JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Abstract

المشيمة هي الجهاز الأول لتطوير خلال مرحلة التطور الجنيني ومطلوب لبقاء الجنين النامي. وتتكون المشيمة من مختلف خلايا الأرومة الغاذية التي تميز من خلايا الأديم الظاهر الغاذي خارج الجنينية من الكيسة قبل الغرس. على هذا النحو، فهمنا للأحداث التمايز في وقت مبكر من المشيمة البشرية محدودة بسبب القيود الأخلاقية والقانونية على العزلة والتلاعب في مرحلة التطور الجنيني البشري. الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) هي نظام نموذجي قوي للتحقيق في التنمية البشرية، ويمكن أيضا أن تكون متباينة في المختبر إلى خلايا الأرومة الغاذية التي تعبر عن علامات لمختلف أنواع الخلايا الأرومة الغاذية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل للتمييز بين hPSCs إلى خلايا الأرومة الغاذية باستخدام بروتين morphogenic العظام (4) ومثبطات للActivin / مسارات الإشارات العقدية. هذا البروتوكول يولد مختلف أنواع الخلايا الأرومة الغاذية التي يمكن transfected مع الرناوات siRNAsللتحقيق في فقدان وظيفة من الظواهر أو يمكن أن تصاب مع مسببات الأمراض. بالإضافة إلى ذلك، hPSCs يمكن تعديلها وراثيا ثم متباينة إلى الأسلاف الأرومة الغاذية لتحقيق مكاسب من وظيفة ويحلل. هذا في المختبر طريقة التمايز لتوليد أرومة مغذية الإنسان بدءا من hPSCs يتغلب على القيود الأخلاقية والقانونية للعمل مع الأجنة البشرية في مراحلها المبكرة، وهذا النظام يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك اكتشاف المخدرات وأبحاث الخلايا الجذعية.

Introduction

مطلوب المشيمة لنمو وبقاء الجنين أثناء الحمل ويسهل تبادل الغازات والمواد الغذائية والفضلات، والهرمونات بين الدورة الدموية للأم والجنين. الجهاز الأول شكلت خلال مرحلة التطور الجنيني الثدييات هو المشيمة التي تبدأ تطوير 6-7 أيام بعد الحمل في البشر و3،5-4،5 أيام في الفئران 1، 2، 3، 4. خلايا الأرومة الغاذية هي الخلايا أهم من المشيمة، وهذه الخلايا تمثل واحدة من أقرب الأحداث النسب تمايز الجنين الثدييات. أنها تنشأ من خلايا الأديم الظاهر الغاذي خارج الجنينية الخارجية للالكيسة قبل الغرس. معرفتنا المراحل الأولى من تطوير المشيمة محدودة بسبب القيود الأخلاقية واللوجستية على نمذجة التنمية البشرية في وقت مبكر.

خلال زرع الأجنة، أرومة مغذيةغزو ظهارة الأمهات والتمايز إلى خلايا السلف المتخصصة 5. وmononucleated أرومة غاذية خلوية (CTBS)، الأسلاف غير متمايزة أن تندمج والتمايز إلى أرومة غاذية مخلوية (أن SYNs) وأرومة مغذية الغازية extravillous (EVTs)، التي مرساة المشيمة إلى الرحم. ومتعددة النوى أن SYNs، لا شفاء خلايا متمايزة أن توليف الهرمونات اللازمة للحفاظ على الحمل. الأحداث التمايز الأولى التي تولد EVTs وأن SYNs ضرورية لتكوين المشيمة، وضعف في خلايا الأرومة الغاذية تؤدي إلى الإجهاض، تسمم الحمل، ووزن الولادة 1. وتشمل أنواع خطوط الخلايا الأرومة الغاذية الإنسان التي تم وضعها CTBS وchoriocarcinomas، والتي تنتج هرمونات المشيمة وعرض خصائص الغازية 6 خلد. خلايا الأرومة الغاذية الأولية من مشيمة في الثلث الأول الإنسان يمكن أن تكون معزولة، ولكن الخلايا DIF بسرعةferentiate ووقف تكاثر في المختبر. الأهم من ذلك، حولت وخطوط الخلايا الأولية لديها مختلف ملامح التعبير الجيني، مشيرا إلى أن خطوط الخلايا الأرومة الغاذية مكون للأورام وخلد قد لا تمثل بدقة أرومة مغذية أساسية 7. بالإضافة إلى ذلك، هذه الخطوط من غير المحتمل أن تشبه الأرومة الغاذية المشيمة الأسلاف الخلايا الجذعية لأنها مستمدة من بعد المرحلة الأولى خلال الثلث الثالث.

وهناك حاجة إلى قوة في نظام الثقافة المختبر من أرومة مغذية الإنسان في مرحلة مبكرة من أجل دراسة الأحداث في وقت مبكر من تشكيل المشيمة وظيفة. الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs)، التي تشترك مع خصائص الكتلة الخلوية الداخلية من الجنين قبل الغرس، كثيرا ما تستخدم لنموذج التنمية البشرية في وقت مبكر، بما في ذلك تشكيل المشيمة المبكر. كل من الخلايا التي يسببها الإنسان الجذعية المحفزة (hiPSCs) وhESCs يمكن التفريق إلى أرومة مغذية في المختبر باستخدام العظام مورالبروتين phogenic 4 (BMP4) 8، 9، 10، 11، 12، 13، 14، 15. هذا التحويل الخلايا المحفزة للخلايا الأرومة الغاذية استخدام BMP4 غير محددة للخلايا البشرية، ويستخدم على نطاق واسع لدراسة تطور المشيمة البشرية في وقت مبكر لأنها لا تتطلب الوصول إلى الأجنة البشرية في مراحلها المبكرة 9 و 16. مؤخرا، تم اكتشاف أن إضافة مثبطات A83-01 (A) وPD173074 (P)، الذي منع SMAD2 / 3 و MEK1 / 2 مسارات الإشارات، ويزيد من كفاءة hPSC التمايز إلى الأسلاف مثل الأديم الظاهر الغاذي، لا سيما أن SYNs وEVTs، دون جيل واسع من الأديم المتوسط، الأديم، أو خلايا الأديم الظاهر 9، 17 . باستخدام هذه الشروط المتوسطة، hESCs متباينة لمدة 12 يوما لديها مماثلة ملامح التعبير الجيني من خلايا الأديم الظاهر الغاذي المعزولة من أجنة الكيسة المرحلة الإنسان وتفرز العديد من الهرمونات نمو المشيمة محددة، ودعم صحة هذا النظام نموذجا في المختبر 9 و 11. هنا، نقدم بروتوكول مفصلة للالتمايز في المختبر من hPSCs إلى الأسلاف الأرومة الغاذية الإنسان باستخدام BMP4 / A / P مستنبت. هذه الشروط تنتج أعداد وفيرة من خلايا لمجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك التسلسل RNA، واختلال الجينات باستخدام الرناوات siRNAs والتهابات الممرض، والتعديل الوراثي باستخدام ترنسفكأيشن بوساطة lipofection.

Protocol

ملاحظة: للحصول على تمايز إما hESCs أو hiPSCs إلى الأسلاف الأرومة الغاذية، وانتقلت hPSCs نمت على الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFS) إلى المغذية خالية من الشروط لاثنين من الممرات قبل بدء التمايز مع BMP4 / A / P. هذه العملية يزيل التلوث MEF من الخلايا المتمايزة. هنا، نقدم بروتوكول للتمايز HESC، ونفس البروتوكول يمكن تطبيقها على hiPSCs.

1. الثقافة واسترداد hESCs على المشع الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFS) (التحضير)

  1. غاما تشعيع MEFS
    1. جعل 500 مل من المتوسط ​​لاستزراع MEFS: DMEM مع FBS 10٪، 2 مم L-الجلوتامين، 1X البنسلين / الستربتومايسين (القلم / بكتيريا)، و 0.1 الأحماض ملي غير الأمينية الأساسية (NEAA).
    2. ذوبان الجليد قارورة واحدة من MEFS الابتدائي واستخدام MEF المتوسطة لزراعة الخلايا. توسيع MEFS الابتدائي إلى 30 لوحات باستخدام مستنبت MEF.
      ملاحظة: تركيز الأكسجين ليست حاسمة لهذه الخطوة، لذلكأما الظروف الفسيولوجية (4٪) أو المحيطة (20٪) ضمن حاضنة يمكن استخدامها.
    3. حصاد MEFS. استخدام 0.25٪ التربسين لإزالة MEFS من لوحات ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل. وضع MEFS إلى أداة التشعيع وفضح الخلايا إلى 3500 رمادية.
      ملاحظة: سوف مقدار الوقت تعتمد على النشاط من مصدر داخل وحدة irradiator.
    4. Resuspend وMEFS المشع مع مستنبت MEF وحساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
    5. بيليه MEFS باستخدام جهاز للطرد المركزي وإضافة 50٪ ثقافة MEF المتوسطة وخلية 50٪ تجميد المتوسطة (80٪ FBS و 20٪ مستنبت MEF). قسامة 1 × 10 6 خلايا في قارورة.
    6. ضع قارورة MEF المشع في الفريزر -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ومن ثم نقلها إلى النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
  2. ذوبان MEFS وhESCs المجمدة للثقافة
    1. جعل 500 مل من HESC المتوسطة: DMEM / F-12 مع 20٪ مصل Replacement، 0.1 ملي NEAA، 2 مم L-الجلوتامين، 10 نانوغرام / مل bFGF، 0.1 مم SS-المركابتويثانول، و1X القلم / بكتيريا.
    2. ذوبان الجليد قارورة واحدة من MEFS قبل يوم واحد ذوبان hESCs. معطف لوحة 6 جيدا مع الجيلاتين 0.1٪، وذلك باستخدام 1 مل لكل بئر. احتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بإزالة الجيلاتين.
    3. إزالة قارورة من MEFS من التخزين في النيتروجين السائل وتزج القارورة في 37 ° C حمام الماء. مشاهدة القارورة بشكل متقطع حتى تبقى فقط بلورات الثلج الصغيرة. بسرعة نقل محتويات القارورة إلى 9 مل من المتوسط ​​MEF داخل أنبوب مخروطي 15 مل.
    4. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف و resuspend بيليه خلية في MEF المتوسطة. قسامة MEFS بالتساوي على طبق من ذهب 6 جيدا. وضع لوحة في 37 درجة مئوية منخفضة الأوكسجين (4٪) حاضنة بين عشية وضحاها.
  3. ثقافة الروتينية من hESCs على MEFS
    1. إزالة قارورة HESC من النيتروجين السائل وسرعة ذوبان الجليد القارورة باستخدام 37 ° C حمام الماء. ماصة بلطف hESCs إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على 9 مل من HESC المتوسطة وتدور باستمرار في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة المتوسطة و resuspend الخلايا مع 1 مل من HESC المتوسطة.
    2. نضح المتوسطة MEF من لوحة أعدت في الخطوة 1.2.4 وإضافة 1 مل من HESC المتوسطة. إضافة روك المانع Y-27632 (10 ميكرومتر) إلى المتوسطة HESC. نقل hESCs على MEFS.
    3. وضع الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية منخفضة الأوكسجين (4٪) بين عشية وضحاها. استبدال المتوسطة HESC يوميا. كشط خلايا متباينة مع ماصة باستور، تصور تحت المجهر تستقيم في 4X.
    4. تمرير hESCs كل 4-6 أيام، اعتمادا على confluency الخلية وحجم المستعمرات HESC. إعداد لوحة من MEFS اليوم قبل الركض. عندما الخلايا جاهزة للمرور، وإزالة المتوسطة HESC ويغسل جيدا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    5. إضافة 1 ملغ / مل كولاجيناز (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة كولاجيناز. Wرماد الخلايا مع برنامج تلفزيوني، إضافة 1 مل من HESC المتوسطة لكل بئر، ويدويا تتخلص من الخلايا في كتل صغيرة باستخدام طرف ماصة 5 مل. نقل كتل الخلايا علقت في جديد MEF المغلفة جيدا (ق).

2. الانتقال من hESCs من MEFS لتغذية خالية من الأحكام على لوحات مغلفة مصفوفة-خارج الخلية

  1. إعداد MEF مكيفة متوسطة (CM)
    1. لوحة للMEFS المشع في قارورة T75 في 90-100٪ confluency. من المهم أن MEFS ومطلي المكتظة. مراقبة الخلايا باستخدام المجهر لتحديد ما إذا كانت قد تعلق على الجزء السفلي من القارورة (MEFS إرفاق ما يقرب من 6 ساعات بعد الطلاء أو في اليوم التالي).
      ملاحظة: الخلايا غير مرتبط تطفو على المديين المتوسط ​​وعندما لاحظ باستخدام المجهر. في اليوم التالي، وإزالة MEF المتوسطة وإضافة 25 مل من HESC المتوسطة التي تفتقر إلى B-جمعية جيل المستقبل.
    2. جمع المتوسطة مكيفة بعد 24 ساعة من الحضانة. استبدال المتوسطة الطازجة يوميا لمدة أقصاها 12 يوما.
    3. تصفية CM جمعها باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. قبل استخدامها، إضافة جديدة B-جمعية جيل المستقبل لسم.
      ملاحظة: CM يمكن تجميد في -80 درجة مئوية، وتخزينها لمدة تصل إلى 1 سنة. بدلا من ذلك، تخزين سم في 4 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع.
  2. انتقال hESCs من الثقافة على MEFS إلى مجانا المغذية لوحات المغلفة المصفوفة خارج الخلية.
    1. إعداد المصفوفة خارج الخلية لزراعة الأنسجة لوحات طلاء
      1. ذوبان الجليد قسامة من المصفوفة خارج الخلية على الجليد (حوالي 3-4 ساعة). استخدام النصائح الجليد الباردة، الباردة، 50 مل أنبوب واحد مخروطي الشكل، وDMEM / F12 متوسطة، ونقل 2 ملغ من المصفوفة خارج الخلية في 24 مل من DMEM المثلج / F-12 (التخفيف يعتمد على تركيز المصفوفة خارج الخلية من المورد ).
      2. على الفور نقل 50 مل أنبوب مخروطي على الجليد وتخزينه في 4 درجات مئوية. لوحات زراعة الأنسجة الطلاء، وإضافة كمية مناسبة من المصفوفة خارج الخلية المخفف إلى البئر (على سبيل المثال، 1 مل لكل بئر في لوحة 6 جيدا). دوامة لمعطف لوحة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
    2. hESCs مرور من MEFS (كما في الخطوة 1.3) باستخدام سم تحتوي على B-جمعية جيل المستقبل (10 نانوغرام / مل).
      1. نضح لإزالة المصفوفة خارج الخلية من لوحة جديدة وإضافة CM تحتوي على B-جمعية جيل المستقبل. نقل كتل الخلوية كشط من لوحة MEF باستخدام ماصة وقسامة عليه في لوحة المغلفة المصفوفة خارج الخلية. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية منخفضة الأوكسجين بين عشية وضحاها.
      2. استبدال سم مع متوسط-B جمعية جيل المستقبل يوميا؛ فإن كمية متوسطة تعتمد على حجم قارورة الثقافة. استخدام 2 مل من المتوسط ​​للبئر واحدة 6-جيدا. كشط خلايا متباينة مع ماصة باستور.
      3. hESCs مرور كل 6-7 أيام، عندما المستعمرات مشرقة عندما ينظر تحت المجهر.
        ملاحظة: مستعمرات HESC نمت على لوحات المغلفة المصفوفة خارج الخلية تنمو أكبر من خلايا MEF مثقف.
      4. عندما الخلايا خالية من التغذية على استعداد للمرور، وإزالة المتوسطة، غسل الإعلاندينغ 1 مل من برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة، نضح لإزالة برنامج تلفزيوني، إضافة 0.5 ملغ / مل dispase (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية) مع ماصة، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      5. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني بإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر والشفط بعد ذلك. إضافة 1 مل من سم لكل بئر ويدويا تتخلص من الخلايا في كتل صغيرة باستخدام طرف ماصة 5 مل.
      6. لوحة للكتل الخلايا علقت في لوحات جديدة المغلفة المصفوفة خارج الخلية. الخلايا ينبغي أن تلتزم بعد 24 ساعة.

3. تمايز hESCs عن طريق BMP4 / A / P

  1. إعداد المتوسطة التمايز. استخدام سم (التي تفتقر إلى B-جمعية جيل المستقبل) وإضافة (جديد) BMP4 (50 نانوغرام / مل)، A83-01 (1 ميكرون)، وPD173074 (0.1 ميكرومتر). إضافة هذه المثبطات إلى CM قبل استخدامها.
  2. استخدام hESCs خالية من التغذية المتزايد على لوحات المغلفة المصفوفة خارج الخلية ل1 مرور، مثقف داخل حاضنة وضعت في 4٪ أكسجين. بعد مرور الأول على لوحات المغلفة المصفوفة خارج الخلية،السماح للخلايا تعلق لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، والشروع في التمايز. إزالة سم (التي تحتوي على B-جمعية جيل المستقبل) واستبدالها سم تحتوي على BMP4 / A / P (2 مل لكل بئر في لوحة 6 جيدا). مواصلة زراعة الخلايا باستخدام مستويات الأكسجين 4٪.
  3. استبدال سم تحتوي على BMP4 / A / P (2 مل / جيد لوحة 6 أيضا) كل أيام 2. نضح لإزالة المتوسطة من العمر وإضافة CM جديد باستخدام ماصة. في اليوم الثاني بعد إضافة BMP4 وإزالة B-جمعية جيل المستقبل (يعتبر التمايز يوم 2)، فإن شكل الخلية تغيير، والتي تظهر أكبر عندما لاحظ باستخدام المجهر.
    ملاحظة: غير متمايزة خلايا، والتي تظهر حواف مشرق جولة، لا تكون موجودة.
  4. جمع الخلايا في وقت نقاط المرجوة. وخلايا متباينة تتوقف تقسيم بعد حوالي 2 أسابيع. خلايا Transfect خلال هذه الفترة الزمنية (انظر القسم التالي).

4. ترنسفكأيشن من خلايا الأرومة الغاذية مع الرناوات siRNAs أو البلازميد الحمض النووي

  1. إعداد خلايا الأرومة الغاذية لترنسفكأيشن
    1. hESCs ثقافة لاثنين من الممرات على المصفوفة خارج الخلية بعد نقلهم من MEFS (راجع الخطوة 2.2). استخدام المتوسطة HESC تحتوي على B-جمعية جيل المستقبل.
    2. تقسيم hESCs على جديد يوميا خارج الخلية لوحة مصفوفة واحدة قبل التمايز. confluency الخلوية عالية المهم، لذلك انقسام الخلايا 1: 1 على لوحة جديدة / جيد، والتي ستضمن لا يقل عن 50٪ confluency في اليوم التالي. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في الحاضنة منخفضة الأوكسجين.
      ملاحظة: hESCs لا تحتاج لفرزها خلال هذه الخطوة.
    3. في اليوم التالي، واستبدال المتوسطة مع المتوسطة التمايز (CM تحتوي على BMP4 / A / P والتي تفتقر إلى B-جمعية جيل المستقبل، وذلك باستخدام 2 مل / جيد لوحة 6 جيدا). إزالة المتوسطة من العمر بواسطة الطموح ونقل هذه الوسيلة الجديدة (2 مل) باستخدام ماصة. وضع الخلايا في حاضنة منخفضة الأوكسجين (4٪ أكسجين) بين عشية وضحاها.
  2. تعداء باستخدام الرناوات siRNAs لتعطيل الجين أو استخدام البلازميد
    1. التفريق بين الخلايا حتى زمنيا المطلوبنقطة (بين أيام 1 و 14). قبل يوم واحد ترنسفكأيشن، ويعرض للتريبسين الخلايا باستخدام 0.05٪ التربسين لمدة 5 دقائق. لوحة منها إلى confluency المطلوب (اعتمادا على بروتوكول كاشف ترنسفكأيشن) على طبق من ذهب المغلفة الجيلاتين (إضافة الجيلاتين 0.1٪ لوحة زراعة الأنسجة لمدة 20 دقيقة، ونضح إلى إزالة). إضافة CM تحتوي على BMP4 / A / P (التي تفتقر إلى B-جمعية جيل المستقبل)، واحتضان بين عشية وضحاها.
    2. في اليوم التالي، إضافة متوسطة التمايز جديدة للخلايا. Transfect الرناوات siRNAs باستخدام كاشف ترنسفكأيشن سيرنا. لDNA البلازميد، استخدام كاشف lipofectamine المناسب.
    3. متابعة بروتوكول المنتج كما هو موضح لكل كاشف ترنسفكأيشن. نقل المجمعات سيرنا lipofectamine لكل / لوحة جيدا من الخلايا، مزيج بلطف، والثقافة الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة منخفضة الأوكسجين.
      ملاحظة: يتم تثبيط بعض الكواشف ترنسفكأيشن بواسطة المضادات الحيوية، والتي تتطلب CM تفتقر القلم / بكتيريا.
    4. في اليوم التالي، مع استبدال وسائل الإعلام التمايز جديدة.
    5. حصاد الخلايا في الرغبةد وقت نقاط (على سبيل المثال، 24 ساعة، 48 ساعة، و 72 ساعة) للتحقق من كفاءة تعطيل الجين باستخدام الكمي RT-PCR. للخلايا الحصاد، واستخدام التربسين 0.05٪، مضيفا 1 مل لكل بئر واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. إضافة 5 مل من المتوسط ​​MEF لكل بئر لتحييد التربسين. تدور أسفل الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق واستخدام بيليه خلية لعزل الحمض النووي الريبي.

العدوى 5. مسببات الأمراض من خلايا الأرومة الغاذية: سينداي العدوى الفيروسية

  1. إعداد hESCs للتمايز
    1. hESCs ثقافة لاثنين من الممرات على المصفوفة خارج الخلية بعد نقل من MEFS (راجع الخطوة 2.2). استخدام المتوسطة HESC تحتوي على B-جمعية جيل المستقبل.
    2. تقسيم hESCs على جديد يوميا خارج الخلية لوحة مصفوفة واحدة قبل التمايز. confluency الخلوية عالية المهم، تقسيم الخلايا حتى 1: 1 على لوحة جديدة / جيد، والتي ستضمن لا يقل عن 50٪ confluency في اليوم التالي. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة منخفضة الأوكسجين (4٪ أكسجين). <ر /> ملاحظة: hESCs لا تحتاج لفرزها خلال هذه الخطوة.
    3. في اليوم التالي، واستبدال المتوسطة مع المتوسطة التمايز (CM تحتوي على BMP4 / A / P والتي تفتقر إلى B-جمعية جيل المستقبل) والثقافة بين عشية وضحاها في حاضنة منخفضة الأوكسجين (4٪ أكسجين).
  2. سينداي عدوى فيروسية من خلايا الأرومة الغاذية
    1. قبل يوم واحد من يوم التمايز المطلوب، ويعرض للتريبسين الخلايا التفريق (إلى الخلايا واحد) باستخدام التربسين 0.05٪ لمدة 5 دقائق ونقلها إلى لوحة الجيلاتين المغلفة. إضافة متوسطة التمايز واحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة منخفضة الأوكسجين.
    2. في اليوم التالي، إضافة سيلة للعدوى (وهذا سوف تختلف تبعا للفيروس). استخدام تفتقر القلم / بكتيريا تحتوي على BMP4 / A / P، وذلك باستخدام 0.5 مل للبئر واحدة من لوحة 6 جيدا سم. إضافة فيروس سينداي عن وزارة الداخلية = 1. احتضان لمدة 8 ساعات في حاضنة منخفضة الأوكسجين.
    3. إذا ضرورية نقاط زمنية إضافية، وإزالة المتوسطة التي تحتوي على الفيروس بعد 4 ساعات واستبدالها BMP4 / A / P سم. جمع الخلايالعزل الحمض النووي الريبي باستخدام مكشطة الخلية.
    4. تحديد كفاءة العدوى الفيروسية عن طريق أداء QRT-PCR لجينات لها دور في الاستجابة الفيروسية 18.

النتائج

نظرة عامة على التمايز في المختبر من hPSCs

يبدأ هذا البروتوكول التمايز في المختبر مع hESCs غير متمايزة نمت على MEFS التي يتم نقلها إلى المغذية خالية من الشروط اللازمة لمرور واحد (الشكل 1A).

Discussion

قدمنا ​​الخطوات الأساسية للتمييز بين hESCs إلى الأسلاف الأرومة الغاذية. وقد تم مؤخرا الأمثل هذا البروتوكول للتمييز بسرعة hESCs مع إضافة Activin / العقدية يشير مثبطات، وزيادة التمايز إلى خلايا الأرومة الغاذية وتجنب جيل من الأسلاف الأديم المتوسط، والتي عادة ما لوحظ مع العلا?...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/F12Invitrogen11330-057
Knock Out Serum ReplacementInvitrogen10828-028This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAAInvitrogen11140-050
FBSInvitrogen16000-044
L-GlutamineInvitrogen10828-028
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15140-155
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
B-FGFMilliporeGF-003
DMEMInvitrogen11965-118
DispaseInvitrogen17105-041
Collagenase Type IVInvitrogen17104-019
Rock inhibitor Y27632Calbiochem688000
Irradiated CF1 MEFsGlobalStem6001GMEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 µm syringe filterMilliporeSLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubatorHeracell/VWR89187-192Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4R&D Systems314-BP-01M
A 83-01R&D Systems2939/10
PD173074R&D Systems3044/10
RNAiMaxInvitrogen13778150
TrizolThermoFisher15596026Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9Roche6365779001
MatrigelCorning356231This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.

References

  1. Rugg-Gunn, P. J. Epigenetic features of the mouse trophoblast. Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).
  2. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  3. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
  4. Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
  5. Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
  6. Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
  7. Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
  8. Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
  9. Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
  10. Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
  11. Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
  12. Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
  13. Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
  14. Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
  15. Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
  16. Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?. Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
  17. Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
  18. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  19. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  20. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
  21. Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
  22. Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
  23. Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
  24. Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
  25. Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
  26. Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
  27. Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
  28. Cole, L. A. Hyperglycosylated hCG, a review. Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).
  29. Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

121 morphogenic 4 Activin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved