Caracterización biofísica de las funciones de motor flagelar

Resumen

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Resumen

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Introducción

motores flagelares permiten a las células a nadar girando filamentos helicoidales extracelulares. La cantidad de par de torsión que el motor puede generar para una longitud dada del flagelo (es decir, la carga viscosa) determina las velocidades de natación. Por otro lado, su capacidad para cambiar el sentido de giro controla la migración de células en respuesta a productos químicos, un proceso conocido como la quimiotaxis. La quimiotaxis y la motilidad ser factores de virulencia ^1-3, motores flagelares han sido bien caracterizado en los años ^4. La evidencia creciente sugiere ahora que el motor actúa como un MechanoSensor - detecta mecánicamente la presencia de sustratos sólidos ^5,6. Esta capacidad ayuda a probable en el desencadenamiento de la colonización de la superficie y las infecciones de ^5,7. Como resultado, los mecanismos por los que el motor sentidos superficies e iniciados de señalización son de importancia ^8,9.

El motor flagelar se puede estudiar fácilmente por la inmovilización del flagellum a un sustrato y la observación de la rotación de la célula. Dicha inmovilización se logró por primera vez por Silverman y Simon, que trabajó con un mutante polyhook en E. coli y ganchos conectados correctamente a sustratos de vidrio con anticuerpos anti-gancho ^10. El ensayo de células tethered permitió a los investigadores estudiar las respuestas del motor-switch a una variedad de estímulos químicos. Por ejemplo, Segall y compañeros de trabajo estimularon células químicamente atados con la ayuda de pipetas iontoforéticos. Los cambios correspondientes en _{el sesgo de} CW (la fracción de los motores giran las manecillas del reloj de tiempo, CW) les permitió medir la cinética de la adaptación en la red quimiotaxis ^11,12. Si bien el ensayo de células tethered fue eficaz en el estudio de las respuestas de conmutación, sólo fue capaz de ofrecer una visión de la mecánica de motor en un intervalo limitado de cargas viscosos ^13. Para superar este problema, Ryu y compañeros de trabajo conectado al ordenador, perlas de látex esféricas al filamento talones en las células pegadas a las superficies. Las perlas sea continuación, seguido utilizando interferometría de back-focal con trampas ópticas débiles ^14. Al trabajar con los granos de diferentes tamaños, los investigadores pudieron estudiar el motor a través de una gama mucho más amplia de cargas. Este ensayo fue mejorada por Yuan y Berg, quien desarrolló una técnica de talones de seguimiento basado en fotomultiplicador combinado con iluminación láser de campo oscuro. Su método de seguimiento habilitado de nanobeads atados de oro que eran tan pequeña (~ 60 nm) que las resistencias externas viscosos eran más bajos en comparación con las resistencias internas viscosos a la rotación ^15,16. Esto dio lugar a las mediciones de las velocidades máximas alcanzables en E. coli (~ 300 Hz). En V. Alginolyticus, ensayos de cuentas habilitadas similares mediciones de las velocidades de giro en cargas intermedias viscosos (~ 700 Hz) ^17. Al permitir que las mediciones de las respuestas motoras sobre toda la gama posible de cargas viscosas (de carga cero a casi parada), el cordón-ensayos proporcionados en una importante herramienta de biofísico para entender la torque proceso de generación ^18,19.

Recientemente, hemos modificado el ensayo de Yuan-Berg incluir pinzas ópticas que nos permitieron aplicar estímulos mecánicos precisos para motores individuales ^6. Usando esta técnica, hemos demostrado que la fuerza de los generadores que giran el motor son mechanosensors dinámicos - se remodelan en respuesta a los cambios en las cargas viscosas. Es posible que tal de detección de carga provoca la diferenciación celular en bacterias que pululan, aunque los mecanismos no están claros. También es probable que los motores flagelares en otras especies también son mechanosensitive ^20, aunque se carece de evidencia directa. A continuación, se discute el enfoque basado en el fotomultiplicador (PMT) para el seguimiento de la rotación de cuentas de látex atados a los filamentos flagelares ^15. En comparación con el seguimiento con cámaras ultrarrápidos, el fotomultiplicador-configuración es ventajosa debido a que es relativamente sencillo para realizar el seguimiento perlas individuales en tiempo real y más largo duraciones. Es particularmente útil en el estudio de la remodelación a largo tiempo en los complejos de motor flagelar debido a los estímulos del medio ambiente ^21. A pesar de que los protocolos de detalle específicamente para E. coli, que pueden adaptarse fácilmente para el estudio de motores flagelares en otras especies.

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Protocolo

1. Preparación de la célula

1. Crecer cultivos de una noche de la cepa deseada que lleva el alelo pegajosa fliC ^15,22 en triptona Broth (TB, 1% de peptona, 0,5% de NaCl), seguido de la inoculación a 1: 100 dilución en 10 ml de TB fresco. Mantener el cultivo a 33 ° C en un incubador con agitación hasta _{una DO600} = 0,5.
2. Sedimentar las células a 1500 x g durante 5-7 min y re-dispersar el sedimento vigorosamente en 10 ml de tampón de motilidad filtro esterilizado (MB; tampón fosfato 10 mM: NaCl 0,05 a 0,06 M, 10 ^-4 M EDTA, 1 mM de metionina, pH 7,0).
3. Repita el paso 1.2 dos veces más y volver a dispersar el sedimento final en 1 ml MB.
4. Cizallar la suspensión mediante el paso de ida y vuelta ~ 75 veces entre dos jeringas con 21 a 23 adaptadores de calibre conectados por un tubo de polietileno (7 - 12 cm de largo, 0,58 mm de diámetro interno). Limitar el tiempo total para cizallar a 30 - 45 s.
5. Centrifugar las células cortadas a 1.500 xg durante 5-7 minutos y volver a dispersar elprecipitado en 100 - 500 l de MB.

2. Preparación de los portaobjetos

1. Preparar una cámara de imágenes intercalando dos cintas adhesivas de doble cara entre un cubre y un portaobjetos de microscopio. Para los ensayos de quimiotaxis, emplear cualquier cámara de microfluidos que permite el intercambio de MB y estimulantes químicos.
2. Añadir 0,01% de solución de poli-L-lisina en la cámara y después de 5 min enjuagar suavemente las superficies con MB (80 - 100 L).
3. Añadir 40 l de la suspensión celular en la cámara y permitir el tiempo suficiente para la unión a la superficie de vidrio (7-8 min). Flujo de salida células unstuck mediante la adición de 100 l MB en un lado de la cámara, mientras que absorbe la solución con un papel de filtro desde el otro lado.
4. Añadir 10 - 15 l de perlas de látex en la cámara y permitir que las perlas de tiempo adecuado para asentarse y unirse a las células (7 - 8 min). Enjuague suavemente con 100 l de MB, tal como se describe en el paso 2.3, para eliminar los granos despegarse. Use una variedad de grano-sizes para los experimentos tan largos como un buen contraste está disponible.

3. Seguimiento del grano

1. Coloque la muestra en una platina del microscopio y escanear la superficie de los granos unidos a motores. Utilice un objetivo de 40X fase para hacer observaciones a pesar de la microscopía de fase no es necesario. Alternativamente, emplear imágenes de campo brillante, siempre que suficiente contraste se mantiene distinguir claramente un cordón brillante sobre un fondo oscuro.
2. Una vez que una perla ha sido seleccionado, mover la etapa de posicionar lateralmente el cordón en una esquina predeterminado como se muestra en la Figura 1B. perlas de posición en la misma esquina para asegurar que la dirección de rotación de la perla se conoce correctamente. La trayectoria del grano ideal es aproximadamente circular, pero las trayectorias elípticas son admisibles.
3. Mantener la frecuencia de muestreo superior al doble de la frecuencia de rotación del motor para evitar los errores asociados con aliasing. En este trabajo, utilizar un motor que estaba girando a50 Hz y la muestra en las frecuencias que eran 10 veces más alta (500 Hz), para obtener una señal lisa.

Análisis 4. Datos

1. Centro y escalar las tensiones de salida del PMT y elipticidad correcta en las trayectorias con transformaciones afines si es necesario ^23. Use un análisis de espectro de potencia para determinar las tasas de rotación ^17.
2. Determinar ángulos polares, θ (t) = atan (Y (t) / x (t)). Determinar las variaciones en las velocidades del motor y el cambio en el tiempo mediante el cálculo de ω ^14.
3. Emplear un filtro de mediana para suavizar los datos de velocidad del motor. Una ventana de filtro más de dos rotaciones completas se recomienda ^23,24.

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Resultados

La configuración fotomultiplicador se muestra en la Figura 1A. Es importante que los PMT tienen altas sensibilidades más de la gama de longitudes de onda dispersas por las perlas de interés. Los EGP empleadas aquí operan en los rangos visible e infrarrojo cercano, y fueron capaces de detectar la luz dispersada por bolas iluminadas por una fuente de luz halógena. Las condiciones de iluminación óptimas y tensiones de alimentación varían de una configuración a otr...

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Discusión

Con el fin de facilitar el atado de talones de seguimiento y correcta estimación de los pares de motor, la siguiente información debe ser revisada. Al realizar estas mediciones con células flageladas, esquila es un paso crítico. Shearing reduce el filamento flagelar a un simple trozo, garantizando de este modo que la carga viscosa en el motor se debe principalmente a la perla y se puede estimar dentro del 10% de error ^16. Shearing también mejora las posibilidades de encontrar trayectorias circulares con ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-lysine Solution (0.1%)	Sigma-Aldrich	P8920	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	7307	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
1 mL Luer Slip Tip Syringe	Exel Int.	26048	http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge	Becton, Dickinson and Company	427565	http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	59-8325	http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Photomultiplier Tubes	Hamamatsu	R7400U-20	Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm,  0.78 ns response time  http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 mm precision slits	Edmund Optics	NT39-908	2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes
Oscilloscope	Tektronix	TBS 1032B	Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts  http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8 Pole LP/HP Filter	Krohn-Hite	3384	Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended.    http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot microscope	Nikon	NA	Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Cube Beamsplitter	ThorLabs	BS013