La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

Riepilogo

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Abstract

La placenta è il primo organo di sviluppare durante l'embriogenesi ed è necessario per la sopravvivenza dell'embrione in via di sviluppo. La placenta comprende numerose cellule trofoblastiche che differenziano dalle cellule trophectoderm extra-embrionali di blastocisti preimpianto. Come tale, la nostra comprensione dei primi eventi di differenziazione della placenta umana è limitata a causa delle restrizioni etiche e legali su l'isolamento e la manipolazione di Embriologia Umana. Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono un sistema robusto modello per lo studio dello sviluppo umano e possono anche essere differenziate in vitro in cellule trofoblastiche che esprimono i marcatori dei vari tipi di cellule trofoblasto. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per differenziare hPSCs in cellule trofoblastiche utilizzando morphogenic proteina ossea 4 e gli inibitori delle vie di segnalazione / nodali activin. Questo protocollo genera vari tipi di cellule trofoblastiche che possono essere transfettate con siRNAper indagare la perdita di funzione fenotipi o possono essere infettati da agenti patogeni. Inoltre, hPSCs possono essere modificati geneticamente e poi differenziate in progenitori trofoblasto per guadagno-di-funzione analizza. Questo vitro metodo di differenziazione per la generazione di trofoblasto umano a partire dalle hPSCs supera le limitazioni etiche e legali di lavorare con i primi embrioni umani, e questo sistema può essere utilizzato per una varietà di applicazioni, tra cui la scoperta di farmaci e ricerca sulle cellule staminali.

Introduzione

La placenta è necessario per la crescita e la sopravvivenza del feto durante la gravidanza e facilita lo scambio di gas, sostanze nutritive, prodotti di scarto, e gli ormoni tra la circolazione materna e fetale. Il primo organo formato durante l'embriogenesi dei mammiferi è la placenta, che inizia lo sviluppo 6-7 giorni dopo il concepimento nell'uomo e 3,5-4,5 giorni nel topo ^{1, 2, 3, 4.} cellule trofoblastiche sono le cellule più importanti della placenta, e queste cellule rappresentano uno dei primi eventi di differenziazione lignaggio dell'embrione di mammifero. Essi derivano dalle cellule trophectoderm extra-embrionali esterni della blastocisti preimpianto. La nostra conoscenza delle prime fasi di sviluppo placentare è limitata da restrizioni etiche e logistiche sulla modellazione precoce sviluppo umano.

Durante embrionali impianto, trofoblastoinvadono l'epitelio materna e differenziarsi in cellule progenitrici specializzate ^5. Citotrofoblasti (CTBS) sono mononucleate, progenitori indifferenziati che si fondono e si differenziano in sinciziotrofoblasti (SYN) e trofoblasto invasive extravilloso (EVTS), che ancorano la placenta all'utero. SYN sono multinucleate, cellule terminalmente differenziate che sintetizzano gli ormoni necessari per sostenere la gravidanza. Gli eventi di differenziazione primi che generano EVTS e SYN sono essenziali per la formazione della placenta, come menomazioni in cellule trofoblastiche risultato in aborto spontaneo, pre-eclampsia e restrizione della crescita intrauterina ^1. I tipi di linee cellulari umane trofoblasto che sono stati sviluppati includono immortalati CTBS e coriocarcinoma, che producono ormoni della placenta e di visualizzazione proprietà invasive ^6. cellule trofoblastiche primari da placenta primo trimestre umani possono essere isolati, ma le cellule rapidamente differentiate e smettere di proliferare in vitro. È importante sottolineare che, trasformato e linee cellulari primarie avere diversi profili di espressione genica, indicando che le linee cellulari tumorali trofoblasto e immortalate potrebbero non rappresentare accuratamente trophoblasts primarie ^7. Inoltre, queste linee sono improbabili per assomigliare placentare trofoblasto progenitori di cellule staminali, perché sono derivati ​​da dopo-prima fase attraverso trimestre terzi.

Vi è la necessità di un robusto nel sistema di coltura in vitro di trofoblasto umano nella fase iniziale, al fine di studiare gli eventi precoci della formazione e della funzione placentare. le cellule staminali embrionali umane (hESC), che condividono gli oggetti con massa cellulare interna dell'embrione preimpianto, sono spesso utilizzati per modellare precoce sviluppo umano, compresa la formazione dei primi placenta. Entrambe le cellule indotte umane pluripotenti staminali (hiPSCs) e hESC possono essere differenziati in trofoblasto in vitro su Bone MorProtein phogenic 4 (BMP4) ^{8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.} Questa conversione di cellule pluripotenti cellule trofoblastiche utilizzando BMP4 è specifico per le cellule umane ed è ampiamente usato per studiare lo sviluppo dei primi placenta umana in quanto non richiede l'accesso a embrioni umani ^{9, 16.} Recentemente, si è scoperto che l'aggiunta di inibitori A83-01 (A) e PD173074 (P), che bloccano le vie di segnalazione SMAD2 / 3 e MEK1 / 2, aumenta l'efficienza della differenziazione HPSC in progenitori trophectoderm simili, soprattutto SYNs e EVTS, senza la vasta generazione di mesoderma, endoderma, o cellule ectoderma ^{9, 17} . Utilizzando queste condizioni medie, hESC differenziato per 12 giorni hanno simili profili di espressione genica le cellule trophectoderm isolate da embrioni blastocisti-stadio umano e secernono vari ormoni della crescita specifici placentare, sostenere la validità di questo sistema modello in vitro ^{9, 11.} Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la differenziazione in vitro di hPSCs in progenitori trofoblasto umani utilizzando BMP4 / A / P terreno di coltura. Queste condizioni producono numero abbondante di cellule per un'ampia varietà di applicazioni, tra RNA sequenziamento, gene perturbazione utilizzando siRNAs, infezioni patogeni e modificazione genetica utilizzando trasfezione lipofezione-mediata.

Protocollo

NOTA: Per la differenziazione delle hESC sia o hiPSCs in progenitori trofoblasto, hPSCs coltivati ​​su fibroblasti embrionali di topo (MEF) sono la transizione a alimentatore-Free condizioni per due passaggi prima di iniziare la differenziazione con BMP4 / A / P. Questo processo elimina la contaminazione MEF di cellule differenziate. Qui, vi presentiamo un protocollo per la differenziazione hESC, e lo stesso protocollo può essere applicato a hiPSCs.

1. Cultura e recupero di hESC su irradiati fibroblasti embrionali di topo (MEF) (preparati)

1. Gamma-irradiazione di MEF
   1. Rendere 500 ml di terreno per la coltura i MEF: DMEM con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 1x penicillina / streptomicina (Pen / Strep), e 0,1 mM aminoacidi non essenziali (NEAA).
   2. Scongelare una fiala di MEF primarie e usare medio MEF per la coltura delle cellule. Espandere le MEF primari a 30 lastre con terreno di coltura MEF.
      NOTA: Le concentrazioni di ossigeno non sono critici per questo passo, in modo dao condizioni fisiologiche (4%) o ambiente (20%) all'interno dell'incubatore possono essere utilizzati.
   3. Raccogliere il MEF. Utilizzare 0,25% tripsina per rimuovere i MEF dalle piastre e trasferire le cellule in una provetta conica. Posizionare i MEF in uno strumento di irradiazione ed esporre le cellule a 3.500 grigi.
      NOTA: La quantità di tempo dipenderà dall'attività della sorgente all'interno dell'unità irradiatore.
   4. Risospendere le MEF irradiati con terreno di coltura MEF e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
   5. Agglomerare le MEF utilizzando una centrifuga e aggiungere il 50% terreno di coltura di cellule MEF e il 50% di media (80% FBS e il 20% terreno di coltura MEF) di congelamento. Aliquota 1 x 10 ⁶ cellule per fiala.
   6. Posizionare le fiale MEF irradiati in un congelatore -80 ° C durante la notte, e poi trasferirli ad azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
2. Scongelare MEF surgelati e hESC per la cultura
   1. Fare 500 ml di terreno hESC: DMEM / F-12 con il 20% di siero Replacement, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-glutammina, 10 ng / ml bFGF, 0,1 mM ß-mercaptoetanolo, e 1x Pen / Strep.
   2. Scongelare una fiala di MEF un giorno prima lo scongelamento delle hESC. Coat un 6-bene con 0,1% di gelatina, utilizzando 1 ml per ogni bene. Incubare per almeno 20 minuti a temperatura ambiente, e quindi rimuovere la gelatina.
   3. Rimuovere una fiala di MEF di conservazione in azoto liquido e immergere la provetta in un bagno di acqua C 37 °. Guarda il flacone a intermittenza fino a quando solo piccoli cristalli di ghiaccio rimangono. trasferire rapidamente il contenuto della fiala per 9 ml di terreno MEF all'interno di un tubo da 15 ml.
   4. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 200 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in media MEF. Aliquota del MEF in modo uniforme su una piastra da 6 pozzetti. Mettere la piastra in un 37 ° C a basso ossigeno (4%) incubatore durante la notte.
3. La cultura di routine di hESC sul MEF
   1. Rimuovere una fiala hESC da azoto liquido e scongelare rapidamente la fiala con un 37 ° C bagnomaria. pipettare delicatamente le hESC in un tubo da 15 ml contenente 9 ml di terreno hESC e spin down a 200 xg per 5 min. Rimuovere il mezzo e risospendere le cellule con 1 ml di terreno hESC.
   2. Aspirare il medium MEF dalla piastra preparato al punto 1.2.4 e aggiungere 1 ml di terreno hESC. Aggiungere inibitore della roccia Y-27632 (10 micron) al mezzo hESC. Trasferire le hESC sul MEF.
   3. Mettere le cellule in un incubatore a 37 ° C a basso ossigeno (4%) durante la notte. Sostituire la media hESC quotidiano. Raschiare le cellule differenziate con una pipetta Pasteur, visualizzati sotto un microscopio verticale a 4X.
   4. Il passaggio hESCs ogni 4-6 giorni, a seconda della confluenza cellulare e la dimensione delle colonie hESC. Preparare un piatto di MEF il giorno prima passaging. Quando le cellule sono pronte per passaggio, rimuovere il terreno hESC e lavare il pozzo di 1 ml di PBS.
   5. Aggiungere 1 mg / ml di collagenasi (preriscaldata a 37 ° C), incubare a 37 ° C per 5 min, e rimuovere la collagenasi. Wcenere le cellule con PBS, aggiungere 1 ml di terreno hESC per bene, e raschiare manualmente le cellule in piccoli ciuffi utilizzando la punta di una pipetta da 5 ml. Trasferire i grumi di cellule sospese in un pozzo (s) nuovo MEF rivestite.

2. Transizione di hESC dal MEF per alimentatore-Free Condizioni su piastre di matrice extracellulare rivestite

1. Preparare MEF condizionata media (CM)
   1. Piastra le MEF irradiati in un pallone T75 al 90-100% confluenza; è importante che i MEF sono densamente placcati. Osservare le cellule utilizzando un microscopio per determinare se essi hanno attaccato al fondo del pallone (MEF attribuiscono circa 6 ore dopo la placcatura o il giorno successivo).
      NOTA: le cellule manuali liberi galleggiano nel mezzo quando osservate al microscopio. Il giorno successivo, rimuovere medio MEF e aggiungere 25 ml di terreno hESC privi B-FGF.
   2. Raccogliere il mezzo condizionato dopo 24 ore di incubazione. Sostituire con mezzo fresco al giorno per un massimo di 12 giorni.
   3. Filtrare il CM raccolto usando un filtro di 0,22 micron. Prima dell'uso, aggiungere fresca B-FGF al CM.
      NOTA: CM può essere congelato a -80 ° C e conservato fino a 1 anno. In alternativa, memorizzare il CM a 4 ° C per 2 settimane.
2. Transizione le hESC della cultura sulle MEF per alimentatore-Free piastre rivestite matrice extracellulare.
   1. Preparazione della matrice extracellulare per piastre di coltura dei tessuti di rivestimento
      1. Scongelare una aliquota di matrice extracellulare su ghiaccio (circa 3-4 ore). Usando le punte ghiacciate, un tubo da 50 ml a freddo, e medio / F12 DMEM, trasferimento 2 mg di matrice extracellulare in 24 ml di DMEM ghiacciata / F-12 (la diluizione dipende dalla concentrazione della matrice extracellulare dal fornitore ).
      2. trasferire immediatamente il tubo da 50 ml di ghiaccio e conservarlo a 4 ° C. Per piastre di coltura di tessuto di rivestimento, aggiungere la giusta quantità di matrice extracellulare diluito al pozzo (ad esempio, 1 ml per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti). Agitare per rivestire la piastra ed incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
   2. hESC passaggio dal MEF (come al punto 1.3) utilizzando CM contenente B-FGF (10 ng / ml).
      1. Aspirare per rimuovere la matrice extracellulare dalla nuova piastra e aggiungere CM contenente B-FGF. Trasferire i ciuffi cellulari raschiate dalla piastra MEF con una pipetta e un'aliquota nella piastra di matrice rivestita extracellulare. Incubare al 37 ° C a basso ossigeno incubatore durante la notte.
      2. Sostituire il CM con il mezzo B-FGF quotidiana; la quantità di mezzo dipenderà dalla dimensione del pallone di coltura. Utilizzare 2 ml di terreno per un 6-bene bene. Raschiare le cellule differenziate con una pipetta Pasteur.
      3. hESC Passage ogni 6-7 giorni, quando le colonie sono luminose se visto sotto il microscopio.
         NOTA: colonie hESC coltivate su piastre matrice extracellulare rivestite sviluppano più grandi rispetto alle cellule MEF-coltura.
      4. Quando le cellule libera-feeder sono pronti per il passaggio, rimuovere il supporto, lavare dall'inserzionistading 1 ml di PBS utilizzando una pipetta, aspirare per rimuovere il PBS, aggiungere 0,5 mg / ml dispasi (preriscaldata a 37 ° C) con una pipetta e incubare a 37 ° C per 5 min.
      5. Lavare le cellule con PBS aggiungendo 2 ml di PBS per pozzetto ed aspirando dopo. Aggiungere 1 ml di CM per pozzetto e raschiare manualmente le cellule in piccoli ciuffi utilizzando la punta di una pipetta da 5 ml.
      6. Piastra i grumi di cellule sospese in nuove piastre di matrice extracellulare rivestite; le cellule devono aderire dopo 24 ore.

3. La differenziazione delle hESC Utilizzo BMP4 / A / P

1. Preparare il mezzo di differenziazione. Utilizzare CM (privo B-FGF) e aggiungere (fresca) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 mM), e PD173074 (0,1 pM). Aggiungere questi inibitori alla CM prima dell'uso.
2. Utilizzare hESC senza alimentatore crescono sulle piastre di matrice extracellulare rivestite per 1 passaggio, coltivate all'interno di un incubatore a 4% di ossigeno. Dopo il primo passaggio su piastre matrice extracellulare rivestite,lasciare che le cellule si attaccano per 24 ore. Il giorno successivo, avviare la differenziazione. Rimuovere il CM (che contiene B-FGF) e sostituirlo con CM contenente BMP4 / A / P (2 ml per bene in un 6-pozzetti). Continuare a coltura le cellule utilizzando livelli di ossigeno 4%.
3. Sostituire il CM contenente BMP4 / A / P (2 ml / pozzetto per un 6-pozzetti) ogni 2 giorni. Aspirare per rimuovere il vecchio medio e aggiungere nuove CM con una pipetta. Il secondo giorno dopo l'aggiunta e rimozione BMP4 B-FGF (considerato differenziazione giorno 2), la morfologia cellulare cambierà, apparendo più grande quando osservata con un microscopio.
   NOTA: Indifferenziato cellule, che presentano bordi arrotondati luminosi, non saranno presenti.
4. Raccogliere le cellule al time-punti desiderati. Le cellule differenziate si fermeranno dividendo dopo circa 2 settimane. cellule trasfezione durante questo periodo di tempo (vedere la sezione successiva).

4. Trasfezione di cellule trofoblastiche con siRNA o il DNA plasmidi

1. Preparare cellule trofoblastiche per trasfezione
   1. hESC cultura per due passaggi sulla matrice extracellulare dopo il loro trasferimento dalle MEF (vedi punto 2.2). Utilizzare media hESC contenente B-FGF.
   2. Dividere le hESC su una nuova piastra matrice extracellulare un giorno prima differenziazione. Alta confluenza cellulare è importante, così dividere le celle 1: 1 su una nuova piastra / pozzetto, che garantirà almeno il 50% di confluenza il giorno successivo. Incubare le cellule durante la notte in incubatore a basso ossigeno.
      NOTA: hESC non devono essere contati durante questa fase.
   3. Il giorno successivo, sostituire il supporto con il mezzo di differenziazione (CM contenente BMP4 / A / P e privo di B-FGF, con 2 ml / pozzetto per un 6-pozzetti). Rimuovere il vecchio mezzo tramite aspirazione e trasferire il nuovo mezzo (2 ml) con una pipetta. Mettere le cellule in un incubatore a basso ossigeno (4% di ossigeno) durante la notte.
2. Trasfezioni con siRNA per geni interruzione o utilizzando DNA plasmide
   1. Differenziare le cellule fino a quando il tempo-desideratopunto (tra i giorni 1 e 14). Il giorno prima della transfezione, trypsinize le cellule utilizzando 0,05% tripsina per 5 min. li piastra alla confluenza desiderata (a seconda del protocollo di reagente di trasfezione) su una piastra di gelatina rivestita (aggiungere 0,1% di gelatina ad una piastra di coltura tissutale per 20 minuti e aspirare per rimuovere). Aggiungere CM contenente BMP4 / A / P (manca B-FGF) e incubare una notte.
   2. Il giorno successivo, aggiungere terreno di differenziamento fresco alle cellule. Trasfezione siRNA utilizzazione di un reagente di trasfezione di siRNA. Per DNA plasmide, usare un reagente lipofectamina appropriata.
   3. Seguire il protocollo prodotto come descritto per ciascun reagente di trasfezione. Trasferire i complessi siRNA-Lipofectamine per ciascun / pozzetti delle cellule, mescolare delicatamente, e la cultura nelle cellule durante la notte in un incubatore a basso ossigeno.
      NOTA: Alcuni reagenti di trasfezione sono inibite dagli antibiotici, le quali richiedono CM manca Pen / Strep.
   4. Il giorno successivo, sostituire con i media differenziazione fresco.
   5. Raccogliere le cellule al desideriod time-punti (ad esempio, 24 ore, 48 ore e 72 ore) per verificare l'efficienza gene interruzione usando RT-PCR quantitativa. Per le cellule di raccolta, utilizzare 0,05% tripsina, aggiungendo 1 ml per pozzetto ed incubare per 5 min a 37 ° C. Aggiungere 5 ml di terreno MEF per pozzetto per neutralizzare la tripsina. Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min e utilizzare il pellet cellulare per l'isolamento dell'RNA.

5. patogeni infezione di cellule trofoblastiche: Sendai Infezione virale

1. Preparare hESC per la differenziazione
   1. hESC cultura per due passaggi sulla matrice extracellulare dopo il trasferimento dai MEF (vedi punto 2.2). Utilizzare media hESC contenente B-FGF.
   2. Dividere le hESC su una nuova piastra matrice extracellulare un giorno prima differenziazione. Alta confluenza cellulare è importante, le cellule così dividere 1: 1 su una nuova piastra / pozzetto, che garantirà almeno il 50% di confluenza il giorno successivo. Incubare le cellule durante la notte in un incubatore a basso ossigeno (4% di ossigeno).
      Nota: hESC non devono essere contati durante questa fase.
   3. Il giorno successivo, sostituire il supporto con il mezzo di differenziazione (CM contenente BMP4 / A / P e privo di B-FGF) e cultura durante la notte in un incubatore a basso ossigeno (4% di ossigeno).
2. Sendai infezione virale delle cellule trofoblastiche
   1. Un giorno prima del giorno di differenziazione desiderata, trypsinize le cellule di differenziazione (a singole cellule) con 0,05% tripsina per 5 minuti e trasferirli su un piatto di gelatina rivestita. Aggiungere mezzo differenziazione e incubare una notte in un incubatore a basso ossigeno.
   2. Il giorno successivo, aggiungere mezzo di infezione (questo varierà a seconda del virus). Usa CM manca Pen / Strep contenente BMP4 / A / P, utilizzando 0,5 ml per un pozzetto di un 6-pozzetti. Aggiungere virus Sendai per MOI = 1. Incubare per 8 ore in un incubatore a basso ossigeno.
   3. Se sono necessari ulteriori punti temporali, rimuovere il supporto di virus contenente dopo 4 ore e sostituirlo con BMP4 / A / P CM. raccogliere le celluleper l'isolamento di RNA con un raschietto cellulare.
   4. Determinare l'efficienza di infezione virale effettuando qRT-PCR per i geni coinvolti nella risposta virale ^18.

Risultati

Panoramica di differenziazione in vitro di hPSCs

Questo protocollo di differenziazione in vitro inizia con hESC indifferenziato coltivati in MEF che la transizione al alimentatore-Free condizioni per un passaggio (Figura 1A). Mentre abbiamo descritto la differenziazione di hESC in questo protocollo, abbiamo usato questo protocollo di differenziarsi con successo hiPSCs in cellule trofoblastiche. ...

Discussione

Abbiamo presentato i passaggi fondamentali per differenziare hESC in progenitori trofoblasto. Questo protocollo è stato recentemente ottimizzato per differenziare rapidamente hESCs con l'aggiunta di inibitori Activin / segnalazione nodale, aumentando la differenziazione di cellule trofoblastiche ed evitando la generazione di progenitori mesoderma, tipicamente osservati con il solo trattamento BMP4. Il sistema modello BMP4 consente per l'esame delle prime fasi della specifica trofoblasto stirpe umana e di espans...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Knock Out Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamine	Invitrogen	10828-028
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispase	Invitrogen	17105-041
Collagenase Type IV	Invitrogen	17104-019
Rock inhibitor Y27632	Calbiochem	688000
Irradiated CF1 MEFs	GlobalStem	6001G	MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 µm syringe filter	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubator	Heracell/VWR	89187-192	Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4	R&D Systems	314-BP-01M
A 83-01	R&D Systems	2939/10
PD173074	R&D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.