במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

Jianle Wang; Montserrat C. Anguera

doi:10.3791/55268

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Abstract

השליה היא האיבר הראשון לפתח במהלך embryogenesis ודרושה להישרדות של העובר המתפתח. השליה מורכבת תאים trophoblastic שונים המבדילים מתאי trophectoderm חוץ עובריים של הבלסטוציסט preimplantation. ככזה, את הבנתנו את אירועי הבידול המוקדמים של השליה האנושית מוגבלת בגלל מגבלות אתיות ומשפטיות על בידוד המניפולציה של עובר אנושי. תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) הם מערכת מודל חזקה לחקירת התפתחות אנושית והוא יכול גם להיות מובחן במבחנה לתאים trophoblastic מבטאי סמנים של סוגי תאי trophoblast השונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להבחנת hPSCs לתאי trophoblastic באמצעות עצם morphogenic חלבון 4 ומעכבים של מסלולי איתות Activin / קטרים. פרוטוקול זה מייצר סוגי תאים trophoblast שונים שיכולים להיות transfected עם siRNAsעל חקירת פנוטיפים הפסד של פונקציה או יכול להיות נגוע פתוגנים. בנוסף, hPSCs ניתן מהונדס גנטי ולאחר מכן מובחן לתוך אבות trophoblast עבור רווח של פונקצית המנתח. שיטת בידול במבחנה זו להפקה trophoblasts אדם החל hPSCs מתגברת על המגבלות האתיות ומשפטיות של עבודה עם עוברי אדם מוקדם, מערכת זו יכולה לשמש עבור מגוון רחב של יישומים, כולל גילוי תרופות מחקר בתאי גזע.

Introduction

השליה נדרשת לצמיחה וההישרדות של העובר במהלך הריון ומקלה על חילופי גזים, חומרים מזינים, פסולת, והורמונים בין זרימת יולדות ועוברת. העוגב הראשון נוצרו במהלך העובר יונקים הוא השליה, שמתחיל לפתח 6-7 ימים לאחר ההתעברות בבני אדם ובבעלי 3.5-4.5 ימים בעכברים ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^4. תאי Trophoblastic הם התאים החשובים ביותר של השליה, ותאים אלה מייצגים אחד אירועי בידול שושלת המוקדמים של העובר היונק. הם נובעים מתאי trophectoderm חוץ עובריים החיצוני של הבלסטוציסט preimplantation. הידע שלנו בשלבים המוקדמים של פיתוח שליה הוא מוגבל על ידי מגבלות אתיות ולוגיסטיות על דוגמנות התפתחות אנושית מוקדם.

במהלך השתלה העוברית, trophoblastsלפלוש האפיתל האימהי להתמיין ובתאים מתמחים ^5. Cytotrophoblasts (CTBs) הם mononucleated, אבות מובחן כי הפתיל להתמיין syncytiotrophoblasts (SYNs) ו trophoblasts פולשנית extravillous (ד ^), אשר עוגן השליה אל הרחם. SYNs הוא multinucleated, תאים מובחנים סופנים כי לסנתז הורמונים הכרחיים לקיום הריון. האירועים בידול מוקדם שיוצרים ד ^ ו SYNs הם מרכיב חיוני לייצור השליה, כמו ליקויי בתאים trophoblastic לגרום להפלה, רעלת הריון, ו ^-1 פיגור גדילה תוך רחמי. סוגי שורות תאים אנושיים trophoblast אשר פותחו כוללים הנציחו CTBs ו choriocarcinomas, אשר מייצר הורמוני השליה ומאפייני פולשנית תצוגה ^6. תאי trophoblastic ראשית ממנהל השליות הראשון בטרימסטר אדם יכולים להיות מבודדים, אבל התאים במהירות DIFferentiate ולהפסיק מתרבים במבחנה. חשוב לציין, הפך שורות תאים ראשוניות יש פרופילי ביטוי גנים שונים, המציין כי שורות תאי trophoblast tumorigenic והנציחו לא יכולות לייצג במדויק העיקרי trophoblasts ^7. בנוסף, שורות אלה צפויות להידמות אבות תאי גזע trophoblast השליה כי הם נגזרים בשלב מאוחר תחילה דרך הטרימסטר שלישי.

יש צורך חזק במערכת תרבות חוץ גופייה של trophoblasts אדם בשלב מוקדם על מנת ללמוד את האירועים הראשונים של היווצרות שליה ותפקוד. תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs), אשר חולקים תכונות עם מסת התאים הפנימית של עובר preimplantation, משמשים לעתים קרובות מודל התפתחות אנושית מוקדם, כוללים ההיווצרות של השליה מוקדם. שני תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) ו hESCs ניתן להבדיל לתוך trophoblasts במבחנה באמצעות עצם מורחלבון 4 phogenic (BMP4) ^{^8,} ^{^9,} ^{^10,} ^{^11,} ^{^12,} ^{^13,} ^{^14,} ^15. מרה זו של תאי פלוריפוטנטיים לתאי trophoblastic באמצעות BMP4 היא ספציפית עבור תאים אנושיים והיא בשימוש נרחב כדי ללמוד על ההתפתחות של השליה האנושית מוקדם כי היא אינה דורשת גישה עוברית אדם מוקדם ^{^9,} ^16. לאחרונה, התגלה כי תוספת של מעכבי A83-01 (א) ו PD173074 (P), אשר חוסמים את המסלולים SMAD2 / 3 ו MEK1 / 2 איתות, מגביר את היעילות של בידול hPSC לתוך אבות דמוי trophectoderm, בעיקר SYNs ו ד ^, ללא דור נרחב של המזודרם, האנדודרם, או תאים האאקטודרם ^{^9,} ¹⁷ . באמצעות תנאים בינוניים אלה, hESCs בדיל עבור יש 12 ימים פרופילי ביטוי גנים דומה כתאי trophectoderm המבודדים עובר הבלסטוציסט הבמה אדם ומפרישים הורמוני גדילת השליה ספציפיות שונים, תומכי תוקפיו של מערכת מודל במבחנת ^{^9,} ^11. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור בידול במבחנה של hPSCs לתוך אבות trophoblast אדם באמצעות BMP4 / A / P בינוני תרבות. תנאים אלה לייצר מספר שופע של תאים עבור מגוון רחב של יישומים, כולל רצף RNA, שיבוש הגן באמצעות siRNAs, זיהומים הפתוגן, ושינוי גנטי באמצעות transfection בתיווך lipofection.

Protocol

הערה: לקבלת הבידול של או hESCs או hiPSCs לתוך אבות trophoblast, hPSCs גדל על fibroblasts העכבר העוברי (MEFs) הם יועברו אל מזין ללא תנאים לשני קטעים לפני ביצוע בידול עם BMP4 / A / P. תהליך זה מבטל את זיהום MEF של תאים מובחנים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בידול hESC, ואותו פרוטוקול ניתן ליישם hiPSCs.

תרבות 1. ושחזור של hESCs על פיברובלסטים עכבר עובריים מוקרן (MEFs) (תכשירים)

גמא-הקרנה של MEFs
1. הפוך 500 מ"ל של מדיום עבור culturing MEFs: DMEM עם 10% FBS, 2 מ"מ L- גלוטמין, 1x פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס), ו -0.1 מ"מ חומצות האמינו הלא-חיוניות (NEAA).
2. להפשיר בקבוקון אחד MEFs העיקרי ולהשתמש בינוני MEF עבור culturing התאים. הרחב את MEFs הראשוני ל -30 צלחות באמצעות מדיום תרבות MEF.
  הערה: ריכוזי חמצן אינם קריטיים עבור שלב זה, כךאו פיזיולוגיים (4%) או הסביבה (20%) תנאים בתוך חממה ניתן להשתמש.
3. קציר MEFs. השתמש 0.25% טריפסין להסיר את MEFs מהצלחות ולהעביר את תאי צינור חרוטים. מניחים את MEFs לתוך מכשיר הקרנה ולחשוף את התאים 3,500 אפורים.
  הערה: משך הזמן יהיה תלוי בפעילות של המקור בתוך יחידת irradiator.
4. Resuspend את MEFs מוקרן עם מדיום התרבות MEF ולספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer.
5. גלולת MEFs באמצעות צנטריפוגות ולהוסיף בינוני תרבות MEF 50% ו -50% תא הקפאה בינוני (FBS 80% ובינוני תרבות MEF 20%). Aliquot 1 x 10 ⁶ תאים לכל בקבוקון.
6. מניח את בקבוקוני MEF מוקרנים במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולאחר מכן להעביר אותם בחנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.
מפשיר MEFs ו hESCs קפוא לתרבות
1. הפוך 500 מ"ל של מדיום hESC: DMEM / F-12 עם 20% סרום Replacement, 0.1 מ"מ NEAA, 2 מ"מ L- גלוטמין, 10 ng / ml bFGF, 0.1 מ"מ SS-mercaptoethanol, ו 1x פן / סטרפטוקוקוס.
2. להפשיר בקבוקון אחד של יום MEFs אחד לפני להפשרת hESCs. מעיל 6-גם צלחת עם ג'לטין 0.1%, באמצעות 1 מ"ל לכל היטב. דגירה של 20 דקות לפחות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסר את הג'לטין.
3. הסר בקבוקון של MEFs מהאחסון בחנקן נוזלי לטבול את הבקבוקון בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. צפה הבקבוקון לסירוגין עד להישאר גבישי קרח קטנים בלבד. העבר במהירות את תכולת הבקבוקון 9 מ"ל של מדיום MEF בתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
4. גלולת התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה במדיום MEF. Aliquot MEFs שווה לצלחת 6 באר. מכניס את הצלחת לתוך לילה 37 ° C חממה דל בחמצן (4%).
תרבות לשגרת hESCs על MEFs
1. הסר בקבוקון hESC מ חנקן נוזלי ובמהירות להפשיר את הבקבוקון באמצעות 3באמבט מים 7 מעלות צלזיוס. בעדינות פיפטה hESCs לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של מדיום hESC ומסובב ב XG 200 במשך 5 דקות. הסר הבינוני resuspend התאים עם 1 מ"ל של מדיום hESC.
2. לשאוב את המדיום MEF מהצלחת מוכן בשלב 1.2.4 ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום hESC. הוספת רוק מעכב Y-27632 (10 מיקרומטר) למדיום hESC. מעבירים את hESCs על MEFs.
3. מניח את התאים לתוך 37 ° C חממה דל בחמצן (4%) לילה. החלף את המדיום hESC יומי. לגרד תאים מובחנים עם פיפטה פסטר, דמיינו תחת מיקרוסקופ זקוף על 4X.
4. מסדרון, hESCs כל 4-6 ימים, תלוי confluency התא ואת הגודל של מושבות hESC. הכינו צלחת של MEFs יום לפני passaging. כאשר התאים מוכנים למעבר, להסיר את המדיום hESC ולשטוף היטב עם 1 מ"ל של PBS.
5. הוסף 1 מ"ג / מ"ל collagenase (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס), לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולהסיר את collagenase. Wאפר את התאים עם PBS, להוסיף 1 מ"ל של מדיום hESC לכל היטב, באופן ידני לגרד את התאים לתוך גושים קטנים באמצעות קצה פיפטה 5 מ"ל. מעביר את גושי תאים המושעים לתוך MEF מצופה חדש היטב (הים).

מעבר 2. של hESCs מ MEFs מזין ללא תנאי על תאי מטריקס מצופה צלחות

כן MEF אוויר הבינוני (CM)
1. פלייט MEFs מוקרן בבקבוק T75 בבית 90-100% confluency; חשוב כי MEFs הם מצופה בצפיפות. שים את התאים באמצעות מיקרוסקופ כדי לקבוע אם יש להם מצורף בתחתית של הבקבוק (MEFs לצרף כ -6 שעות לאחר ציפוי או למחרת).
  הערה: תאים פנויים לצוף בטווח הבינוני כאשר נצפו באמצעות מיקרוסקופ. למחרת, להסיר בינוני MEF ולהוסיף 25 מ"ל של מדיום hESC חסר B-FGF.
2. אסוף המדיום מותנה לאחר 24 שעות של דגירה. חלף בינוני טרי מדי יום לכל היותר 12 ימים.
3. סנן את CM שנאסף באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. לפני השימוש, להוסיף B-FGF טרי CM.
  הערה: CM אפשר להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס, לאחסן עד 1 שנה. לחלופין, לאחסן את CM על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות.
תוכל להעביר את hESCs מתרבה על MEFs מזינה ללא צלחות מטריקס מצופית תאיות.
1. הכנת תאי מטריקס עבור צלחות בתרבית רקמה ציפוי
  1. להפשיר aliquot של מטריקס על הקרח (כ 3-4 שעות). בעזרת הטיפים קר כקרח, צינור חרוטי אחד קר, 50 מ"ל, ובינוניים DMEM / F12, העברת 2 מ"ג של מטריקס ל -24 מ"ל של DMEM קר כקרח / F-12 (דילול תלויה בריכוז תאי מטריקס מהספק ).
  2. מיד להעביר את 50 מ"ל צינור חרוטי לקרח ולאחסן אותו ב 4 ° C. עבור צלחות בתרבית רקמה ציפוי, להוסיף את הכמות המתאימה של מטריקס בדילול אל הבאר (למשל, 1 מ"ל לכל היטב צלחת 6-היטב). מערבולת כדי לצפות את הצלחת דגירה בטמפרטורת החדר למשך לפחות שעה 1.
2. hESCs קטע מתוך MEFs (כמו בשלב 1.3) באמצעות CM המכיל B-FGF (10 ng / ml).
  1. לשאוב להסיר את תאי מטריקס מהצלחת חדשה ולהוסיף CM המכיל B-FGF. מעביר את הגושים הסלולר מגורדים מצלחת MEF בעזרת פיפטה ו aliquot אותו לתוך צלחת מטריקס מצופה התאית. דגירה בחממה 37 ° C נמוך חמצן למשך הלילה.
  2. החזר את CM עם המדיום B-FGF יומי; בסך הבינוני יהיה תלוי בגודל של בקבוק התרבות. השתמש 2 מ"ל של מדיום עבור 6-היטב היטב אחד. לגרד תאים מובחנים עם פיפטה פסטר.
  3. hESCs מעבר כל 6-7 ימים, כאשר מושבות בהירות כאשר הוא מוצג תחת מיקרוסקופ.
    הערה: מושבות hESC גדלו על צלחות מצופות מטריקס לגדול מאשר תאי MEF-תרבותיים.
  4. כאשר התאים ללא מזין מוכנים למעבר, להסיר את המדיום, לשטוף ידי מודעותדינג 1 מ"ל של PBS בעזרת פיפטה, לשאוב להסיר את PBS, להוסיף 0.5 מ"ג / מ"ל dispase (מחומם מראש ל -37 ° C) עם טפטפת, לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  5. שוטפים את התאים עם PBS על ידי הוספת 2 מ"ל של PBS לכל היטב aspirating לאחר מכן. הוסף 1 מ"ל של CM לכל היטב באופן ידני לגרד את התאים לתוך גושים קטנים באמצעות קצה פיפטה 5 מ"ל.
  6. פלייט גוש תאים מושעה לתוך צלחות מטריקס מצופית תאיות חדשות; התאים צריכים לדבוק לאחר 24 שעות.

בידול 3. hESCs שימוש BMP4 / A / P

הכן את מדיום הבידול. השתמש CM (חסר B-FGF) ולהוסיף (טרי) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 מיקרומטר), ו PD173074 (0.1 מיקרומטר). להוסיף מעכבים אלה אל CM לפני השימוש.
השתמש hESCs מזין ללא גדל על צלחות מצופות תאי מטריקס עבור 1 מעבר, בתרבית בתוך להגדיר באינקובטור ב חמצן 4%. לאחר המעבר הראשון לצלחות מצופות תאי מטריקס,בואו התאים לצרף למשך 24 שעות. למחרת, ליזום בידול. הסר את CM (המכיל B-FGF) ולהחליפו CM המכיל BMP4 / A / P (2 מ"ל לכל היטב צלחת 6-היטב). המשך culturing התאים באמצעות רמות חמצן 4%.
החזר את CM המכיל BMP4 / A / P (2 מיליליטר / גם צלחת 6-היטב) כל 2 ימים. לשאוב להסיר את המדיום הישן ולהוסיף CM חדש בעזרת פיפטה. ביום השני לאחר הוספת BMP4 והסרת B-FGF (יום בידול נחשב 2), מורפולוגיה התא תשתנה, המופיעה גדול יותר כאשר נצפה באמצעות מיקרוסקופ.
הערה: מובחן תאים, אשר תערוכה וקצוות מעוגלים בהירים, לא יהיו נוכחים.
איסוף תאים בזמן נקודות רצויות. תאים מובחנים יפסיקו חלוקה לאחר כ -2 שבועות. תאי Transfect במהלך פרק זמן זה (עיין בסעיף הבא).

4. Transfection של תאים Trophoblastic עם siRNAs או DNA פלסמיד

כן תאי trophoblastic עבור transfection
1. hESCs תרבות עבור שתי פסקאות על תאי מטריקס לאחר העברתם מן MEFs (ראה שלב 2.2). השתמש בינוני hESC המכיל B-FGF.
2. פיצול hESCs על יום אחד צלחת מטריקס חדש לפני בידול. confluency הסלולר הגבוה הוא חשוב, כל כך לפצל את התאים 1: 1 לצלחת חדשה / טוב, אשר יבטיח לפחות 50% confluency למחרת. דגירת תאי הלילה בחממה דל בחמצן.
  הערה: hESCs לא צריך לספור במהלך שלב זה.
3. למחרת, להחליף את מדיום עם בינוני בידול (CM המכיל BMP4 / A / P וחסרי B-FGF, באמצעות 2 מ"ל / גם צלחת 6-היטב). הסר את המדיום הישן על ידי שאיפה ולהעביר את המדיום החדש (2 מ"ל) בעזרת פיפטה. מניח את תאי חממה דל בחמצן (חמצן 4%) הלילה.
Transfections באמצעות siRNAs עבור שיבוש גנטי או באמצעות פלסמיד דנ"א
1. להבדיל בין התאים עד הזמן- הרצוילנקודה (בין בימים 1 ו -14). יום לפני transfection, trypsinize התאים באמצעות טריפסין 0.05% במשך 5 דקות. פלייט אותם confluency הרצוי (בהתאם לפרוטוקול מגיב transfection) לצלחת ג'לטין מצופה (להוסיף ג'לטין 0.1% לצלחת בתרבית רקמה למשך 20 דקות לשאוב להסיר). להוסיף CM המכיל BMP4 / A / P (חסר B-FGF) דגירה לילה.
2. למחרת, להוסיף בינוני בידול טרי אל התאים. Transfect siRNAs באמצעות מגיב transfection siRNA. עבור DNA פלסמיד, השתמש מגיב lipofectamine מתאים.
3. פעל על פי פרוטוקול המוצר כמתואר לכל מגיב transfection. מעביר את מתחמי lipofectamine siRNA היטב כל / צלחת של תאים, ומערבבים בעדינות, ותרבות תאי לילה חממה דל בחמצן.
  הערה: חלק ריאגנטים transfection מעוכבים על ידי אנטיביוטיקה, אשר דורשת CM חסר פן / סטרפטוקוקוס.
4. למחרת, להחליף עם תקשורת בידול טריה.
5. קציר התאים על הרצוןבזמן נקודות ד (למשל, 24 שעות, 48 שעות, ו -72 שעות) כדי לבדוק את היעילות שיבוש גנטי באמצעות RT-PCR כמותי. עבור תאים קציר, השתמש טריפסין 0.05%, הוספת 1 מ"ל לכל היטב דוגרים במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 5 מ"ל של מדיום MEF לכל היטב כדי לנטרל את טריפסין. ספין למטה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות ולהשתמש התא גלולה עבור בידוד RNA.

זיהום פתוגן 5. של תאים Trophoblastic: זיהום ויראלי סנדאי

כן hESCs לבידול
1. hESCs תרבות עבור שתי פסקאות על תאי מטריקס לאחר ההעברה מן MEFs (ראה שלב 2.2). השתמש בינוני hESC המכיל B-FGF.
2. פיצול hESCs על יום אחד צלחת מטריקס חדש לפני בידול. confluency הסלולר הגבוה הוא חשובים, כך פיצול תאים 1: 1 לצלחת חדשה / טוב, אשר תבטיח לפחות 50% confluency למחרת. דגירת תאי לילה חממה דל בחמצן (חמצן 4%).
  הערה: hESCs לא צריך לספור במהלך שלב זה.
3. למחרת, להחליף את המדיום עם בינוני הבידול (CM המכיל BMP4 / A / P וחסר B-FGF) ותרבות לילה חממה דל בחמצן (4% חמצן).
זיהום ויראלי סנדאי של תאים trophoblastic
1. יום אחד לפני יום בידול הרצוי, trypsinize התאים המבדילים (תאים בודדים) באמצעות 0.05% טריפסין במשך 5 דקות ולהעבירם צלחת ג'לטין מצופה. הוסף בינוני בידול דגירת לילה חממה דל בחמצן.
2. למחרת, להוסיף בינוני עבור זיהום (זה ישתנה בהתאם הנגיף). השתמש CM חסר פן / סטרפטוקוקוס המכיל BMP4 / A / P, באמצעות 0.5 מ"ל עבור אחד טוב של צלחת 6 באר. להוסיף וירוס סנדאי עבור משרד פנים = 1. דגירה עבור 8 שעות בתוך חממה דל בחמצן.
3. אם-מועד לפי שעון נוסף נחוצים, להסיר את המדיום המכיל וירוס לאחר 4 שעות ולהחליפה BMP4 / A / P CM. איסוף תאיםעבור בידוד RNA באמצעות מגרד תא.
4. לקבוע את היעילות של זיהום ויראלי על ידי ביצוע qRT-PCR עבור גנים המעורבים בתגובה ויראלי ^18.

תוצאות

סקירה כללית של במבחנה בידול של hPSCs

פרוטוקול בידול במבחנה זה מתחיל עם hESCs מובחן גדל על MEFs אשר יועבר אל מזין ללא תנאים למעבר אחד (איור 1 א). בעוד תיארנו את הבידול של hESCs בפרוטוקול זה,...

Discussion

הצגנו את הצעדים הבסיסיים המבדילים hESCs לתוך אבות trophoblast. פרוטוקול זה ממוטב לאחרונה להבדיל hESCs במהירות בתוספת Activin / קטרי איתות מעכבים, הגדלת הבידול לתאי trophoblastic והימנעות ההדורה של אבות mesoderm, אשר הם נצפו בדרך כלל עם טיפול BMP4 לבד. מערכת מודל BMP4 מאפשרת לבחינה בשלבים המוקדמי?...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Knock Out Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamine	Invitrogen	10828-028
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispase	Invitrogen	17105-041
Collagenase Type IV	Invitrogen	17104-019
Rock inhibitor Y27632	Calbiochem	688000
Irradiated CF1 MEFs	GlobalStem	6001G	MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 µm syringe filter	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubator	Heracell/VWR	89187-192	Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4	R&D Systems	314-BP-01M
A 83-01	R&D Systems	2939/10
PD173074	R&D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.

References

Rugg-Gunn, P. J. Epigenetic features of the mouse trophoblast. Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).
Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?. Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
Cole, L. A. Hyperglycosylated hCG, a review. Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).
Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

121 trophoblastic Morphogenic 4 Activin

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: