편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성

요약

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

초록

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

서문

편모 모터는 나선형 외 필라멘트를 회전하여 수영을 셀 수 있습니다. 모터가 편모 (즉, 점성 부하)의 소정 기간 동안 생성 할 수있는 토크의 양이 수영 속도를 결정한다. 한편, 회전 방향을 전환 할 수있는 능력은 화학 약품, 화학 주성으로 공지 된 과정에 응답하여 세포 이동을 제어한다. 화성과 운동성되는 독성은 ^1-3, 편모 모터는 년 ^4로 잘 특성화 된 요인. 증거 확보 해주기 모터가 mechanosensor 역할을 제안 - 그것은 기계적 고체 기판 ^-5,6-의 존재를 검출한다. 이 기능은 가능성이 표면 식민지 및 감염 ^{5,7 트리거링에} 도움이됩니다. 결과적으로, 모터의 표면과 동수 신호를 감지하여 그에 메커니즘의 중요성 ^8,9이다.

편모 모터는 쉽게 flagell를 테 더링으로 공부하실 수 있습니다UM 기판에 세포 회전을 관찰. 이러한 테 더링이 먼저 안티 - 후크 항체 ^(10)와 유리 기판에 polyhook의 대장균에서 돌연변이 성공적으로 연결된 후크와 협력 실버 사이먼에 의해 달성되었다. 속박 세포 분석은 화학 자극의 다양한 모터 스위치의 반응을 연구 연구 할 수 있었다. 예를 들어, Segall와 동료들은 화학적으로 이온 영동 피펫의 도움으로 닿는 세포를 자극. CW _{바이어스에} 해당 변경 화성 네트워크 ^{(11, 12)에서} 적응의 반응 속도를 측정하기 위해 그들을 사용 (시간 모터의 비율은 CW, 시계 방향으로 회전). 닿는 세포 분석은 스위치 응답을 공부에 효과적이지만, 단지 점성로드 ^(13)의 제한된 범위에서 모터 역학에 대한 통찰력을 제공 할 수 있었다. 이 문제를 극복하기 위해 류와 동료들은 표면에 붙어있는 세포 스텁 필라멘트 구면 라텍스 비즈 닿는. 비드이었다다음 약한 광 트랩 ⁽¹⁴⁾ 백 초점 간섭을 사용하여 추적. 서로 다른 크기의 구슬과 협력함으로써, 연구진은 부하의 훨씬 넓은 범위에 걸쳐 모터를 연구 할 수있다. 이 분석법 후에 레이저 암시 야 조명과 결합 된 광전자 계 비드 추적 기술을 개발 위안 베르그 향상했다. 외부 점성 저항이 회전 ^{(15, 16)에} 내부 점성 저항에 비해 낮았다 너무 작았 닿는 골드 나노 비드 (~ 60 ㎚)의 그들의 방법을 사용 추적. 이 대장균에서 달성 가능한 최대 속도 (~ 300 Hz에서)의 측정을했다. V.의 alginolyticus에서 유사한 비드 분석은 중간 점성 부하 (~ 700 Hz에서) ^(17)의 회전 속도를 측정 할 수 있었다. (제로로드에서 가까운 매점에) 점성 부하의 전체 가능한 범위에서 모터 반응의 측정을 가능하게함으로써, 비드 분석은 t을 이해하는 중요한 생물 리 학적 도구를 제공orque 생성 프로세스 ^{(18, 19).}

최근에, 우리는 각각의 모터 ⁶ 정밀 기계적인 자극을 적용 할 수있게 광 핀셋을 포함하도록 위안 - 버그 분석을 수정했습니다. 그들은 점성 부하의 변화에 ​​응답하여 개조 -이 기술을 이용하여, 모터 회전 힘 발전기 동적 mechanosensors이다 것으로 나타났다. 이 메커니즘 불분명 남아 있지만 이러한 하중 감지가 진을 치고 박테리아로 세포 분화를 유발하는 것이 가능하다. 직접적인 증거는 부족하지만 다른 종의 편모 모터는,도 ²⁰ mechanosensitive 것으로도 보인다. 여기, 우리는 편모 필라멘트 ^(15)에 닿는 라텍스 구슬의 회전을 추적하기위한 광전자 기반 (PMT) 접근 방식에 대해 설명합니다. 이 실시간으로 긴 경질 위에 단일 비드를 추적 비교적 간단하기 때문에 초고속 카메라 추적 비교에서, 광전자 - 설치 유리한TIONS. 때문에 환경 자극 ^(21)에 편모 모터 단지에 리모델링 긴 시간을 공부 할 때 특히 유용합니다. 구체적으로는 E. coli에 대한 우리 상세히 프로토콜이지만, 그들은 용이하게 다른 종 편모 모터 공부하도록 할 수있다.

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프로토콜

1. 셀 준비

1. 10 mL의 신선한 TB 100 희석 : 1에 접종 한 다음 트립 톤 국물 (TB, 1 % 펩톤, 0.5 % 염화나트륨)에 대립 유전자 ^{15, 22} 끈적 끈적한 플릭를 들고 원하는 균주의 야간 문화를 성장. OD ₆₀₀ = 0.5까지 진탕 배양기에서 33 ° C에서 문화를 성장.
2. 1,500 XG에서 세포 펠렛 5-7 분, 재 분산 펠렛 적극적으로 필터 살균 운동 버퍼의 10 ㎖의 (MB를 10 mM의 인산 완충액 : 0.05-0.06 M 염화나트륨, ^10-4 M EDTA, 1 μm의 메티오닌, pH가 7.0).
3. 단계를 반복 1.2 두 번 더 1 ML의 MB의 마지막 펠릿을 재 분산.
4. (- 12cm 길이, 0.58 mm 내경 7) 폴리에틸렌 튜브로 연결된 21 ~ 23 게이지 어댑터와 함께 두 주사기 사이에 앞뒤로 ~ 75 번 전달하여 정지 전단. 45 초 - (30) 전단의 총 시간을 제한합니다.
5. 5-7 분 동안 1,500 XG에서 전단 된 세포를 원심 분리하여 다시 분산MB의 500 μL - 100 펠렛.

2. 슬라이드 준비

1. 커버 슬립 현미경 슬라이드 사이에 두 개의 양면 접착 테이프를 개재하여 촬상 챔버를 준비한다. 화성 분석을 위해, MB, 화학적 자극의 교환을 가능하게하는 미세 유체 챔버를 사용합니다.
2. 챔버에서 0.01 % 폴리 -L- 라이신 솔루션을 추가하고 5 분 후 부드럽게 MB와 표면 세척 (80-100 μL)를.
3. 챔버 내로 세포 현탁액 40 μL의 추가, 유리 표면에 부착을위한 충분한 시간이 허용 (7-8 분). 다른 측면에서 여과지로 용액을 심지하면서 상기 챔버의 일측에 100 μL를 첨가하여 MB 떨어진 세포를 흐른다.
4. 챔버로 라텍스 구슬 15 μL와 비즈를 정착 세포에 부착 할 충분한 시간 수 - 10 추가 (7-8 분). 구슬 떨어진 제거하는 단계 2.3에 설명 된대로 조심스럽게, MB의 100 μL 씻어. 비드 실리콘의 범위를 사용하여좋은 대비를 사용할 정도로 오랫동안 실험 ZES.

3. 비드 추적

1. 현미경 스테이지에 샘플을 놓고 모터에 연결된 구슬 위해 표면을 검사합니다. 위상 현미경이 필요하지 않지만 관측을 만들기 위해 40X 위상 목적을 사용합니다. 또한, 너무 오래 충분한 대비가 명확하게 어두운 배경에 밝은 구슬을 구분하기 위해 유지되는 밝은 - 필드 이미징을 사용한다.
2. 비드가 선택되면,도 1b에 도시 된 바와 같이 소정의 모서리에 비드를 위치 시키도록 측 방향으로 상기 스테이지를 이동. 같은 코너에 위치 구슬은 구슬의 회전 방향이 제대로 알려져 있는지 확인합니다. 이상적인 비드 궤도는 대략 원형이지만, 타원형 궤도가 허용됩니다.
3. 에일리어싱과 연관된 에러를 방지하기 위해 모터의 회전 주파수의 두 배 이상의 샘플링 주파수를 높게 유지. 본 연구에서는으로 회전 된 모터를 사용10 시간 이상 (500 Hz에서)했다 주파수 50 Hz의 시료는 평활 한 신호를 획득한다.

4. 데이터 분석

1. ²³ 필요한 경우 센터는 아핀 변환과 궤적의 PMT 출력 전압과 정확한 타원의 크기를 조절합니다. 회전 속도 ^(17)를 결정하기 위해 전력 스펙트럼 분석을 사용한다.
2. 극 각도 θ (t) = ATAN (Y (t) / X (t))를 결정합니다. 모터 속도의 변화를 확인하고 ω를 계산하여 시간이 지남에 따라 전환 ^14.
3. 모터 속도 데이터를 부드럽게 중앙값 필터를 사용한다. 이 전체 회전을 통해 필터 창 ^{(23, 24)를} 권장합니다.

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결과

광전자 증 배관 설치는 그림 1A에 표시됩니다. 이는 관심의 PMT가 비드에 의해 산란의 파장 범위에서 높은 감도를 갖는 것이 중요하다. 여기에서 사용되는 PMT가 가시 근적외선 범위에서 동작하고, 할로겐 광원에 의해 조명 비즈 산란광을 검출 할 수 있었다. 최적의 조명 조건 및 공급 전압을 하나의 설정마다 다를 것이다. 이 작업에 사용되는 설정하는 PMT 이득 ~...

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토론

테더 비드 추적 모터 토크의 정확한 추정을 용이하게하기 위해, 다음과 같은 정보가 검토되어야한다. flagellated 세포 이러한 측정을 수행 할 때, 전단은 중요한 단계입니다. 전단시켜 상기 모터의 점성 부하가 비드에 주로 기인하고 10 %의 오차 ^(16)에서 추정 될 수 있도록, 단순한 스터브로 편모 필라멘트를 감소시킨다. 양털 깎기도 밀접하게 분산 기행 (<비드 직경 ^14)와 원형 궤적?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-lysine Solution (0.1%)	Sigma-Aldrich	P8920	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	7307	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
1 mL Luer Slip Tip Syringe	Exel Int.	26048	http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge	Becton, Dickinson and Company	427565	http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	59-8325	http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Photomultiplier Tubes	Hamamatsu	R7400U-20	Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm,  0.78 ns response time  http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 mm precision slits	Edmund Optics	NT39-908	2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes
Oscilloscope	Tektronix	TBS 1032B	Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts  http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8 Pole LP/HP Filter	Krohn-Hite	3384	Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended.    http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot microscope	Nikon	NA	Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Cube Beamsplitter	ThorLabs	BS013