Sie die Oberflächen mit MB (80 - 100 ul).
3. Werden 40 & mgr; l der Zellsuspension in die Kammer und damit ausreichend Zeit für die Befestigung an der Glasoberfläche (7 - 8 min). Ausfließen unstuck Zellen durch Zugabe von 100 & mgr; l MB auf einer Seite der Kammer, während die Lösung mit einem Filterpapier von der anderen Seite wicking.
4. In 10 bis 15 & mgr; l von Latexkügelchen in die Kammer und damit die angemessene Zeit Perlen absetzen und zu den Zellen befestigen (7 - 8 min). Spülen Sie vorsichtig mit 100 & mgr; l MB, wie 2.3 in Schritt beschrieben, Perlen zu entfernen unstuck. Verwenden Sie eine Reihe von Perle-sizes für die Experimente so lange, wie ein guter Kontrast zur Verfügung steht.

3. Bead-Tracking

1. Legen Sie die Probe auf einem Mikroskoptisch und scannen die Oberfläche für die Perlen an Motoren angebracht. Verwenden Sie ein 40X Phase Ziel Beobachtungen zu machen, obwohl Phasenmikroskopie nicht notwendig ist. Alternativ verwenden Hellfeld-Bildgebung, solange ein ausreichender Kontrast aufrechterhalten wird, um deutlich eine helle Perle auf einem dunklen Hintergrund zu unterscheiden.
2. Sobald ein Wulst ausgewählt wurde, bewegen die Bühne seitlich den Wulst in einem vorbestimmten Winkel zu positionieren , wie in 1B gezeigt. Position beads an derselben Ecke zu gewährleisten, dass die Drehrichtung des Wulstes richtig bekannt ist. Die ideale Perle Bahn ist etwa kreisförmig, sondern elliptisch Bahnen sind zulässig.
3. Pflegen die Abtastfrequenz höher ist als das Doppelte der Drehfrequenz des Motors Fehler mit aliasing zugeordnet zu vermeiden. In dieser Arbeit, einen Motor verwenden, der rotierte bei50 Hz und Probe bei Frequenzen, die 10-mal höher (500 Hz) sind, ein glattes Signal zu erhalten.

4. Datenanalyse

1. Center und die PMT - Ausgangsspannungen und korrekte Elliptizität in den Trajektorien mit Affintransformationen skaliert , wenn ²³ benötigt. Verwenden Sie ein Power-Spektrum - Analyse Drehraten ¹⁷ zu bestimmen.
2. Bestimmen Polarwinkel, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Bestimmung der Schwankungen der Motordrehzahlen und Schalt über die Zeit durch ω Berechnungs ^14.
3. Verwenden einen Medianfilter die Motordrehzahldaten zu glätten. Ein Filterfenster über zwei volle Umdrehungen wird ^23,24 empfohlen.

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Ergebnisse

Der Photomultiplier Aufbau ist in 1A gezeigt. Es ist wichtig, dass die PMT von den Kügelchen von Interesse verstreut hohe Empfindlichkeiten über den Bereich von Wellenlängen aufweisen. Die PMT hier beschäftigt arbeiten im sichtbaren und im nahen Infrarot-Bereich, und waren in der Lage Licht von Perlen mit einem Halogenlichtquelle beleuchtet verstreut zu erkennen. Die optimale Lichtverhältnisse und Versorgungsspannungen werden von einer Einrichtung zur anderen variie...

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Diskussion

Um tethered Wulst-Tracking und korrekte Schätzung der Motor-Drehmomente zu erleichtern, sollten die folgenden Informationen überprüft werden. Wenn diese Messungen mit flagellated Zellen durchgeführt wird, Scherung ist ein kritischer Schritt. Shearing reduziert die Flagellenfilamenten auf eine bloße stub, wodurch sichergestellt wird, dass die viskose Last auf dem Motor zu dem Wulst überwiegend aus und kann innerhalb von 10% Fehler ¹⁶ geschätzt werden. Shearing verbessert auch die Chancen mit dicht verte...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-lysine Solution (0.1%)	Sigma-Aldrich	P8920	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	7307	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
1 mL Luer Slip Tip Syringe	Exel Int.	26048	http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge	Becton, Dickinson and Company	427565	http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	59-8325	http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Photomultiplier Tubes	Hamamatsu	R7400U-20	Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm,  0.78 ns response time  http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 mm precision slits	Edmund Optics	NT39-908	2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes
Oscilloscope	Tektronix	TBS 1032B	Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts  http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8 Pole LP/HP Filter	Krohn-Hite	3384	Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended.    http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot microscope	Nikon	NA	Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Cube Beamsplitter	ThorLabs	BS013