In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

Résumé

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Résumé

Le placenta est le premier organe à développer au cours de l'embryogenèse et est nécessaire pour la survie de l'embryon en développement. Le placenta est composé de différentes cellules trophoblastiques qui se différencient à partir des cellules du trophectoderme extra-embryonnaire du blastocyste préimplantatoire. En tant que tel, notre compréhension des événements de différenciation précoce du placenta humain est limitée en raison des restrictions éthiques et juridiques sur l'isolement et la manipulation de l'embryogenèse humaine. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) sont un système modèle robuste pour enquêter sur le développement humain et peuvent également être différenciées in vitro en cellules trophoblastiques qui expriment des marqueurs des différents types de cellules trophoblastiques. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour différencier hPSCs dans les cellules trophoblastiques en utilisant la protéine morphogénétique osseuse 4 et inhibiteurs des activine / voies de signalisation Nodal. Ce protocole génère divers types de cellules trophoblastiques qui peuvent être transfectées avec des ARNsipour enquêter sur les phénotypes de perte de fonction ou peuvent être infectés par des agents pathogènes. En outre, hPSCs peuvent être génétiquement modifiés puis différenciées en progéniteurs trophoblaste pour les analyses de gain de fonction. Cette méthode in vitro de différenciation pour générer trophoblastes humains à partir de hPSCs surmonte les restrictions éthiques et juridiques de travailler avec des embryons humains précoces, et ce système peut être utilisé pour une variété d'applications, y compris la découverte de médicaments et les cellules souches.

Introduction

Le placenta est nécessaire pour la croissance et la survie du fœtus pendant la grossesse et facilite l'échange de gaz, des nutriments, des déchets et des hormones entre la circulation maternelle et fœtale. Le premier organe formé au cours de l' embryogenèse chez les mammifères est le placenta, qui commence à développer 6-7 jours après la conception chez l' homme et chez la souris 3,5-4,5 jours ^{1, 2, 3, 4.} les cellules sont des cellules trophoblastiques les plus importantes du placenta, et ces cellules représentent l'un des événements les plus précoces de la différenciation de la lignée de l'embryon de mammifère. Elles proviennent des cellules du trophectoderme extra-embryonnaires externes du blastocyste préimplantatoire. Notre connaissance des premiers stades du développement placentaire est limitée par les restrictions éthiques et logistiques sur la modélisation du développement humain précoce.

Au cours de l'implantation embryonnaire, trophoblastesenvahir l'épithélium maternelle et se différencier en cellules progénitrices spécialisés ^5. Cytotrophoblastes (CTBS) sont mononucléées, progéniteurs indifférenciés qui fusionnent et se différencient en syncytiotrophoblastes (SYN) et trophoblastes invasives extravilleux (de EVTS), qui ancre le placenta à l'utérus. SYNs sont multinucléées, les cellules différenciées qui synthétisent les hormones nécessaires au maintien de la grossesse. Les événements de différenciation précoce qui génèrent EVTS et SYNs sont essentiels pour la formation du placenta, comme les déficiences dans les cellules trophoblastiques aboutissent à une fausse couche, la pré-éclampsie, et la restriction de croissance intra - utérine ^1. Les types de lignées cellulaires trophoblastiques humaines qui ont été développées comprennent immortalisés CTBS et choriocarcinome, qui produisent des hormones placentaires et présentent des propriétés invasives ^6. cellules trophoblastiques primaires de placentas premier trimestre humains peuvent être isolés, mais les cellules rapidement differentiate et arrêter la prolifération in vitro. Surtout, transformé et des lignées de cellules primaires ont des profils d'expression de gènes différents, ce qui indique que les lignées cellulaires tumorigènes et immortalisés trophoblaste peuvent ne pas représenter exactement les trophoblastes principaux ^7. En outre, ces lignes ne sont pas susceptibles de ressembler à trophoblaste placentaire progéniteurs des cellules souches parce qu'ils sont dérivés de stade plus avancé d'abord par le troisième trimestre.

Il y a un besoin pour un robuste système de culture in vitro de stade précoce trophoblastes humains afin d'étudier les événements précoces de la formation et de la fonction placentaire. cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), qui partagent les propriétés avec la masse cellulaire interne de l'embryon préimplantatoire, sont fréquemment utilisés pour modéliser le développement humain précoce, y compris la formation du début du placenta. Les deux cellules d'origine humaine souches pluripotentes (de hiPSCs) et CSEh peuvent être différenciées en trophoblaste in vitro utilisant des os MorLa protéine phogenic 4 (BMP4) , ^{8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.} Cette conversion des cellules pluripotentes à des cellules trophoblastiques utilisant BMP4 est spécifique pour les cellules humaines et est largement utilisé pour étudier le développement du placenta humain tôt , car il ne nécessite pas l' accès à des embryons humains précoces ^{9, 16.} Récemment, on a découvert que l'addition des inhibiteurs A83-01 (A) et PD173074 (P), qui bloquent les voies SMAD2 / 3 et MEK1 / 2 signalisation, augmente l'efficacité de la différenciation des progéniteurs dans HPSC trophectoderme analogue, principalement SYNs et EVTS, sans la génération étendue de mésoderme, endoderme, ectoderme ou des cellules ^{9, 17} . En utilisant ces conditions moyennes, hESC différenciées pendant 12 jours ont des profils d'expression génique similaire à des cellules du trophectoderme isolées à partir d' embryons blastocyste stade humain et sécrètent diverses hormones de croissance placentaire spécifique, en soutenant la validité de ce système in vitro du modèle ^{9, 11.} Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la différenciation des hPSCs in vitro dans les progéniteurs trophoblastiques humaines en utilisant BMP4 / A / P milieu de culture. Ces conditions produisent des nombres de cellules abondantes pour une grande variété d'applications, y compris le séquençage de l'ARN, de disruption de gène en utilisant des ARNsi, des infections pathogènes, et la modification génétique en utilisant la transfection à médiation par lipofection.

Protocole

NOTE: Pour la différenciation des CSEh soit ou hiPSCs en progéniteurs trophoblaste, hPSCs cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) sont transition vers feeder libres conditions pour deux passages avant d'initier la différenciation avec BMP4 / A / P. Ce processus élimine la contamination MEF de cellules différenciées. Ici, nous présentons un protocole pour la différenciation des CSEh, et le même protocole peut être appliqué à hiPSCs.

1. Culture et récupération des CSEh sur irradiées fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) (Préparation)

1. Gamma-irradiation de MEFs
   1. Faire 500 ml de milieu pour la culture des FAE: DMEM avec 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, 1 x pénicilline / streptomycine (Pen / Strep) et 0,1 mM d'acides aminés non essentiels (NEAA).
   2. Décongelez un flacon de MEFs primaires et utiliser milieu MEF pour la culture des cellules. Développez les MEFs primaires à 30 plaques à l'aide de milieu de culture MEF.
      NOTE: Les concentrations d'oxygène ne sont pas critiques pour cette étape, de sortesoit des conditions physiologiques (4%) ou ambiant (20%) au sein de l'incubateur peuvent être utilisés.
   3. Récolter les MEFS. En utilisant 0,25% de trypsine pour éliminer les MEFs des plaques et transférer les cellules dans un tube conique. Placez les MEF en un instrument d'irradiation et d'exposer les cellules à 3500 grays.
      NOTE: La quantité de temps dépendra de l'activité de la source à l'intérieur de l'unité de irradiateur.
   4. Resuspendre les MEFs irradiés avec un milieu de culture MEF et compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre.
   5. Pellet les MEF utilisant une centrifugeuse et ajouter 50% du milieu de culture MEF et 50% cellule milieu de congélation (80% de FBS et 20% de milieu de culture MEF). Aliquote de 1 x 10 ⁶ cellules par flacon.
   6. Placer les flacons MEF irradiées dans un -80 ° C congélateur pendant une nuit, puis de les transférer à l'azote liquide pour le stockage à long terme.
2. Dégel MEFs congelés et CSEh pour la culture
   1. Faire 500 ml de milieu hESC: DMEM / F-12 avec 20% de sérum Replacement mM, 0,1 NEAA, 2 mM de L-glutamine, de 10 ng / ml de bFGF, 0,1 mM de ß-mercaptoéthanol et 1 x Pen / Strep.
   2. Décongelez un flacon de MEFs un jour avant décongélation des CSEh. Enduire une plaque à 6 puits avec 0,1% de gélatine, en utilisant 1 ml pour chaque puits. Incuber pendant au moins 20 min à température ambiante, puis retirez la gélatine.
   3. Retirer un flacon de MEFs de stockage dans l'azote liquide et immerger le flacon dans un bain d'eau C 37 °. Regardez le flacon par intermittence jusqu'à ce que de petits cristaux de glace restent. transférer rapidement le contenu du flacon à 9 ml de milieu FAE dans un tube conique de 15 ml.
   4. Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans un milieu MEF. Aliquoter la FAE uniformément sur une plaque de 6 puits. Mettre la plaque dans un 37 ° C faible teneur en oxygène (4%) incubateur pendant une nuit.
3. La culture de routine de CSEh sur MEFs
   1. Retirer un flacon de CSEh à partir de l'azote liquide et décongeler rapidement le flacon en utilisant un 37 ° C bain d'eau. pipette doucement les CSEh dans un tube conique de 15 ml contenant 9 ml de milieu CSEh et centrifuger à 200 xg pendant 5 min. Retirez le moyen et remettre les cellules avec 1 ml de milieu CSEh.
   2. Aspirer le milieu MEF de la plaque préparée à l'étape 1.2.4 et ajouter 1 ml de milieu CSEh. Ajouter inhibiteur Rock Y-27632 (10 uM) au milieu CSEh. Transférer les CSEh sur MEF.
   3. Placer les cellules dans un 37 ° C faible teneur en oxygène (4%) incubateur pendant une nuit. Remplacez le support CSEh quotidien. Grattez cellules différenciées avec une pipette Pasteur, visualisés sous un microscope droit à 4X.
   4. Passage des hESC tous les 4-6 jours, en fonction de la confluence cellulaire et la taille des colonies hESC. Préparer une plaque de MEFs la veille repiquage. Lorsque les cellules sont prêtes au passage, éliminer le milieu CSEh et laver le puits avec 1 ml de PBS.
   5. Ajouter 1 mg / ml de collagénase (préchauffé à 37 ° C), incuber à 37 ° C pendant 5 min, puis retirez le collagénase. Wcendres les cellules avec du PBS, ajouter 1 ml de milieu CSEh par puits, et gratter manuellement les cellules en petits bouquets en utilisant la pointe d'un pipette de 5 ml. Transférer les amas de cellules en suspension dans un puits (s) nouvelle MEF-enduit.

2. Transition de CSEh à partir de MEFs Feeder-Free sur plaques Matrice Extracellulaire enduites

1. Préparer MEF milieu conditionné (CM)
   1. Plate les MEFs irradiées dans un flacon T75 à 90-100% de confluence; il est important que les MEF sont densément plaquées. Observer les cellules en utilisant un microscope pour déterminer si elles ont fixé au fond du flacon (FAE fixent environ 6 heures après le placage ou le jour suivant).
      REMARQUE: les cellules seules flottent dans le milieu lorsqu'il est observé à l'aide d'un microscope. Le lendemain, retirez moyen MEF et ajouter 25 ml de milieu CSEh manquant B-FGF.
   2. Recueillir le milieu conditionné après 24 heures d'incubation. Remplacez-le par du milieu frais par jour pendant un maximum de 12 jours.
   3. Filtrer le CM collecté en utilisant un filtre de 0,22 pm. Avant d'utiliser, ajouter frais B-FGF au CM.
      NOTE: CM peut être congelé à -80 ° C et stocké pendant 1 an. Vous pouvez également stocker le CM à 4 ° C pendant 2 semaines.
2. Transition des CSEh à partir de la culture sur les MEF pour des liaisons de connexion des plaques de matrice extracellulaire revêtu.
   1. Préparation de la matrice extracellulaire pour des plaques de culture tissulaire de revêtement
      1. Décongeler une aliquote de la matrice extracellulaire sur la glace (environ 3-4 h). En utilisant des pointes glacées, un 50 ml tube conique à froid, et du milieu DMEM / F12, transfert 2 mg de la matrice extracellulaire dans 24 ml de glace-froid DMEM / F-12 (la dilution dépend de la concentration de la matrice extracellulaire du fournisseur ).
      2. Transférer immédiatement les 50 ml tube conique à la glace et le stocker à 4 ° C. Pour les plaques de culture de tissu de revêtement, ajouter la quantité appropriée de la matrice extracellulaire diluée au bien (par exemple, 1 ml par puits dans une plaque de 6 puits). Agiter pour recouvrir la plaque et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h.
   2. CSEh Passage des MEF (comme dans l'étape 1.3) en utilisant CM contenant B-FGF (10 ng / ml).
      1. Aspirer pour éliminer la matrice extracellulaire de la nouvelle plaque et ajouter CM contenant B-FGF. Transférer les amas cellulaires grattées de la plaque MEF utilisant une pipette et aliquoter dans la plaque de matrice extracellulaire revêtue. Incuber dans le 37 ° C incubateur faible teneur en oxygène pendant la nuit.
      2. Remplacer le CM avec un milieu de B-FGF quotidienne; la quantité de milieu dépend de la taille du flacon de culture. Utilisez 2 ml de milieu pour une 6 puits bien. Grattez cellules différenciées avec une pipette Pasteur.
      3. CSEh Passage tous les 6-7 jours, lorsque les colonies sont lumineuses lorsqu'il est vu sous le microscope.
         NOTE: colonies CSEh cultivées sur des plaques de matrice extracellulaire revêtues sont plus grandes que les cellules MEF-cultivées.
      4. Lorsque les cellules nourricières libre-sont prêts à passage, éliminer le milieu, laver par l'annonceurding 1 ml de PBS à l'aide d'une pipette, aspirer pour éliminer le PBS, ajouter 0,5 mg / ml de dispase (préchauffée à 37 ° C) avec une pipette et on incube à 37 ° C pendant 5 min.
      5. Laver les cellules avec du PBS par addition de 2 ml de PBS par puits et en aspirant ensuite. Ajouter 1 ml de CM par puits et gratter manuellement les cellules en petits bouquets en utilisant la pointe d'un pipette de 5 ml.
      6. Plate les amas de cellules en suspension dans de nouvelles plaques de matrice extracellulaire revêtu; les cellules devraient adhérer après 24 h.

3. Différenciation des CSEh Utilisation BMP4 / A / P

1. Préparer le milieu de différenciation. CM utilisation (absence de FGF-B) et ajouter (fraîche) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 uM) et PD173074 (0,1 M). Ajouter ces inhibiteurs au CM avant utilisation.
2. Utilisez CSEh sans alimentation en croissance sur des plaques de matrice extracellulaire revêtu pour 1 passage, cultivées à l'intérieur d'un incubateur fixé à 4% d'oxygène. Après le premier passage sur des plaques de matrice extracellulaire revêtu,laisser les cellules se fixent pendant 24 heures. Le lendemain, initier la différenciation. Retirez le CM (contenant B-FGF) et le remplacer par CM contenant BMP4 / A / P (2 ml par puits dans une plaque de 6 puits). Continuer la mise en culture des cellules en utilisant des niveaux d'oxygène 4%.
3. Remplacer le CM contenant BMP4 / A / P (2 ml / puits pour une plaque de 6 puits) tous les 2 jours. Aspirer pour enlever l'ancien milieu et ajouter un nouveau CM à l'aide d'une pipette. Le deuxième jour après l'ajout et la suppression BMP4 B-FGF (considéré comme le jour de différenciation 2), la morphologie cellulaire change, apparaissant plus grande lorsqu'elle est observée en utilisant un microscope.
   NOTE: les cellules non différencié, qui présentent des bords ronds lumineux, ne seront pas présents.
4. Recueillir les cellules à points de temps souhaités. Les cellules différenciées vont arrêter de se diviser après environ 2 semaines. cellules transfecter au cours de cette période de temps (voir la section suivante).

4. Transfection de cellules trophoblastiques avec siRNA ou l'ADN plasmidique

1. Préparer les cellules trophoblastiques pour la transfection
   1. CSEh de culture pour deux passages sur la matrice extracellulaire après leur transfert des MEF (voir l'étape 2.2). Utiliser le milieu CSEh contenant B-FGF.
   2. Divisez les CSEh sur une nouvelle plaque de matrice extracellulaire un jour avant la différenciation. Haute confluence cellulaire est important, donc diviser les cellules 1: 1 sur une nouvelle plaque / puits, qui assurera au moins 50% de confluence le lendemain. Incuber les cellules pendant la nuit dans l'incubateur faible teneur en oxygène.
      NOTE: Les CSEh ne doivent pas être pris en compte lors de cette étape.
   3. Le lendemain, remplacer le milieu par le milieu de différenciation (CM contenant BMP4 / A / P et manquant B-FGF, en utilisant 2 ml / puits pour une plaque de 6 puits). Retirer l'ancien milieu par aspiration et transférer le nouveau support (2 ml) à l'aide d'une pipette. Placer les cellules dans un incubateur à faible teneur en oxygène (4% d'oxygène) pendant une nuit.
2. Transfections utilisant des ARNsi de perturbation du gène ou à l' aide de l' ADN plasmidique
   1. Différencier les cellules jusqu'à ce que le Time- désirépoint (entre les jours 1 et 14). Le jour avant la transfection, Trypsiniser les cellules en utilisant 0,05% de trypsine pendant 5 min. Plate-les à la confluence souhaitée (selon le protocole de réactif de transfection) sur une plaque de gélatine, enrobées (ajout de 0,1% de gélatine à une plaque de culture tissulaire pendant 20 min, et aspirer à enlever). Ajouter CM contenant BMP4 / A / P (manquant B-FGF) et incuber pendant la nuit.
   2. Le jour suivant, ajouter un milieu de différenciation dans les cellules fraîches. Transfecter ARNsi en utilisant un réactif de transfection ARNsi. Pour l'ADN de plasmide, en utilisant un réactif lipofectamine approprié.
   3. Suivre le protocole du produit comme décrit pour chaque réactif de transfection. Transférez les complexes de siRNA-lipofectamine à chaque puits / plaque de cellules, mélanger doucement, et la culture des cellules pendant la nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène.
      NOTE: Certains réactifs de transfection sont inhibées par des antibiotiques, qui exigent CM manque Pen / Strep.
   4. Le lendemain, le remplacer par les médias de différenciation frais.
   5. Récolter les cellules au désird points de temps (par exemple, 24 h, 48 h et 72 h) pour vérifier l'efficacité de la perturbation des gènes en utilisant RT-PCR quantitative. Pour la récolte de cellules, utilisez 0,05% de trypsine, en ajoutant 1 ml par puits et incubation pendant 5 min à 37 ° C. Ajouter 5 ml de milieu MEF par puits pour neutraliser la trypsine. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min et en utilisant le culot cellulaire pour l'isolement de l'ARN.

5. Pathogen Infection des cellules trophoblastiques: Infection virale Sendai

1. Préparer CSEh de différenciation
   1. CSEh de culture pour deux passages sur la matrice extracellulaire après le transfert des MEF (voir l'étape 2.2). Utiliser le milieu CSEh contenant B-FGF.
   2. Divisez les CSEh sur une nouvelle plaque de matrice extracellulaire un jour avant la différenciation. Haute confluence cellulaire est des cellules importantes, alors fendues 1: 1 sur une nouvelle plaque / puits, qui assurera au moins 50% de confluence le lendemain. Incuber les cellules pendant une nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène (4% d'oxygène).
      NOTE: CSEh ne doivent pas être pris en compte lors de cette étape.
   3. Le jour suivant, remplacer le milieu par le milieu de différenciation (CM contenant BMP4 / A / P et B dépourvu FGF) et de la culture pendant une nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène (4% d'oxygène).
2. Sendai infection virale des cellules trophoblastiques
   1. Un jour avant le jour de différenciation souhaitée, trypsiniser les cellules différenciées (à cellules individuelles) en utilisant 0,05% de trypsine pendant 5 min et les transférer sur une plaque revêtu de gélatine. Ajouter milieu de différenciation et incuber pendant la nuit dans un incubateur à faible teneur en oxygène.
   2. Le jour suivant, ajouter du milieu d'infection (cela peut varier en fonction du virus). Utiliser CM manque Pen / Strep contenant BMP4 / A / P, en utilisant 0,5 ml pour un puits d'une plaque à 6 puits. Ajouter le virus Sendai pour MOI = 1. Incuber pendant 8 heures dans un incubateur à faible teneur en oxygène.
   3. Si le temps des points supplémentaires sont nécessaires, éliminer le milieu contenant le virus après 4 h et le remplacer par BMP4 / A / P CM. Recueillir les cellulespour l'isolement d'ARN en utilisant un grattoir à cellules.
   4. Déterminer l'efficacité de l' infection virale en effectuant qRT-PCR pour les gènes impliqués dans la réponse virale ^18.

Résultats

Vue d'ensemble de différenciation in vitro de hPSCs

Ce protocole de différenciation in vitro de cellules hES non différenciées commence cultivées sur MEFs qui sont passés à feeder libres conditions pour un passage (figure 1A). Alors que nous avons décrit la différenciation des CSEh dans ce protocole, nous avons utilisé ce protocole pour différencier avec succès hiPSCs dans les ce...

Discussion

Nous avons présenté les étapes de base pour différencier les CSEh en progéniteurs trophoblaste. Ce protocole a récemment été optimisé pour différencier rapidement hESC avec l'addition d'inhibiteurs de l'activine / signalisation Nodal, en augmentant la différenciation des cellules trophoblastiques et en évitant la production de progéniteurs de mésoderme, qui sont généralement observés avec le traitement de la BMP4 seul. Le système de modèle de BMP4 permet l'examen des premiers stades de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Knock Out Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamine	Invitrogen	10828-028
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispase	Invitrogen	17105-041
Collagenase Type IV	Invitrogen	17104-019
Rock inhibitor Y27632	Calbiochem	688000
Irradiated CF1 MEFs	GlobalStem	6001G	MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 µm syringe filter	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubator	Heracell/VWR	89187-192	Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4	R&D Systems	314-BP-01M
A 83-01	R&D Systems	2939/10
PD173074	R&D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.